Neutronenkristallografie Gegevensverzameling en -verwerking voor het modelleren van waterstofatomen in eiwitstructuren
December 1st, 2020
Neutroneneiwitkristallografie is een structurele techniek die de lokalisatie van waterstofatomen mogelijk maakt, waardoor belangrijke mechanistische details van de eiwitfunctie worden verstrekt. We presenteren hier de workflow voor het monteren van een eiwitkristal, neutronendiffractiegegevensverzameling, structuurverfijning en analyse van de neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten.
Neutronenkristallografie is een structurele techniek voor het bepalen van de positie van waterstofatomen in biologische macromoleculen. Neutronenstructuren onthullen protoneringstoestanden en oriëntaties van watermoleculen om reactiemechanismen en bindingsinteracties te verduidelijken. In tegenstelling tot röntgendiffractie heeft neutronendiffractie het voordeel dat het een niet-destructieve techniek is.
Eiwitten met fotogevoelige groepen of metallosensoren kunnen worden bestudeerd zonder schade door straling te ondervinden. Om neutroneneiwitkristallografie uit te voeren, worden grote kwetsbare eiwitkristallen gemonteerd in kwarts capillairen voor gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Monteren van kristallen in capillairen wordt niet routinematig uitgevoerd, waardoor de demonstratie van deze techniek leerzaam is.
Voor het oogsten van kristallen, opent u de verzegeld zandwieksbox die de eiwitkristallen bevat in een negen-wel grote volume siliconiseerd glazen plaat en gebruik een micropipet om 10 tot 20 microliter van de kristalisatie reservoiroplossing over te brengen naar een glazen plaatje. Evalueer de kristallen met een microscoop. Gebruik een geschikte grootte microloop om een kristal te oogsten en plaats het kristal in de druppel reservoiroplossing.
Voor het monteren van kristallen, neem een kwarts capillair met een diameter van twee millimeter en een lengte van vijftig millimeter, zuig reservoir buffer op met een pipet en vul een uiteinde van het capillair met reservoir buffer. Gebruik een montageloop om het kristal voorzichtig in de reservoir buffer binnen het kwarts capillair te plaatsen. Tik op de buis om de reservoir buffer en het kristal door het capillair te bewegen en gebruik een lange dunne pipet om de oplossing rond het kristal af te zuigen.
Gebruik een dunne papieren veeuw om het kristal voorzichtig te drogen en de capillaire wanden te drogen en voeg 20 tot 50 microliter gedeutereerd buffer oplossing toe aan het uiteinde van het capillair. Gebruik een hitte stok om een deel van bijenwas te smelten en steek het capillair voorzichtig in de gesmolten bijenwas totdat een luchtdichte afdichting is gevormd. Vervang de gedeutereerd buffer met 20 tot 50 microliter vers gedeutereerd buffer op dagen twee, zes en tien na kristalmontage en verzegel de capillair opnieuw met vers gesmolten bijenwas na elke dampuitwisseling zoals gedemonstreerd.
Na minimaal twee weken dampuitwisseling, gebruik putty om de kwarts capillair vast te zetten op de IMAGINE neutronen diffractometer goniometer steek die is bevestigd aan de instrument steek en laat de steek en het monster zakken in het neutronenbundel en detector gebied. Open het gegevensverzameling programma op de Beamline controlecomputer en klik op het setup tabblad om de gegevensverzameling strategie in te stellen en voer de experiment parameters in inclusief instrument naam en de naam van de afbeeldingen die moeten worden verzameld. Klik op het verzamel tabblad en voer de gegevensverzameling parameters in inclusief de belichtingstijd en het aantal frames dat moet worden verzameld.
Klik binnen de optica grafische gebruikersinterface op 2.78 voor de lambda minimum en 4.5 voor de lambda maximum om de quasi bereik voor de gegevensverzameling in te stellen. Klik op start scan om de gegevensverzameling te starten. Na neutronengegevensverzameling, verzamel een corresponderend röntgendataset op hetzelfde kristal op dezelfde temperatuur.
Voor de cryo gegevensverzameling, verwijder de reservoiroplossing uit de sandwieksbox en vul de sandwieksbox met gedeuteerde reservoir bufferoplossing, laat een week lang gelijkwaardig worden en herhaal dit drie keer. Na nog drie rondes van reservoiroplossing uitwisseling, oogst het kristal met een microloop en dompel het kristal twee uur lang onder in een cryoprotectant oplossing voordat het kristal in een microloop wordt gemonteerd die is bevestigd aan een cryo kristalmontage. Dompel het gemonteerde kristal en de cryo montage in vloeibare stikstof.
Wanneer het kristal bevroren is, monteer het kristal op de macromoleculaire neutronen diffractometer steek die is voorzien van een cryo stroom. Controleer dat het kristal is gemonteerd en gecentreerd voor gegevensverzameling, vul de voorstel informatie in en klik op het mappictogram om de gegevensverzameling strategie tabel te laden, klik vervolgens op verzenden om de gegevensverzameling te starten. Gediffracteerde neutronen worden in real time zichtbaar wanneer ze worden gedetecteerd door de MaNDi tijd-van-vlucht detectoren.
Voor gezamenlijke röntgen en neutronen gegevensverfijning, open eerst CCP4 en selecteer converteren om de MTZ programma te wijzigen om de R free gegevensvlaggen van de neutronen gegevens aan te passen aan die van de röntgen gegevens. Importeer het neutronen gegevens reflectiebestand in MTZ formaat. Selecteer importeer vrije R gegevens uit een ander MTZ bestand en importeer het röntgen MTZ bestand.
