Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Dit stapsgewijze protocol laat zien hoe de enzymatische activiteit van RING-type E3 ubiquitine ligas, zowel in vitro als in planta, kan worden gedetecteerd en functioneel kan worden gekenmerkt door een locatiegerichte mutagenesis-benadering. Door mutatie in een RING-domein te introduceren via site-directed mutagenesis, kan de resulterende E3-deficiënte mutant parallel met het wild-type eiwit worden getest om de enzymatische activiteit te koppelen aan functionaliteit. Het toewerken van de biochemische en mechanische basis van RING-type E3 ubiquitine ligasen kan sterk bijdragen aan ons begrip van hun biologische betekenis in ontwikkeling, stress signalering, en het onderhoud van homeostase.

Met een lichte wijziging van het in vivo expressiesysteem kan dit protocol worden toegepast op de analyse van elke RING-type E3 ligase, ongeacht de oorsprong ervan. Begin met het identificeren van de geconserveerde Cys en Zijn aminozuren in het RING-domein en het ontwerpen van primers die de substitutiecodon van belang dragen geflankeerd door 15 basisparen aan weerszijden van de mutatieplaats. Het is van cruciaal belang om het RING-domein goed te identificeren, met name de geconserveerde cysteïne en histidineresiduen.

Online tools zoals PROSITE kunnen hiervoor worden gebruikt. Gebruik de mutagene primers in PCR-versterking om de gewenste mutatie in het plasmide te introduceren die het gen van belang herbergt, om ervoor te zorgen dat een high-fidelity DNA polymerase gebruikt, zoals Pfu. Na PCR verteerbaar het dna van de E.coli-afgeleide methyïde en semi-gemethyleerde DNA door drie microliters van Dpnl-restrictieenzym direct toe te voegen aan de PCR-reactie en gedurende twee uur bij 37 graden Celsius uit te broeden.

Zuiver de gemutageniseerde plasmiden met een commerciële DNA-extractiekit en ontwijk het DNA in 50 microliter water. Transformeer vervolgens de DH5-alpha E.coli chemisch competente cellen met 0,5 microliter van het teruggewonnen gemutageniseerde plasmide DNA volgens het protocol van de fabrikant. Kloon de wild-type RING en gemuteerde RING genen van belang in de pMAL-c2 vector om deze genen te smelten met de MBP epitoop tag.

Stel vervolgens de in vitro alomtegenwoordigheidsreactie in een totaal volume van 30 microliters, zoals beschreven in het manuscript, en incuberen het mengsel op 30 graden Celsius gedurende twee uur. Beëindig de reactie door het monster te mengen met 7,5 microliter 5x SDS-PAGE laadbuffer en het vijf minuten te koken en vervolgens de eiwitten te scheiden met 7,5%SDS-polyacrylamide gel elektroforese. Breng over op het PVDF-membraan en detecteer de alomtegenwoordigheid met westerse blotting en anti-FLAG.

Bevlek het membraan met Coomassie blauw om de gelijke belasting van geteste MBP-RING-type eiwit te verifiëren. Streep de Agrobacterium tumefaciens stammen die de epitoop-tagged gen van belang op LB medium met de juiste selectie antibiotica. Na twee dagen van groei bij 28 graden Celsius, kies enkele kolonies, en groeien ze in LB vloeibaar medium met antibiotica op 28 graden Celsius en 250 rpm voor nog eens 24 uur.

Breng 100 microliters van agrobacteriële cultuur over naar drie milliliter verse LB met antibiotica en broed de cultuur nog eens vier tot zes uur uit. Draai de cellen op 1,800 keer g gedurende zes minuten, gooi de supernatant weg en verleg de cellen met drie milliliter wasbuffer. Herhaal de was twee keer, dan resuspend de cellen in de inductiebuffer, en uitbroed ze voor een extra 10 tot 12 uur bij 28 graden Celsius.

