Het ontcijferen van de structurele effecten van het activeren van EGFR-somatische mutaties met moleculaire dynamicasimulatie

Moleculaire dynamische simulatie is een computationele techniek die kan worden gebruikt om moleculaire bewegingen te verkennen en kan conformatieveranderingen onthullen die cruciaal zijn voor het begrijpen van biochemische en cellulaire functie. Het is moeilijk om het bereik van dynamische bewegingen te onderzoeken die toegankelijk zijn voor een macromolecuul. Het gebruik van de resultaten van moleculaire dynamische simulaties in combinatie met experimentele gegevens maakt een beoordeling van hun functionele betekenis mogelijk.

We zullen met behulp van moleculaire dynamische simulaties aantonen hoe mutaties waargenomen bij kankerpatiënten EGFR-targetingbevestigingen en ligandbinding beïnvloeden. Als u de wild-type apo actieve EGFR onze kinase structuur voor te bereiden, open het Kymera visualisatieprogramma, en klik onder het bestand menu op ophalen door ID.Selecteer de Protein Data Bank database en geef de Protein Data Bank 2GS2 code. Om de ontbrekende structurele 2GS2-elementen te bouwen, verwerft u deze segmenten van andere EGFR-structuren.

Als u de vijf residuglutamaat 746 tot alanine 750 ELREA-verwijdering in EGFR wilt construeren, klikt u op favoriet, sequentie en toont u de reeks van het wildtype 2GS2. En klik in het resulterende volgordevenster op bewerken en voeg volgorde toe om de deletion mutant FASTA-indelingsreeks te selecteren. Selecteer in het uitlijningsvenster de structuur en het model of de homologie.

Geef in het pop-upvenster de samengestelde structuur 2GS2 op als de sjabloon en de mutantenvolgorde als de query die moet worden gemodelleerd en selecteer vervolgens een mutantsmodel uit de resulterende modellen op basis van de zDOPE-score en visuele inspectie. Om de wild-type apo inactieve EGFR kinase structuur voor te bereiden, open Protein Data Bank structuur 2GS7 en voeg de ontbrekende segmenten van de andere EGFR structuren, het modelleren van de verwijdering mutant vorm zoals aangetoond. Om de ATP-gebonden wild-type actieve EGFR kinase structuur voor te bereiden, gebruik eiwitgegevensbank structuur 2ITX als de principestructuur, het bouwen van de ontbrekende segmenten met behulp van andere EGFR structuren en het modelleren van de verwijdering mutant vorm met behulp van de modeler zoals aangetoond.

Als u de egsymmetrische dimerstructuur van het wilde type egr wilt construeren, opent u 2GS2 in Kymera en klikt u op gereedschappen, hogere orderstructuur en eenheidscel om de structuur om te zetten in de biologische assemblage die de activator en ontvanger kinases in de asymmetrische opstelling bevat. Selecteer de 2GS2-structuur en voer kopieën maken en selecteer vervolgens een enkel asymmetrisch dimer uit de meerdere kopieën van de dimer als gevolg van de symmetriebewerkingen. Om de alanine 702 valine mutant te bouwen, selecteer tools, structuurbewerking en rotamers om alanine 702 te vervangen door valine.

Open de structuren in Maestro en klik op de knop voor eiwitbereiding, selecteer vervolgens waterstofatomen toevoegen en vul ontbrekende zijkettingatomen in en klik op voorproces. Om de protonatietoestanden van ionizable residuen bij pH 7.0 te bepalen, klikt u op verfijnen en gebruikt propka om de oriëntatie van asperine, glutamine en histamineresiduen voor waterstofbinding te optimaliseren en vervolgens de structuur te minimaliseren. Om het simulatiesysteem op te zetten, opent u het LEAP-programma en importeert u het Amber FF14SB-krachtveld en tip3p-watermoleculen.

Voor de ATP-gebonden systemen importeert u parameters voor ATP en laadt u de structuur. Solvate de structuur in een octahedrale doos met expliciete TIP3P watermoleculen die 10 angstroms in alle richtingen uitbreidt van de oppervlakteatomen van het eiwit. Controleer het riemsysteem en voeg de nodige ionen toe om het te neutraliseren.

