Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

Welkom bij het protocol van high-throughput transcriptoomanalyse voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties. Dit protocol is onderverdeeld in de volgende stappen. Kwaliteitscontrole om leesbewerkingen van lage kwaliteit te filteren en ook om adaptersequenties sequencing en annotaties te verwijderen, waar moet je de reads in kaart brengen in een referentiegenomen en de reads in de genen annoteren.

Statistische en co-expressie analyse, die de differentieel tot expressie gebrachte genen definieert en ook de co-expressiemodules vindt. Moleculaire mate van perturbatieanalyse om potentiële uitschieters te vinden. En ten slotte de functionele analyse om de biologische functies van differentieel tot expressie gebrachte genen te bepalen.

Alle tools die deze pijplijnen gebruikten, waren vooraf geïnstalleerd in een Linux-systeem en ingekapseld in een Docker-container. De monsters die deze protocollen gebruiken, zijn afgeleid van een paper gepubliceerd door onze groep in PLOS Pathogen. De monsters omvatten 20 gezonde mensen en 39 patiënten besmet met het Chikungunya-virus.

De bloedmonsters werden verzameld en RNA-sequencing werd uitgevoerd. Om Docker in Windows-systeem te installeren, moet u deze stappen volgen. Ga naar de officiële webpagina van Docker en klik op Aan de slag.

Zoek het installatieprogramma voor Docker Desktop voor Windows. Download het bestand. Installeer lokaal in uw computer.

Zorg ervoor dat deze twee opties zijn gemarkeerd. Nadat u het programma hebt geïnstalleerd, downloadt u de Docker-installatiekopie voor dit protocol. Ga naar de Windows-terminal.

Voer de opdrachten uit om de afbeelding te downloaden. Na het downloaden van de afbeelding kunt u het bestand op het Docker-bureaublad zien en vanuit deze afbeelding kunnen we de container starten. Nadat u op de ronde knop hebt geklikt, moet u de oorspronkelijke parameters en opties uitvouwen om de naam van de container te definiëren en een map op uw lokale computer te koppelen aan de map in Docker.

Hierna klikt u op Uitvoeren om de container te starten. U hebt dan toegang tot de terminal, die zich in het Linux-systeem in de Docker bevindt. Typ de bash-opdrachten en vervolgens kunt u alle opdrachten van dit protocol uitvoeren.

Eerst moeten we de bron uitvoeren om alle tools van dit protocol beschikbaar te maken. U moet toegang krijgen tot de directoryscripts. Om een transcriptomische analyse uit te voeren, moet u eerst het referentiegenoom downloaden.

Hiervoor moet u de volgende opdrachten uitvoeren. Nadat het genoom is gedownload, moet je de annotatie van de genen downloaden. Om dit te doen, moet u de volgende opdrachten typen.

Vervolgens moet u de fastq-dump configureren. Hiermee kunt u de sequencingbestanden van de voorbeelden downloaden. Nadat u de volgende opdrachten hebt getypt, moet u de Tab-knop gebruiken om naar de optie Extra te gaan en de map met optiesstromen te markeren.

Gebruik de Tab-knoppen om op te slaan en vervolgens ok. En verlaat vervolgens de tool fastq-dump. Nu kunnen we de downloads van de reads starten door de volgende opdrachten te typen.

De kwaliteitscontrole bestaat uit en evalueert grafisch de kans op fouten in de sequencing reads. In deze stap moet u ook de technische sequenties zoals adapters verwijderen. Om de kwaliteitscontrolegrafieken te genereren, moet u het FastQC-programma uitvoeren.

Als u de adapterreeksen en de reeksen van lage kwaliteit wilt verwijderen, moet u de volgende opdrachten typen. Met de goede kwaliteit metingen moeten we nu de metingen in het referentiegenoom in kaart brengen. Na het in kaart brengen moeten we de genen annoteren volgens de menselijke genen en vervolgens het aantal metingen tellen dat overeenkomt met elk menselijk gen.

De eerste stap is het indexeren van het referentiegenoom door het volgende commando te typen. En dan typen we deze commando's om de metingen in het menselijk genoom in kaart te brengen. Vervolgens moet u de scripts uitvoeren die de reads annoteren.

Na het in kaart brengen en annoteren, kunt u de differentiële expressieanalyse uitvoeren die bestaat uit het vinden van de genen waarvan de expressie hoger of lager is in de ene groep in vergelijking met de andere. Om de differentieel tot expressie gebrachte genen of DEG's te identificeren, moet u de volgende opdrachten uitvoeren. Hierna kunt u de gegevensresultaten van de Docker naar uw lokale computer overbrengen.

Ga hiervoor naar de terminal en typ de volgende opdrachten om alle resultaten op te slaan in een lokale map. Om de resterende analyse uit te voeren, moet u ook alle bestanden van de mapgegevens naar een map op uw lokale computer kopiëren. Op uw lokale computer kunt u de mappen zien waarin u de gegevens van Docker hebt opgeslagen.

Zoals u kunt zien, hebt u toegang tot alle bibliotheken. U kunt ook het HTML-bestand openen dat de kwaliteitscontrolerapporten bevat. U kunt ook toegang krijgen tot een map met de differentieel tot expressie gebrachte genen.

En in deze directory vindt u de vulkaanplots waar u de genen kunt zien die omhoog of omlaag zijngerreguleerd in de ene groep versus de andere, in dit geval patiënten die zijn geïnfecteerd met het Chikungunya-virus versus gezonde controles. Alle resterende stappen van dit protocol worden uitgevoerd in webtools met behulp van uw browser. Laten we eerst beginnen met CEMiTool.

