Name: Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer een herbruikbare eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met meerdere epigenetische merken. Deze techniek maakt statistische validatie mogelijk en is waardevol voor onderzoek naar genexpressieregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Drs. David Sanchez-Martin en Christopher B. Buck voor hun commentaar tijdens de conceptualiseringsfase van het project. We bedanken ook de Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health voor hulp bij voorbereidende experimenten en de Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH voor advies in computationele analyse. We bedanken mevrouw Anna Word voor het helpen met de optimalisatie van DNA-polymerasen die in de methode worden gebruikt. Dit werk maakte gebruik van de computationele middelen van het NIHHPC Biowulf-cluster (http://hpc.nih.gov). Dit project wordt ondersteund door het intramurale programma van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, de NCI Director's Innovation Award (# 397172) en federale fondsen van het National Cancer Institute onder contractnummer HHSN261200800001E. We bedanken Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy en alle leden van het Laboratorium voor Cellulaire Oncologie voor productieve opmerkingen.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Drs. Ohnuki en Tosato zijn mede-uitvinders van een patent getiteld "Methods for preparing a reusable single cell and methods for analyzing the epigenome, transcriptome and genome of a single cell" (EP3619307 en US20200102604). De octrooiaanvraag werd gedeeltelijk ingediend op basis van voorlopige resultaten met betrekking tot de technologie die in het huidige manuscript wordt beschreven. De uitvinding of uitvindingen die in deze octrooiaanvraag worden beschreven en geclaimd, zijn gedaan terwijl de uitvinders fulltime werknemers van de Amerikaanse overheid waren. Daarom zijn onder 45 Code of Federal Regulations Part 7 alle rechten, titels en belangen met betrekking tot deze octrooiaanvraag bij wet toegewezen aan de Amerikaanse overheid. De Amerikaanse overheid draagt een deel van de royalty's die zij ontvangt over aan haar werknemersuitvinders onder 15 U.S. Code § 3710c.

Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de onlangs gerapporteerde eencellige multi-epigenomische analyse met herbruikbare afzonderlijke cellen7. In de volgende paragrafen bespreken we kritieke punten, waarbij we de nadruk leggen op mogelijke beperkingen in het protocol. 
Een van de kritieke punten in het protocol (van stap 7.2-13) is het vermijden van DNase-besmetting. Een enkele cel heeft slechts twee kopieën van genomisch DNA. Daarom vermindert het besch...

Single-cell technologie betreedt het tijdperk van single-cell multiomics, dat individuele single-cell omics-technologieën integreert1. Onlangs is single-cell transcriptomics gecombineerd met methoden voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid (scNMT-seq2 en SHARE-seq3) of histonmodificaties (Paired-seq4 en Paired-Tag5). Meer recent werden single-cell transcriptomics en proteomics geïntegreerd met chromatine toegankelijkheid (DOGMA-seq6). Deze methoden maken gebruik van transposase-gebaseerde tagging voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid of histonmodificaties.
Transposase-gebaseerde benaderingen splitsen genomisch DNA en voegen een DNA-streepjescode toe aan het einde van het genomische DNA-fragment. Elk gespleten genomisch fragment kan slechts maximaal twee DNA-barcodes accepteren (= één epigenetisch merkteken per splitsingsplaats), en het genomische DNA op de splitsingsplaats gaat verloren. Daarom hebben op splitsing gebaseerde benaderingen een afweging tussen het aantal geteste epigenetische markeringen en de signaaldichtheid. Dit belemmert de analyse van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel. Een eencellige epigenomische methode die het genomische DNA niet splitst, werd ontwikkeld om dit probleem op te lossen 7,8.
Naast het hierboven genoemde splitsingsprobleem, hebben op transposase gebaseerde benaderingen nog andere beperkingen. Bij eencellige epigenoomanalyse is het van cruciaal belang om de locatie van histonen en DNA-geassocieerde eiwitten op het genoom te kennen. In de huidige benaderingen wordt dit bereikt door gebruik te maken van niet-gefixeerde afzonderlijke cellen en het behoud van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties. Dit genereert echter een sterke bias voor toegankelijke chromatinegebieden, zelfs bij de analyse van histonmodificaties 9. De locatie van histonen en genoom-geassocieerde eiwitten op het genoom kan worden bewaard zonder eiwit-DNA en eiwit-eiwit te vermengen, met behulp van een polyacrylamide scaffold 7,8. Deze benadering vermindert de structurele vertekening die wordt waargenomen in de huidige benaderingen die afhankelijk zijn van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties.
Transposase-gebaseerde benaderingen kunnen slechts één keer signalen van een enkele cel ontvangen. Daarom is het moeilijk om het volledige epigenoom van een enkele cel af te bakenen vanwege het wegvallen van de signalen. Herbruikbare afzonderlijke cellen zijn ontwikkeld om de huidige beperkingen te overwinnen door iteratieve epigenomische analyse in dezelfde enkele cel mogelijk te maken.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Digestion buffer</td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40% acrylamide solution</td></tr><tr><td>All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Scanning microscope</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>Ultrafiltration cassette</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate for molecular biology</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Ammonium persulfate powder</td></tr><tr><td>Anhydrous DMF</td><td>Vector laboratories</td><td>S-4001-005</td><td>Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Table 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA Polymerase, Large Fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA polymerase</td></tr><tr><td>BT10 Series 10 &micro;l Barrier Tip</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 low-retention tip</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>N/A</td><td>Automated single cell picking robot</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL nanowell plate</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Flat-bottom 96-well plates</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA polymerase</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0.5 mL DNA low-binding tube</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 1st random primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>1st random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd random primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2nd synthesis primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>2nd synthesis primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Ligation Adaptor</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>Ligation Adaptor</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Reverse Transcription primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, see Table 3</td><td>Reverse Transcription primer</td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (RNase-free, 4 U).</td></tr><tr><td>DNase I Reaction Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I buffer (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM each)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>In-vitro-transcription master mix</td></tr><tr><td>Histone H3K27ac antibody</td><td>Active motif</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Histone H3K27me3 antibody</td><td>Active motif</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG from rabbit serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Control IgG</td></tr><tr><td>Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-243</td><td>cells</td></tr><tr><td>Linear Acrylamide (5 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Linear Acrylamide</td></tr><tr><td>LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Mineral oil</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine for molecular biology</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylenediamine</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), RNase-free</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>

herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

De huidige eencellige epigenoomanalyses zijn ontworpen voor eenmalig gebruik. De cel wordt na eenmalig gebruik weggegooid, waardoor analyse van meerdere epigenetische markeringen in een enkele cel wordt voorkomen en gegevens van andere cellen nodig zijn om signaal van experimentele achtergrondruis in een enkele cel te onderscheiden. Dit artikel beschrijft een methode om dezelfde enkele cel te hergebruiken voor iteratieve epigenomische analyses. 
Bij deze experimentele methode worden cellulaire eiwitten eerst verankerd aan een polyacrylamidepolymeer in plaats van ze te koppelen aan eiwit en DNA, waardoor structurele vertekening wordt verlicht. Deze kritische stap maakt herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk. Vervolgens wordt een willekeurige primer met een steigersequentie voor nabijheidsligatie gegloeid aan het genomische DNA en wordt de genomische sequentie bij uitbreiding aan de primer toegevoegd met behulp van een DNA-polymerase. Vervolgens worden een antilichaam tegen een epigenetische marker en controle IgG, elk gelabeld met verschillende DNA-sondes, gebonden aan de respectieve doelen in dezelfde enkele cel. 
Nabijheidsligatie wordt geïnduceerd tussen de willekeurige primer en het antilichaam door een connector-DNA toe te voegen met complementaire sequenties aan de scaffold-sequentie van de willekeurige primer en de antilichaam-DNA-sonde. Deze aanpak integreert antilichaaminformatie en nabijgelegen genoomsequenties in een enkel DNA-product van nabijheidsligatie. Door herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk te maken, maakt deze methode een toename van de gegevensdichtheid van een zeldzame cel en statistische analyse mogelijk met alleen IgG- en antilichaamgegevens van dezelfde cel. De herbruikbare afzonderlijke cellen die met deze methode zijn bereid, kunnen minstens een paar maanden worden bewaard en later worden hergebruikt om de epigenetische karakterisering te verbreden en de gegevensdichtheid te verhogen. Deze methode biedt flexibiliteit aan onderzoekers en hun projecten.

K562 enkele cellen werden gegenereerd met behulp van het protocol beschreven in stap 8 (zie figuur 5). Enkele cellen waren ingebed in de buitenste laag van de polyacrylamidekraal. Cel-DNA werd gekleurd en gevisualiseerd met behulp van een intercalatorkleurstof voor DNA-kleuring.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Figuur 5: Gegenereerde herbruikb...

