Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Deze experimentele methode maakt de langdurige opslag van de herbruikbare afzonderlijke cellen voor epigenomisch testen mogelijk. Het maakt ook de analyse van vele epigenetische markeringen en transcriptiefactoren in dezelfde enkele cel mogelijk. In de huidige methoden voor eencellige epigenoomanalyse kunnen dezelfde afzonderlijke cellen niet opnieuw worden geanalyseerd.

Met herbruikbare afzonderlijke cellen kunnen dezelfde afzonderlijke cellen echter vele malen opnieuw worden geanalyseerd. Deze techniek is nuttig voor de diagnose en het ontwerp van epigenetische therapie, vooral wanneer de cellen van de patiënt beperkt zijn in aantal. Deze methode is het meest geschikt voor de studie van het epigenoom, de regulatie van genexpressie en andere systemen, zolang specifieke antilichamen voor epigenetische markeringen beschikbaar zijn.

Wanneer u deze techniek voor het eerst probeert, raden we u aan te oefenen op monsters die niet te kostbaar zijn en het experiment te valideren met behulp van ondiepe sequencing zoals MiSeq of iSeq 100. Om te beginnen, meng in een schone laminaire stroomkap een milliliter celsuspensie en 199 milliliter van één millimolaire EDTA PBS met een intercalatorkleurstof voor DNA. Breng na het mengen 200 microliter van de celsuspensie over naar elke put van de 96-putplaat met vlakke bodem.

Plaats de deksel op de 96-putplaat en scan de plaat met een scanmicroscoop. Kantel vervolgens de plaat en wacht een paar minuten totdat de enkele cel naar de onderrand van de put is gezonken. Plaats vervolgens de pipetpunt op de benedenhoek en breng de enkele cel en de buffer over naar een PCR-buis.

Controleer de put met behulp van een fluorescentiemicroscoop om de overdracht te bevestigen. Als een enkele cel zich nog in de put bevindt, voeg dan 200 microliter per put van één millimolaire EDTA PBS toe met een intercalatorkleurstof voor DNA en herhaal de overdracht. Plaats na de overdracht een deksel op de 96-well PCR-plaat en centrifugeer de plaat met behulp van een zwenkrotor zonder pauze.

Plaats de plaat na het centrifugeren op het dek van een automatische vloeistofbehandelingsrobot. Sleep vervolgens de aanvullende code één naar het softwarevenster van de vloeistofbehandelingsrobot en voer het programma uit om 195 microliter van het supernatant te verwijderen met een zeer langzame pipetteersnelheid. Voeg 50 microliter 4% TEMED of minerale olie toe en incubeer de plaat een nacht bij kamertemperatuur.

Verwijder de volgende dag de minerale olie door pipetteren en was de cellen vijf keer met 200 microliter TP magnesiumnegatieve buffer. Verwijder na de laatste wasbeurt het supernatant, voeg 15 microliter gloeibuffer toe en incubeer gedurende een uur op ijs. Plaats na de incubatie de PCR-buizen op een thermische cycler en verwarm gedurende drie minuten op 94 graden Celsius.

Breng vervolgens de buizen over in een ijsgekoeld metalen blok en incubeer gedurende twee minuten. Voeg vervolgens vier microliter magnesiumsulfaat-natriumchloride toe, DNTP-mix en meng door vortexing met een maximale snelheid. Voeg vervolgens een microliter BST-polymerase groot fragment toe, meng door vortexing en incuber gedurende vier uur op een shaker.

Plaats na de incubatie de PCR-buis op een thermische cycler en voer een programma van vier uur of 's nachts uit zoals beschreven in de tekst. Voeg voor antilichaambinding 1,625 microliter natriumchloride EDTA BSA-oplossing toe aan de buis. Meng door vortexing op lage snelheid en incubeer de buis op ijs gedurende een uur.

Voeg vervolgens 0,1 microgram per milliliter antilichaam toe en controleer IgG geconjugeerd met de antilichaamsonde. Na het toevoegen van de antilichamen, incubeer de buizen op ijs met zacht schudden. Was de cellen de volgende dag twee keer met 200 microliter TPM-T-buffer op ijs.

Verwijder vervolgens het supernatant en was eenmaal met T4 DNA-ligasebuffer. Voeg vervolgens 19 microliter ligatieadapteroplossing toe en incubeer gedurende een uur bij 25 graden Celsius. Voeg vervolgens een microliter T4 DNA-ligase toe en meng de buis door vortexing op gemiddelde snelheid.