Ga naar de browser en typ het volgende adres. CEMiTool identificeert co-expressiemodules uit expressiegegevenssets die door de gebruikers worden geleverd. Op de hoofdpagina kunt u naar het menu gaan en op de knop Uitvoeren klikken.

Hiermee wordt een nieuwe pagina geopend waar u het expressiebestand kunt uploaden. Dit bestand bevindt zich in de mapgegevens van uw lokale computer. U zult zien dat er drie expressiebestanden zijn, en degene die we gaan gebruiken voor de CEMiTool is een normalisatie-oproep tmm.

Vervolgens moet je het fenodata-bestand selecteren, hetzelfde voor het bestand met de eiwit-eiwitinteracties, en ten slotte het bestand uploaden dat de genensets of paden bevat. Het genensetbestand stelt CEMiTool in staat om verrijkingsanalyses uit te voeren voor elk van de co-expressiemodules. Vervolgens moet u het parametergedeelte uitvouwen en op VST toepassen klikken.

Daarna kunt u gewoon klikken CEMiTool uitvoeren. Nadat u CEMiTool hebt uitgevoerd, ziet u dat 12 co-expressiemodules zijn geïdentificeerd. Door hier te klikken, kunt u alle resultaten van deze analyse downloaden.

Een ander hulpmiddel dat we in dit protocol gaan gebruiken, is MDP, of moleculaire mate van verstoring. Typ gewoon in uw browser mdp.sysbio.tools. MDP berekent de moleculaire afstand van elk monster in vergelijking met een referentiegroep van monsters, in dit geval de gezonde controles, om niet alleen potentiële uitschieters te vinden, maar ook hoe verstoord elk monster is in vergelijking met deze groep.

Op de pagina Uitvoeren kunt u het expressiebestand uploaden door op de knop te klikken en het bestand te selecteren. Vervolgens moet u het fenodata-bestand uploaden. Vervolgens moet u definiëren welke kolom de informatie over de groep of de klasse bevat en vervolgens welke klasse of groep overeenkomt met de controlegroep.

Hierna kunt u gewoon MDP uitvoeren. Het staafdiagram toont voor elk van de monsters als een staaf de score van de moleculaire mate van verstoring en de kleuren vertegenwoordigen de verschillende groepen. En de box plot is een andere manier om dezelfde resultaten te visualiseren waar je op elke stip ziet dat er een ander voorbeeld is, gescheiden door twee groepen.

Om de functionele analyse uit te voeren, gaan we de Enrichr-tool gebruiken. Hiervoor moet je de lijst met genen selecteren die differentieel tot expressie zijn gebracht, omhoog of omlaag, en deze gebruiken als een invoergenlijst in Enrichr-tool. U zult zien dat er verschillende tabbladen zijn.

Alle resultaten kunnen ook worden gedownload naar uw lokale computer. De computeromgeving voor transcriptoomanalyse is op het Docker-platform geplaatst. Met deze aanpak kunnen gebruikers zonder eerdere ervaring met linux-systeem een terminal gebruiken.

In deze container is er een vooraf gedefinieerde mappenstructuur voor gegevensset en scripts die nodig zijn voor alle analyses. In de pijplijn zullen gebruikers bloedtranscriptoomgegevens gebruiken van 20 gezonde personen en 39 patiënten die acuut zijn geïnfecteerd met het Chikungunya-virus. Het sequencingplatform retourneert een set FASTQ-bestanden die de DNA-sequentie bevatten, d.w.z.

de aflezingen en de bijbehorende kwaliteit voor elke nucleotidebasis. De Phred-kwaliteitsschaal geeft de waarschijnlijkheid van een onjuiste meting voor elke basis aan. Hulpprogramma's identificeren en verwijderen leesbewerkingen van lage kwaliteit uit monsters en verhogen de kans op toewijzingsleesbewerkingen.

In deze stap, de mapping module, worden de hoogwaardige reads hersteld gebruikt als input om ze uit te lijnen met het menselijke referentiegenoom. CEMiTool identificeert en analyseert co-expressie modules. Genen binnen dezelfde module worden mede tot expressie gebracht, wat betekent dat ze vergelijkbare expressiepatronen vertonen in de monsters van de datasets.

De netwerkanalyse geeft informatie over de meest verbonden genen, d.w.z. de hubs. De namen van die genen worden getoond in het netwerk.

De grootte van de knooppunten is evenredig met de mate van connectiviteit. De resultaten van de DEG-analyse werden samengevat in de vulkaanplots. De analyse van de moleculaire mate van verstoring maakt de identificatie van verstoorde monsters van gezonde en geïnfecteerde personen mogelijk.

MDP suggereert welke monsters potentiële biologische uitschieters zijn. Het verwijderen van die monsters heeft invloed op de stroomafwaartse resultaten. Een functionele verrijkingsanalyse met behulp van AURA kan worden uitgevoerd met de Enrichr-tool.

Deze stappen helpen om de resultaten te interpreteren door gemeenschappelijke functionele rollen van verschillende genen te onthullen die differentieel tot expressie kwamen. Het biologische proces dat in de staafdiagrammen wordt getoond, is de top 10 verrijkte genensets op basis van hun p-waarderangschikking. Kortom, deze protocollen omvatten alle stappen van RNA-Seq-analyse.

De pijplijn werd ontwikkeld en ingekapseld in het niet-commerciële systeem docker. Op een afbeelding en beschikbaar gesteld voor de wetenschappelijke gemeenschap. Door het containersysteem vallen alle scripts en tools onder dezelfde specifieke versie om reproduceerbaarheid te garanderen.

Verder werd een deel van de bioinformatica-analyse uitgevoerd via gratis gebruiksvriendelijke webtools.