Om biomoleculaire systemen voldoende te modelleren, voegt u extra natrium- en chlorideatomen toe aan de simulatiebox om de zoutconcentratie van het systeem op 0,15 molar te brengen, vervolgens de topologie te genereren en op te slaan en bestanden van het systeem te coördineren om als input voor de daaropvolgende productiesimulatie te dienen. Met amber minimaliseert energie in eerste instantie het simulatiesysteem om ongunstige configuraties te omzeilen. Pas in het minimalisatie-invoerbestand de maximale cyclusvariabele voor de totale minimalisatiecyclus en het aantal cycli aan om het aantal cycli voor het steilste afdalingsalgoritme aan te geven.

Gebruik de variabele voor het beveiligingsgewicht om de beveiligingskracht toe te passen op de oplosatomen die zijn gespecificeerd door de parameter restraint mask. Voer de minimalisatie in meerdere stappen uit, geleidelijk verlagen van de terughoudendheid toegepast op de oplosatomen van 25 tot 0 kilocalorieën per mol angstrom vierkant, gebruik dan het commando om de minimalisatie uit te voeren. Verwarm het systeem voor 100 picoseconden van 0 tot 300 Kelvin en gebruik de commando's om een 10 kilocalorie molar per vierkant angstrom terughoudendheid op solute atomen.

Gebruik vervolgens het commando om de verwarming uit te voeren. Equilibrate het systeem voor 900 picoseconden onder een isothermale isobarische ensemble en zet een negen angstrom afstand cutoff voor lange afstand elektrostatische interacties, geleidelijk lager de solute atoom terughoudendheid tot 0,1 kilocalorie per mole angstrom plein en de balans af te ronden met een ongebreidelde vijf nanoseconde simulatie. Voer de egalisatie uit met de opdracht zoals aangegeven.

Pas de tekst aan om de productiesimulatie gedurende 100 nanoseconden uit te voeren, waarbij de conformaties om de 10 picoseconden worden opgeslagen en voer vervolgens de simulatie uit met het commando zoals aangegeven. Open de Amber topologiebestanden en de bijbehorende trajectbestanden in Visual Molecular Dynamics om het conformatiemonster te visualiseren tijdens de wild-type en gemuteerde EGFR kinase simulaties. En met behulp van handige secundaire structuur representaties, analyseren van de algehele structurele dynamiek van de eiwitten uit het opgenomen traject.

Bekijk vervolgens specifieke interacties tussen atomen en resten van belang, zoals de katalytisch essentiële lysine 745-glutamaat 762 zoutbrug. U ook meerdere conformaties opslaan die tijdens de simulatie in het eiwitgegevensbankformaat zijn bemonsterd en de conformaties in Kymera openen. Gebruik de optie koppelaar om de structuren op de oorspronkelijke of mediane structuur te plaatsen en de mediane structuur weer te geven in vaste en de rest van de uitgelijnde structuren in vervaagd wit om visualisatie van de opgenomen structurele bewegingen met meer helderheid mogelijk te maken.

Om de wereldwijde stabiliteit van de wild-type en mutant EFR's te analyseren en de flexibiliteit van de verschillende structurele eenheden te onderzoeken, importeer de Amber typologie en bijbehorende trajectbestanden. Geef in het invoerbestand van de gemiddelde vierkante afwijking de backbone aan als referentie voor de gemiddelde vierkante fitting. Geef in het invoerbestand van de hoofdge mean vierkante fluctuatie de C-alpha-atomen van de oorspronkelijke structuur aan als referentie voor de gemiddelde vierkante fitting van de wortel.

Voer vervolgens de analyse uit met het CPPTRAJ-programma en plot de uitvoergegevens. Als alternatief, om de conformatie ensembles uit te lijnen en om elke residu kleur op basis van de C-alpha atoomwortel gemiddelde vierkante afwijking, open de conformaties in Kymera en uitlijnen ze met de matchmaker optie. Selecteer gereedschappen, afbeelding en weergave op kenmerk.