Na de incubatie, centrifugeren de cellen op 1, 800 keer g gedurende zes minuten, en gooi de supernatant. Resuspend de cellen met twee milliliter infiltratie buffer, en bepalen van de concentratie van bacteriën met behulp van de OD600 waarde. Agroinfiltrate vier weken oude Nicotiana benthamiana bladeren door zachtjes prikken ze met een naald, en met de hand injecteren Agrobacterium met een spuit, dan cirkel het geïnfiltreerde gebied met een marker.

Na 36 uur, verzamel het geïnfiltreerde bladweefsel en maal het tot een fijn poeder met vloeibare stikstof. Resuspend het weefselpoeder met 300 microliter eiwitextractiebuffer, en centrifugeren op 15.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een verse buis, voeg 5x SDS-PAGE laadbuffer toe aan een laatste concentratie van 1x en kook het monster gedurende vijf minuten.

Voer vervolgens westerse vlekkenanalyse uit om te detecteren in planta-alomtegenwoordigheid. Streep de juiste Agrobacterium tumefaciens stammen die gelabelde genen van belang of lege vector, en injecteren de Agrobacterium op Nicotiana benthamiana bladeren, zoals eerder beschreven. Voor de E3-afhankelijke substraat eiwitafbraak, volg de eerder beschreven protocol, en uit te voeren westerse blotting met de juiste antilichamen om eiwitophoping in plantencellen te detecteren.

Voor E3-afhankelijke overgevoelige respons-gemedieerde cel dood remming, monitor de agroinfiltrated bladeren voor celdood symptomen twee tot vier dagen na infiltratie. Een typische in vitro ubiquilinatie test uitkomst bevat een multiband uitstrijkje vanaf het moleculaire gewicht van het geteste eiwit en vordert naar boven. Zoals verwacht, negatieve controles ontbrekende afzonderlijke componenten of het gebruik van MBP niet aantonen van de besmeurde signaal.

Bovendien vertoonde de Coomassie blauwe kleuring van het PVDF-membraan een gelijke belasting van MBP-RHA1B of MBP in alle bedieningselementen. 11 verschillende E2's werden getest om te onderzoeken hoe in vitro alomtegenwoordigheid varieert afhankelijk van de specifieke E2-tot E3-combinatie. De gedetecteerde alomtegenwoordigheidsactiviteit varieerde van geen signaal tot een multibanduitstrijkje dat begint bij verschillende moleculaire gewichten, wat wijst op verschillende alomtegenwoordigheidspatronen.

De RING- en K-mutant versies van RHA1B werden getest op alomtegenwoordigheid in vitro en in planta. Het gebrek aan enzymatische activiteit van de RING-mutant versie wordt ondersteund door het onvermogen om ofwel een multiband uitstrijkje in vitro te genereren of poly-alomtegenwoordigheidssignaal in planta te bevorderen. Hoewel in vitro voor de K-mutant een marginaal zelfubilinsatiesignaal werd gedetecteerd, werd in planta alleen achtergrondalomatie gedetecteerd, wat suggereert dat het K146-residu ook essentieel is voor de E3-activiteit.

In tegenstelling tot de wild-type RHA1B, de RING mutant ontbreekt E3 ligase activiteit niet interfereren met overgevoelige reactie cel dood. Western blotting bevestigde dat de Gpa2 zich niet ophoopte in aanwezigheid van wild-type RHA1B, maar de RING mutant had geen invloed op de stabiliteit van eiwitten. Aangezien een goede E2-E3-combinatie noodzakelijk is voor de alomtegenwoordigheidsreactie, moeten in vitro alomtegenwoordigheidstesten parallel worden uitgevoerd met meerdere E2-enzymen die verschillende E2-klassen vertegenwoordigen om foutieve negatieve resultaten te voorkomen.

Een E3 ligase-deficiënte mutant vergemakkelijkt het testen van enzym-substraat interacties in vivo. Bovendien verleent deze mutant vaak een dominant negatief fenotype dat kan worden gebruikt in functionele knock-outstudies als alternatieve benadering van RNAi. Met behulp van dit protocol, is onlangs gebleken dat RHA1B nematode effector interfereren met het immuunsysteem van planten signalering in een E3-afhankelijke manier door zich te richten op de plant Gpa2 immunoreceptor voor ubiquitination en afbraak.