Plaats de buis op een thermische cycler en voer het nabijheidsligatieprogramma uit. Na de run, was de cellen twee keer met 200 microliter BST magnesium negatieve EDTA positieve buffer en bewaar de cellen 's nachts bij vier graden Celsius. Was de cellen de volgende dag tweemaal met 200 microliter BST-magnesiumnegatieve EDTA-negatieve buffer en voeg 20 microliter toe van een mengsel dat BST, DNTP's en magnesiumsulfaat bevat.

Meng vervolgens met een vortexmixer en incuber de buis gedurende vier uur op een orbitale schudder. Plaats na de incubatie de buis op een thermische cycler en voer het volledige uitbreidingsprogramma uit zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voeg vervolgens, voor versterking met meerdere verplaatsingen, 0,4 microliter 100 micromolaire tweede willekeurige primer toe en meng door vortexing.

Incubeer vervolgens de buis gedurende twee uur op een orbitale schudder voordat u de buis op een thermische cycler plaatst voor verwarming op 94 graden Celsius. Plaats na drie minuten de buisjes in een ijsgekoeld metalen blok en voeg een microliter BST DNA-polymerase toe. Vortex de buizen op lage snelheid.

Plaats vervolgens de buizen op een thermische cycler om het versterkingsprogramma met meerdere verplaatsingen uit te voeren. Breng na het programma ongeveer 20 microliter supernatant over naar een PCR-buis en bewaar deze bij min 80 graden Celsius. Voeg vervolgens 20 microliter 0,05% TWEEN 20 en 0,1X TE-buffer toe aan een PCR-buis met de herbruikbare enkele cel en incuber de buis 's nachts bij vier graden Celsius.

Verzamel de volgende dag het supernatant en combineer het met het eerder verzamelde supernatant. Week vervolgens de herbruikbare eencellige en TBS-buffer met 50% glycerol, vijf millimolaire EDTA, 0,5% BSA en 0,05% TWEEN 20 en incubeer deze vervolgens gedurende 30 minuten op een orbitale shaker. Bewaar de herbruikbare enkele cel na incubatie bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik.

Voeg ten slotte 40 microliter Exo-negatieve mastermix toe en plaats de buis op een thermische cycler om het programma uit te voeren zoals beschreven in het tekstmanuscript. K562 herbruikbare enkele cellen werden gegenereerd met behulp van dit protocol. Enkele cellen werden ingebed in de buitenste laag van de polyacrylamidekraal en gevisualiseerd met behulp van een intercalatorkleurstof voor DNA-kleuring.

DNA-producten voor en na de BciVI-vertering worden hier getoond. De restrictie-enzymvertering genereerde de verwachte 19 tot 20, 31 tot 32, 49 en meer dan 49 basenpaarfragmenten. Verder werd de geconstrueerde DNA-bibliotheek geanalyseerd door capillaire elektroforese voor de gewenste producten.

De sequencingresultaten gaven aan dat de unieke in kaart gebrachte metingen van anti-histon H3 geacetyleerd lysine 27 en anti-histon H3 trimethylated lysine 27 significant talrijker waren dan van de controle IgG. De REpi-sequencingsignalen werden geëvalueerd door REpi-sequencinggegevens te vergelijken met bulk ChIP-sequencinggegevens. Gemiddeld overlapte ongeveer 91% van de histon H3 geacetyleerde lysine 27 signalen van REpi sequencing met histon H-3 geacetyleerde lysine 27 pieken in bulk ChIP sequencing.

De precisie van REpi-sequencing voor het inactieve histonmerk, histon H3 trimethylated lysine 27 was 52%De gevoeligheid van REpi-sequencing werd geanalyseerd om te meten hoeveel pieken van bulk ChIP-sequencing werden gedetecteerd door REpi-sequencing gereproduceerde reads. De gevoeligheid van REpi-sequencing was 55,30% in histon H3 geacetyleerd lysine 27 en 50,94% in histon H3 trimethylated lysine 27. Zorg ervoor dat u DNS-vrije reagentia gebruikt.

Ook moeten alle bewerkingen waarbij de openingsbuiskabels of reagenskabels betrokken zijn, worden uitgevoerd in een schone kap. DNA-producten van deze procedure worden gesequenced en vervolgens in kaart gebracht aan het genoom om te onthullen welke histonmodificaties aanwezig zijn, in welke regio's van het genoom in afzonderlijke cellen. Deze technologie maakte het mogelijk om meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel te analyseren en maakte de weg vrij voor multiomics-analyse in elke enkele cel.