Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om stamcelkolonies op hydrogels te verkreeden met volledige controle over zowel de stijfheid van de hydrogel als de geometrie van de kolonies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om stamcelkolonies te verkreeden in omstandigheden die de fysiologische omgeving beter nabootsen dan weefselcultuurplastic. Wanneer u dit protocol voor de eerste keer uitvoert, moet u een paar extra van elk materiaal genereren en een fluorescerende ligand gebruiken, zodat u bij elke stap problemen oplossen en optimaliseren.

Deze techniek omvat meerdere stappen die de precieze positionering van verschillende materialen te betrekken. Het is veel gemakkelijker om de schriftelijke instructies voor dit protocol te begrijpen als je eenmaal hebt gezien uitgevoerd. Om deze procedure te beginnen, meng PDMS-basis met PDMS-uithardingsmiddel bij een gewichtsverhouding van 10 tegen één en meng je grondig.

Ontgt dit mengsel in een desiccator gedurende 30 tot 60 minuten of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd. Giet het PDMS-mengsel langzaam en gelijkmatig over het oppervlak van de geprepareerde wafer. Tik op de schotel op het werkoppervlak om luchtbellen los te maken van het oppervlak van de wafer.

Bak de PDMS twee uur op 70 graden Celsius en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd vervolgens de PDMS in ongeveer 10 bij 10 millimeter vierkanten, elk met de functies voor een enkele experimentele aandoening. Deze zullen worden aangeduid als postzegels voor de rest van het protocol.

Meng hierna PDMS-basis met PDMS-uithardingsmiddel bij een verhouding van acht tot één per gewicht en meng grondig. Ontgt het mengsel in een desiccator gedurende 30 tot 60 minuten of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd. Giet vervolgens langzaam en gelijkmatig de PDMS in een schone schaal van 100 millimeter.

Tik op de schotel op het werkoppervlak om luchtbellen vrij te geven. Bak de PDMS twee uur op 70 graden Celsius en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd voor elke eerder gegenereerde stempel een vierkant van 15 bij 15 millimeter PDMS.

Deze zullen worden aangeduid als platte platen voor de rest van het protocol. Omkeert elke gegenereerde stempel op een platte plaat van PDMS zodanig dat de functies op de stand voor in contact met een platte plaat van PDMS. Druk voorzichtig op de bovenkant van de stempel met tangen om zelfs contact te garanderen.

Plaats vervolgens een kleine druppel UV-geneesbaar polymeer op de bovenste interface van elke stempel en plak paar. Het polymeer zal slecht zijn tussen de twee door oppervlaktespanning bijgestaan door de zwaartekracht. Plaats een kleine druppel van het UV-geneesbare polymeer rond de randen van de stempel en plaat interface.

Dit creëert een rand die de ligand oplossing zal houden. Plaats vervolgens zorgvuldig de stempel en klap paren in een UV-sterilisatie doos. Gebruik de steriele STR-vermogensinstelling en stel 10 minuten bloot.

Verwijder hierna de paren uit de UV-sterilisatiebox en gebruik twee paar tangen om de stempel voorzichtig te verwijderen terwijl u de platte plaat en het stencil ingedrukt houdt die uit het UV-geneesbare polymeer is gevormd. Verwijder het stencil voorzichtig met behulp van tangen en draai het zodanig om dat het oppervlak dat in contact komt met de platte plaat van PDMS naar boven gericht is. Plaats de omgekeerde stencils terug in de UV-sterilisatiebox.

Gebruik de steriele STR-vermogensinstelling en stel drie minuten bloot. Met behulp van tangen, zorgvuldig geplaatst elke stencil platte kant naar beneden op een zuur gewassen coverslip ervoor te zorgen dat de functies zijn gecentreerd op de cover slip. Plaats een klein stukje laboratoriumfilm bovenop elk stencil.

Druk stevig en gelijkmatig op het stencil om sterk contact te creëren tussen het stencil en de coverslip. Leg de afdeksels met stencils in een schaal. Plaats deze schotel in een plasmareiniger en breng 30 seconden hoog vermogensplasma aan.

Vervolgens pipet de ligand oplossing op het oppervlak van elk stencil. Voor stencils gemaakt van 10 bij 10 millimeter vierkante stempels, van toepassing 100 microliters per stencil. Daarna wikkel je de schotel met de hoesjes in laboratoriumfilm en broed je 's nachts uit op vier graden Celsius.

Eerst was de coverslip met stencil met behulp van tangen om het kort onder te dompelen in een schaal met steriele PBS. Dompel de coverslip met stencil onder in een tweede fase van PBS om het opnieuw te wassen. Verwijder het stencil van het oppervlak van de coverslip wordt voorzichtig om niet te breken de coverslip.

