Een benadering om vormafhankelijke transcriptie te bestuderen op een enkelcellig niveau
November 2nd, 2020
Dit document presenteert methoden voor het kweken van cardiale myocyten met verschillende vormen, die verschillende pathologieën vertegenwoordigen, en het sorteren van deze aanhangende cardiale myocyten op basis van hun morfologie op een celniveau. Het voorgestelde platform biedt een nieuwe benadering van hoge doorvoer en drug screening voor verschillende soorten hartfalen.
We stellen een nieuw platform voor voor het onderzoeken van de effecten van celvorm op genexpressie, met behulp van methoden voor het kweken en sorteren van hechtingen met verschillende morfologieën op het niveau van één cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vergemakkelijkt de hoge doorvoer studie van celvorm in vitro als het vergelijken van cellen met verschillende vormen in vivo is technisch veeleisend. Om een cardiomyocyte-cultuur met patroon op te zetten, breng je een cardiomyocyte-suspensie bij de beeldverhouding van belang over naar een buis van 15 milliliter voor het tellen en verdunnen van de cellen tot één keer 10 naar de vijf cellen per milliliter van de juiste beplatingsmediumconcentratie.
Voeg twee milliliter cellen toe aan een met fibronectin gecoate micropatterned chip ondergedompeld in twee milliliter warm beplating medium in een 35 milliliter Grenier Petri schotel en plaats de schotel in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator voor 18 uur. De volgende dag, controleer de chip door licht microscopie om te bevestigen dat de meeste van de cellen hebben bevestigd. Verwijder het medium uit de schotel om vuil en of dode cellen te verwijderen, en vanaf het midden en bewegen naar de zijkanten in een druppel-wise manier, voorzichtig voeg PBS aan de cellen.
Vervang na de derde wasbeurt de PBS door vier milliliter onderhoudsmedium en breng de cellen terug naar de celkweek incubator. Spoel na 72 uur het spaanoppervlak voorzichtig twee keer door met twee milliliter warme Dulbecco's PBS per wasbeurt, zoals aangetoond en gebruik tangen om de gewassen chip onmiddellijk over te brengen naar een nieuwe steriele 35 milliliter Grenier Petri schotel. Voeg snel 1,5 microliter levendige dicycle groen verdund 1000 vouwen in DPBS toe aan de chip.
Bevestig een kamer over de chip en plaats de schotel op de schotelhouder van de celkiezerfase. Plaats de magnetische dop en zoek het kruishaar in het live view-venster. Focus op het kruishaar en selecteer in het scan- en sorteervenster de kalibratie voor geautomatiseerde injectie en kalibreren.
Vervang de schotel supernatant door 1,5 milliliter van een een-op-een triple E in DPBS oplossing om de cellen los te maken van de fibronectin en open het tabblad scannen. Als u de hele chip wilt scannen, richt u zich op de linkerbovenhoek van de chip in het gezichtsveld en klikt u op de huidige microscooppositie. Focus vervolgens op de rechterbenedenhoek van de chip en klik op de huidige microscooppositie.
Klik in het pop-upvenster op het scherpste vlak instellen en klik rechtsboven op de knoppen linksonder. Klik vervolgens op voltooien om te beginnen met scannen. Wanneer het scannen is voltooid, opent u het tabblad analyseren en klikt u op De kaart weergeven om de afzonderlijke cellen te selecteren die aan de studiecriteria voldoen.
Centreer de glazen microcapillaire in het midden van de microscoop live view en open de pomp tab. Om een vacuüm te creëren, trekt u de zuiger uit een 50 milliliter nummer één spuit vier milliliter en open het sorteertabblad. Om een enkele cel te kunnen kiezen, stelt u de klep twee in om te worden geopend voor 120 milliseconden en klep één om gedurende 20 milliseconden te worden geopend na een time-lapse van 200 milliseconden.
Om de gekozen cel met succes te kunnen leveren aan de PCR-buis met lysebuffer, stelt u de klep 20 milliseconden en kleppen twee in om gedurende 10 milliseconden te worden geopend na een time-lapse van 10 milliseconden. Wanneer de klepinstellingen zijn aangepast, klikt u op het pad berekenen. De software berekent het snelste pad van cel naar cel voor het oppakken en injecteren van de geselecteerde cellen in de chip.
Richt de microscoop vervolgens op een patroon op het spaanoppervlak. Gebruik de joystick om de microcapillary voorzichtig naar beneden te bewegen, zodat het scherpste beeld van de punt van de microcapillaire kan worden verkregen zonder het spaanoppervlak aan te raken en op de set te klikken. Er wordt een nieuw venster geopend, met de microcapillaire dwarsdoorsnede.
Als u de software de tipverschuiving van de capillaire in de coördinaten X, Y en Z wilt laten registreren, klikt u op het exacte midden van de capillaire. Klik vervolgens op sorteren om de sortering te starten. In deze representatieve analyse van de voorversterkte cDNA uit een geplukte eencellige, werd een duidelijke band in de gel zoals densitometrie plot waargenomen die overeenkomt met de piek op 1, 852 basisparen in het elektropherogram.
De gemiddelde grootte van fragmenten was 1, 588 basisparen met een klein aantal fragmenten die korter waren dan 300 basisparen, wat de generatie van een goede cDNA-bibliotheek aangeeft. Immunofluorescente kleuring en analyse kunnen ook worden uitgevoerd om de sarcomerestructuur binnen de gedessineerde cardiomyocyten te evalueren. Dit platform maakt de weg vrij voor een hoge doorvoerstudie en drugsscreening van verschillende soorten hartfalen.
Overzicht
Deze studie introduceert een nieuw platform voor het kweken en sorteren van cardiale myocyten op basis van hun morfologie op het niveau van een enkele cel. Deze methode maakt hoge doorvoer geneesmiddelenscreening mogelijk voor verschillende typen hartfalen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Cardiale myocytencultuur
- Celmorfologie analyse
- Geneesmiddelenscreening methodologieën
Achtergrond
- Cardiale myocyten vertonen diverse vormen die correleren met verschillende pathologieën.
- Het onderzoeken van celvormeffecten op genexpressie is uitdagend in vivo.
- Hoge doorvoertechnieken zijn essentieel voor effectieve geneesmiddelenscreening.
- Huidige methoden ontbreken aan efficiëntie in het sorteren en analyseren van enkele cellen op basis van morfologie.
Doel van studie
- Om een platform te ontwikkelen voor het bestuderen van de invloed van celvorm op genexpressie.
- Om het sorteren van cardiale myocyten op basis van hun morfologie te vergemakkelijken.
- Om geneesmiddelenscreening processen voor hartfalen behandelingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cardiomyocytensuspensie voorbereiding en verdunning.
- Gebruik van fibronectine-gecoate microgepatternde chips voor celcultuur.
- Lichtmicroscopie voor bevestiging van celbevestiging.
- Geautomatiseerd scannen en sorteren van enkele cellen met behulp van een microcapillair systeem.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bevestiging en onderhoud van gepatternde cardiomyocyten.
- Generatie van een goede cDNA bibliotheek uit gesorteerd enkele cellen.
- Immunoonvloedbare kleuring onthulde sarcomeer structuren.
- Het platform ondersteunt hoge doorvoer studies en geneesmiddelenscreening.
Conclusies
- Het ontwikkelde platform biedt een nieuwe aanpak voor het bestuderen van cardiale myocyten.
- Het maakt efficiënt sorteren en analyseren van cellen op basis van morfologie mogelijk.
- Deze methode kan het onderzoek naar hartfalen therapieën aanzienlijk bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