Naam de nieuwe overeenkomende MTZ bestand en klik op uitvoeren. Open vervolgens de Phoenix softwarepakket en klik onder verfijning op klaar instellen. Upload het eiwit coördinatenbestand, selecteer om waterstofatomen toe te voegen aan het model indien afwezig en selecteer HD op verwisselbare locaties, H elders uit het vervolgkeuzemenu.
Selecteer het toevoegen van deuterium aan oplosmiddel moleculen en klik op uitvoeren om te beginnen. Voor structuurverfijning, open in het verfijning tabblad het phoenix. verfijn programma om de verfijning op te zetten met behulp van zowel de röntgen als de neutronen gegevens.
In het configureer tabblad, voer het PDB bestand in van de opgeloste röntgen structuur. Upload het MTZ bestand van de neutronen gegevens. Wijs de MTZ bestand gegevens toe als neutronen gegevens in neutron R free.
Upload het MTZ bestand van de röntgen gegevens en wijs het toe als röntgen gegevens en röntgen R free. Onder verfijning instellingen, bevestig dat de standaard verfijning strategie is geselecteerd en verhoog het aantal cycli naar vijf. Selecteer alle parameters, geavanceerd en waterstofatomen.
Verander het waterstof verfijning model naar individueel en zet het force riding ADP uit, vervolgens zoek naar nucleair. Selecteer gebruik de nucleaire afstanden van X-HD. Klik op uitvoeren om de verfijning te starten.
Voor modelbouw in Phoenix, klik op open in Coot. In Coot, visualiseer de röntgen elektronendichtheid en neutronen verstrooiingslengtedichtheid ka
Overzicht
Neutronen-eiwitkristallografie is een structurele techniek die de lokalisatie van waterstofatomen in eiwitten mogelijk maakt en cruciale inzichten biedt in hun functie. Dit artikel schetst de workflow voor het monteren van eiwitkristallen, het verzamelen van neutronendiffractiegegevens en het analyseren van de resulterende kaarten.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Neutronenkristallografie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Neutronenkristallografie helpt bij het bepalen van waterstofatoomposities in biologische macromoleculen.
- Deze techniek onthult protoneringstoestanden en oriëntaties van watermoleculen.
- Het is niet-destructief, waardoor het geschikt is voor gevoelige eiwitten.
- Kristalmontagetechnieken worden niet routinematig uitgevoerd, waardoor deze demonstratie waardevol is.
Doel van de studie
- Om het proces van neutronen-eiwitkristallografie te demonstreren.
- Om een gedetailleerde workflow te bieden voor gegevensverzameling en analyse.
- Om de voordelen van neutronendiffractie ten opzichte van röntgendiffractie te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Het monteren van eiwitkristallen in kwartscapillairen.
- Het verzamelen van neutronendiffractiegegevens met behulp van een goniometer.
- Het uitvoeren van gegevensverfijning met zowel neutronen- als röntgengegevens.
- Het gebruiken van software voor modelbouw en visualisatie van dichtheidskaarten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle montage en gegevensverzameling van neutronendiffractie-experimenten.
- Demonstratie van de workflow voor gezamenlijke röntgen- en neutronen gegevensverfijning.
- Visualisatie van neutronenverstrooiingslengtedichtheidskaarten.
- Inzichten in de structurele details van eiwitten verkregen door deze methode.
Conclusies
- Neutronen-eiwitkristallografie is een krachtig hulpmiddel voor structurele biologie.
- De techniek biedt unieke inzichten in eiwitfunctie en interacties.
- Juiste methodologie is cruciaal voor succesvolle gegevensverzameling en analyse.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Neutron crystallography enables direct visualization of hydrogen atom positions in protein structures, providing mechanistic clarity on protonation and hydration states critical for drug discovery. This capability addresses a key gap left by X-ray diffraction, especially for targets with photosensitive cofactors or metal centers. Integrating neutron data into early discovery workflows enhances predictive confidence and de-risks mechanistic hypotheses across the portfolio.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct mapping of hydrogen atoms clarifies catalytic mechanisms and functional group orientations.
- Protonation state assignment supports mechanistic de-risking and target validation.
- Hydrogen bond network visualization informs structure-based drug design and ligand optimization.
Screening & Assay Development
- Preparation of deuterated, hydrogenated crystals enables reproducible structural interrogation.
- Joint X-ray/neutron refinement produces all-atom models for downstream computational screening.
- Quantitative neutron scattering length density maps support assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic insights from neutron data inform preclinical model selection and biomarker alignment.
- Structural elucidation of labile intermediates supports translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Hydrogen/deuterium exchange analysis aids in understanding solvent interactions relevant to in vivo conditions.
Pipeline & Workflow Integration
Neutron crystallography integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing atomic-level mechanistic data that complements X-ray structures and informs lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of protonation and hydrogen bonding in active sites.
- Screening: Supplies validated structural templates for computational and experimental screening.
- Analytics: Delivers quantitative SLD maps for comparative analysis of functional states.
- Translational Research: Supports mechanistic continuity and biomarker strategy development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for high-value, mechanistically complex targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes crystal handling, mounting, and data collection for reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of structurally complex or mechanistically ambiguous targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in large crystal growth, handling, and mounting for neutron diffraction.
- Access to specialized neutron beamlines and advanced data processing infrastructure is essential.
- Cross-team standardization of data formats and refinement protocols is needed for joint X-ray/neutron analysis.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of deuteration and cryo-handling steps.
- Crystal fragility and size requirements may limit throughput and target selection.