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Deze experimentele methode maakt de langdurige opslag van de herbruikbare afzonderlijke cellen voor epigenomisch testen mogelijk. Het maakt ook de analyse van vele epigenetische markeringen en transcriptiefactoren in dezelfde enkele cel mogelijk. In de huidige methoden voor eencellige epigenoomanalyse kunnen dezelfde afzonderlijke cellen niet opnieuw worden geanalyseerd.Met herbruikbare afzonderlijke cellen kunnen dezelfde afzonderlijke cellen echter vele malen opnieuw worden geanalyseerd. Deze techniek is nuttig voor de diagnose en het ontwerp van epigenetische therapie, vooral wanneer de cellen van de patiënt beperkt zijn in aantal. Deze methode is het meest geschikt voor de studie van het epigenoom, de regulatie van genexpressie en andere systemen, zolang specifieke antilichamen voor epigenetische markeringen beschikbaar zijn.Wanneer u deze techniek voor het eerst probeert, raden we u aan te oefenen op monsters die niet te kostbaar zijn en het experiment te valideren met behulp van ondiepe sequencing zoals MiSeq of iSeq 100. Om te beginnen, meng in een schone laminaire stroomkap een milliliter celsuspensie en 199 milliliter van één millimolaire EDTA PBS met een intercalatorkleurstof voor DNA. Breng na het mengen 200 microliter van de celsuspensie over naar elke put van de 96-putplaat met vlakke bodem.Plaats de deksel op de 96-putplaat en scan de plaat met een scanmicroscoop. Kantel vervolgens de plaat en wacht een paar minuten totdat de enkele cel naar de onderrand van de put is gezonken. Plaats vervolgens de pipetpunt op de benedenhoek en breng de enkele cel en de buffer over naar een PCR-buis.Controleer de put met behulp van een fluorescentiemicroscoop om de overdracht te bevestigen. Als een enkele cel zich nog in de put bevindt, voeg dan 200 microliter per put van één millimolaire EDTA PBS toe met een intercalatorkleurstof voor DNA en herhaal de overdracht. Plaats na de overdracht een deksel op de 96-well PCR-plaat en centrifugeer de plaat met behulp van een zwenkrotor zonder pauze.Plaats de plaat na het centrifugeren op het dek van een automatische vloeistofbehandelingsrobot. Sleep vervolgens de aanvullende code één naar het softwarevenster van de vloeistofbehandelingsrobot en voer het programma uit om 195 microliter van het supernatant te verwijderen met een zeer langzame pipetteersnelheid. Voeg 50 microliter 4% TEMED of minerale olie toe en incubeer de plaat een nacht bij kamertemperatuur.Verwijder de volgende dag de minerale olie door pipetteren en was de cellen vijf keer met 200 microliter TP magnesiumnegatieve buffer. Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant, voeg 15 microliter gloeibuffer toe en incubeer gedurende een uur op ijs. Plaats na de incubatie de PCR-buizen op een thermische cycler en verwarm gedurende drie minuten op 94 graden Celsius.Breng vervolgens de buizen over in een ijsgekoeld metalen blok en incubeer gedurende twee minuten. Voeg vervolgens vier microliter magnesiumsulfaat-natriumchloride toe, DNTP-mix en meng door vortexing met een maximale snelheid. Voeg vervolgens een microliter BST-polymerase groot fragment toe, meng door vortexing en incuber gedurende vier uur op een shaker.Plaats na de incubatie de PCR-buis op een thermische cycler en voer een programma van vier uur of 's nachts uit zoals beschreven in de tekst. Voeg voor antilichaambinding 1,625 microliter natriumchloride EDTA BSA-oplossing toe aan de buis. Meng door vortexing op lage snelheid en incubeer de buis op ijs gedurende een uur.Voeg vervolgens 0,1 microgram per milliliter antilichaam toe en controleer IgG geconjugeerd met de antilichaamsonde. Na het toevoegen van de antilichamen, incubeer de buizen op ijs met zacht schudden. Was de cellen de volgende dag twee keer met 200 microliter TPM-T-buffer op ijs.Verwijder vervolgens het supernatant en was eenmaal met T4 DNA-ligasebuffer. Voeg vervolgens 19 microliter ligatieadapteroplossing toe en incubeer gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Voeg vervolgens een microliter T4 DNA-ligase toe en meng de buis door vortexing op gemiddelde snelheid.Plaats de buis op een thermische cycler en voer het nabijheidsligatieprogramma uit. Na de run, was de cellen twee keer met 200 microliter BST magnesium negatieve EDTA positieve buffer en bewaar de cellen 's nachts bij vier graden Celsius. Was de cellen de volgende dag tweemaal met 200 microliter BST-magnesiumnegatieve EDTA-negatieve buffer en voeg 20 microliter toe van een mengsel dat BST, DNTP's en magnesiumsulfaat bevat.Meng vervolgens met een vortexmixer en incuber de buis gedurende vier uur op een orbitale schudder. Plaats na de incubatie de buis op een thermische cycler en voer het volledige uitbreidingsprogramma uit zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg vervolgens, voor versterking met meerdere verplaatsingen, 0,4 microliter 100 micromolaire tweede willekeurige primer toe en meng door vortexing.Incubeer vervolgens de buis gedurende twee uur op een orbitale schudder voordat u de buis op een thermische cycler plaatst voor verwarming op 94 graden Celsius. Plaats na drie minuten de buisjes in een ijsgekoeld metalen blok en voeg een microliter BST DNA-polymerase toe. Vortex de buizen op lage snelheid.Plaats vervolgens de buizen op een thermische cycler om het versterkingsprogramma met meerdere verplaatsingen uit te voeren. Breng na het programma ongeveer 20 microliter supernatant over naar een PCR-buis en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Voeg vervolgens 20 microliter 0,05% TWEEN 20 en 0,1X TE-buffer toe aan een PCR-buis met de herbruikbare enkele cel en incuber de buis 's nachts bij vier graden Celsius.Verzamel de volgende dag het supernatant en combineer het met het eerder verzamelde supernatant. Week vervolgens de herbruikbare eencellige en TBS-buffer met 50% glycerol, vijf millimolaire EDTA, 0,5% BSA en 0,05% TWEEN 20 en incubeer deze vervolgens gedurende 30 minuten op een orbitale shaker. Bewaar de herbruikbare enkele cel na incubatie bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik.Voeg ten slotte 40 microliter Exo-negatieve mastermix toe en plaats de buis op een thermische cycler om het programma uit te voeren zoals beschreven in het tekstmanuscript. K562 herbruikbare enkele cellen werden gegenereerd met behulp van dit protocol. Enkele cellen werden ingebed in de buitenste laag van de polyacrylamidekraal en gevisualiseerd met behulp van een intercalatorkleurstof voor DNA-kleuring.DNA-producten voor en na de BciVI-vertering worden hier getoond. De restrictie-enzymvertering genereerde de verwachte 19 tot 20, 31 tot 32, 49 en meer dan 49 basenpaarfragmenten. Verder werd de geconstrueerde DNA-bibliotheek geanalyseerd door capillaire elektroforese voor de gewenste producten.De sequencingresultaten gaven aan dat de unieke in kaart gebrachte metingen van anti-histon H3 geacetyleerd lysine 27 en anti-histon H3 trimethylated lysine 27 significant talrijker waren dan van de controle IgG. De REpi-sequencingsignalen werden geëvalueerd door REpi-sequencinggegevens te vergelijken met bulk ChIP-sequencinggegevens. Gemiddeld overlapte ongeveer 91% van de histon H3 geacetyleerde lysine 27 signalen van REpi sequencing met histon H-3 geacetyleerde lysine 27 pieken in bulk ChIP sequencing.De precisie van REpi-sequencing voor het inactieve histonmerk, histon H3 trimethylated lysine 27 was 52%De gevoeligheid van REpi-sequencing werd geanalyseerd om te meten hoeveel pieken van bulk ChIP-sequencing werden gedetecteerd door REpi-sequencing gereproduceerde reads. De gevoeligheid van REpi-sequencing was 55,30% in histon H3 geacetyleerd lysine 27 en 50,94% in histon H3 trimethylated lysine 27. Zorg ervoor dat u DNS-vrije reagentia gebruikt.Ook moeten alle bewerkingen waarbij de openingsbuiskabels of reagenskabels betrokken zijn, worden uitgevoerd in een schone kap. DNA-producten van deze procedure worden gesequenced en vervolgens in kaart gebracht aan het genoom om te onthullen welke histonmodificaties aanwezig zijn, in welke regio's van het genoom in afzonderlijke cellen. Deze technologie maakte het mogelijk om meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel te analyseren en maakte de weg vrij voor multiomics-analyse in elke enkele cel.