Selecteer resten van de conformatieensembles en stel de gemiddelde vierkante afwijking van de C-alpha-wortel in als de kenmerken en klik op OK. Het kettingspoor van de conformaties wordt blauw, wit of rood weergegeven als gevolg van de regio's met respectievelijk hoge, gemiddelde en lage structurele stabiliteit. Om de waterstofbindingsinteracties tussen ATP en zowel wild-type als verwijdering-EFR's te analyseren, stelt u een CPPTRAJ-script voor om deze taak uit te voeren. Specificeer de analyse voor de intermoleculaire waterstofbindingen alleen met de nointramol-variabele en definieer een waterstofbinding met een donor acceptorafstand van minder dan of gelijk aan 3,5 angstroms en een bindingshoek van meer dan of gelijk aan 135 graden.

Om de intramoleculaire interacties te beoordelen, bijvoorbeeld tussen de katalytisch belangrijke lysine en glutamaatresiduen, specificeert u lysine als waterstofdonor en glutamaat als de acceptorresiduen en voert u het script uit zoals aangegeven om analyse van het resultaat mogelijk te maken. Voor het berekenen van de bindende vrije energieën tussen ATP en zowel wild-type en schrapping EGFRs, de voorbereiding van de gasfase ligand receptor en ligand receptor complexe Protein Data Bank bestanden in de LEAP programma en zet ATP als de ligand en EGFR als de receptor. Stel de gegeneraliseerde geboren radiowaarde in op M Bond I2. Vervolgens de Amber-topologie genereren en bestanden voor de gasfase Protein Data Bank-bestanden coördineren.

Evenzo, om bindende vrije energieën tussen de activator en ontvanger kinases van wild-type en alanine 702 valine EFR's te berekenen, specificeer de ontvanger kinase als de ligand en de activator kinase als de receptor en sla de overeenkomstige topologie en coördineren bestanden. Bereid een moleculaire mechanica gegeneraliseerd geboren oppervlakte input bestand en stel de IGB waarde op twee en de saltcon op 0.1. Dan met behulp van de mmpbsa.

py script beschikbaar in Amber, voer de opdracht zoals aangegeven om de bindende energie berekeningen uit te voeren en analyseren van de output gegevens. Tijdens deze representatieve simulatie van 100 nanoseconden vertoonde de alanine 702 valïne mutant een verhoogde conformatiestabiliteit van het juxtamembrane B-segment, waarschijnlijk als gevolg van strakkere hydrofobe interacties in vergelijking met het wilde EGFR. De alanine 702 valine mutant vertoonde ook een lagere vrije bindingsenergie tussen de activator en ontvanger kinases ten opzichte van de wild-type EGFR, wat gunstiger dimer interacties die de actieve EGFR kinase conformatie te handhaven.

Simulatie van de deletion mutatie resulteerde in lagere C-alpha atoom schommelingen van de functioneel belangrijke alpha C-helix in vergelijking met de wild-type EGFR, het verlengen van de tijd van de EGFR actieve toestand. De schrappingsmutatie resulteerde ook in frequente vorming van waterstofbindingen tussen de zijketen polaire atomen van lysine 745 en glutamaat 762, een belangrijke interactie voor EGFR enzymatische activiteit in vergelijking met wild-type EGFR. Bovendien was het aantal waterstofbindingen tussen ATP en EGFR groter voor de schrappingsmutant dan voor het wilde EGFR.

De schrappingsmutatie resulteerde ook in een innerlijke beweging van de EGFR inactieve toestand alpha C-helix, een structurele verandering die verwacht wordt tijdens de overgang naar de actieve toestand. Daarentegen handhaafde de alfa C-helix van wild-type inactieve EGFR zijn initiële conformatie. Om de impact van de mutaties te beoordelen, is het van cruciaal belang om de juiste conformatietoestanden van de structuren te selecteren en deze structuren goed voor te bereiden en te equilibreren.

Het is belangrijk om moleculaire dynamische simulaties te combineren met experimentele studies, omdat de synergie tussen deze technieken de interpretatie van de resultaten ten goede komt en aanvullende natte laboratoriumexperimenten kan informeren.