Vervolgens, kort dompel de coverslip in een schotel met ultrazuiver water om zouten te verwijderen uit de PBS wast. Raak de rand van de coverslip aan een delicate taak af te vegen om overtollig water weg te voeren. Droog de afdekking onder een inert gas zoals stikstof.

Bereid vervolgens een polyacrylamideoplossing voor om de gewenste hydrogelelasticiteit te verkrijgen. Voor elke patroon coverslip, bereiden een glutaraldehyde geactiveerde bodemdeksels lip met een spacer geplaatst op de top. Pipet tussen 75 en 150 microliters polyacrylamide oplossing naar het centrum van elke glutaraldehyde geactiveerde coverslip.

Plaats met behulp van tangen een patroon te dekken slip op elke glutaraldehyde geactiveerde covers slip met polyacrylamide en spacer zodanig dat de patroon ligand gezichten van de polyacrylamide oplossing. Plaats elke polyacrylamide sandwich voorzichtig in een dophouder met draden die compatibel zijn met 15 milliliter conische bodembuizen. Schroef een 15 milliliter conische onderbuis in elke dophouder om de polyacrylamide sandwiches op zijn plaats te houden.

Centrifuge tot polyacrylamide sandwiches in de buizen in swing emmers op 200 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Haal de buizen uit de centrifuge en leg ze in buisrekken om de oriëntatie nog 50 minuten te behouden om volledige polymerisatie te garanderen. Verwijder vervolgens de broodjes uit de buizen en dompel ze onder in PBS.

Wikkel de schotel in laboratoriumfilm en broed bij kamertemperatuur gedurende drie uur of bij vier graden Celsius 's nachts. Gebruik hierna een scalpel en tangen om het patroon zorgvuldig te verwijderen om slips en de afstandsschots van de polyacrylamide sandwich te bedekken terwijl het onder water blijft in PBS. Plaats elke coverslip met gedeseerd polyacrylamide in een dophouder.

Plaats van pakking op de top van de cover slip en rond de polyacrylamide waar de spacer zich bevond. Schroef een afgezaagde 15 millimeter conische onderbuis in de dophouder, die een put vormt met de gedessineerde polyacrylamide aan de onderkant. Deze samenstellingen passen in de putten van een standaard 12 putplaat voor eenvoudige bediening.

Gebruik bij het uitvoeren van deze techniek een fluorescerende ligand om ervoor te zorgen dat het gewenste patroon wordt gecreëerd op het oppervlak van de glazen afdekbrief en met succes wordt overgebracht naar het oppervlak van de polyacrylamide hydrogel tijdens polymerisatie. De ultieme maatstaf voor succes voor deze methode is het vermogen om hESCs te verkassen in de gewenste geometrieën op de gedessineerde hydrogels. Wanneer gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol, de hESCs meestal vermenigvuldigen om de patroon geometrieën te voltooien door 48 tot 72 uur zodra de Y27632 is volledig verwijderd uit de media.

Het kweken van hESC kolonies in beperkte geometrieën op polyacrylamide hydrogels maakt het mogelijk om celgegenereerde tractiekrachten te meten met behulp van tractiekracht microscopie. Deze metingen worden gedaan door fluorescentiemicrosferen in de hydrogel in te bedden en de posities van deze kralen voor en na het zaaien van hESCS te verbeelden. De afbeeldingen van de kraalposities kunnen worden gebruikt om kaarten van kraalverplaatsingen te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt om de onderliggende tractiespanningen te berekenen.

In cirkelvormige kolonies van hESCs, worden de grootste tractiespanningen gevonden dichtbij de rand van de kolonies, terwijl het centrum van de kolonies eenen en eens lage tractiespanningen vertonen. Ondanks de waargenomen niet-uniforme verdelingen van tractiespanningen, gekweekten hIC's als patrooncirkels in onderhoudsomstandigheden, vertonen uniforme expressie van de pluripotentiemarker 3/4 en celhechtingmolecuul E-cadherine. Deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om menselijke embryo's beter te modelleren met behulp van menselijke embryonale stamcellen, wat uiteindelijk leidt tot belangrijke inzichten in hoe mensen zich ontwikkelen.

Deze procedure kan worden aangepast voor elke toepassing waarbij een onderzoeker zich richt op het kweken van cellen in gedefinieerde geometrieën op zachte hydrogels. Deze procedure is compatibel met de meeste biochemische zuren, waardoor onderzoekers vragen kunnen beantwoorden over hoe dingen zoals weefselgeometrie en celgegenereerde krachten de eiwitexpressie en celsignalering beïnvloeden. Veel onderzoekers gebruiken nu menselijke embryonale stamcellen om vroege menselijke ontwikkeling te modelleren.

Deze techniek zal onderzoekers in staat stellen om deze belangrijke vragen te beantwoorden in omstandigheden die een fysiologische omgeving beter nabootsen.