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Methoden voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties worden cruciaal voor elk aspect van genomisch onderzoek, maar ze zijn arbeidsintensief, duur en tijdrovend. Hier wordt een commercieel verkrijgbaar robotsysteem voor vloeistofbehartiging gepresenteerd dat chromatine-immunoprecipitatie automatiseert voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties met beperkte hoeveelheden cellen.

Automatiseren van ChIP-seq Experimenten om Genereer Epigenetische Profielen op 10.000 HeLa-cellen

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken &gt; 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

CUT&amp;RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT &amp; RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

In dit protocol werden de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode geoptimaliseerd voor de gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van het NuTRAP muismodel gekruist naar een Cyp17a1-Cre muislijn.

Celspecifieke gepaarde ondervraging van het ovarium-epigenoom en transcriptoom van de muis

Het protocol combineert menselijke darmorganoïdetechnologie met transcriptomische analyse van één cel om aanzienlijk inzicht te geven in voorheen onontgonnen darmbiologie.

Menselijke darmorganoïden gebruiken om het epitheel van de dunne darm te begrijpen op transcriptioneel niveau van één cel

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer een herbruikbare eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met meerdere epigenetische merken. Deze techniek maakt statistische validatie mogelijk en is waardevol voor onderzoek naar genexpressieregulatie.

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Meer video's verkennen