Gebruiksvriendelijke, high-throughput en volledig geautomatiseerde data-acquisitie software voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje
July 29th, 2021
Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje vereist een geschikt softwarepakket en een gebruiksvriendelijke pijplijn voor automatische data-acquisitie met hoge doorvoer. Hier presenteren we de toepassing van een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie, Latitude-S, en een praktische pijplijn voor het verzamelen van gegevens van verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.
Geautomatiseerde data-acquisitiesoftware is uiterst noodzakelijk voor het verzamelen van enorme hoeveelheden cryogegevens voor structurele karakterisering van biologische macromoleculess. Automated Data Acquisition Software-pakket werd hier gebruikt om de structuur van verschillende biologische macromoleculess te karakteriseren, die direct geassocieerd zijn met pathogene biologie. Bijvoorbeeld mycobacterium, HIV en SASCO 2.
Start om te beginnen de Geautomatiseerde software voor geautomatiseerde gegevensverzameling van Latitude-S door in het startmenu op DigitalMicrograph te klikken. Selecteer vervolgens Techniekbeheer en vervolgens het pictogram Latitude-S voor geautomatiseerde gegevensverzameling met één deeltje. Als u een sessie wilt maken op basis van de instellingen van de vorige sessie, schakelt u het selectievakje Op basis van vorige sessie in het palet in en selecteert u de nieuwe knop of drukt u op de knop Doorgaan om door te gaan.
Om een geheel nieuwe sessie te starten, klikt u op het nieuwe tabblad in het palet. Kies de map met de sessie die moet worden voortgezet en selecteer de map waarin u de gegevens wilt opslaan. Klik vervolgens op het instellingspictogram en in het vak beheerde status verkennen dat verschijnt, voegt u de status toe, stelt u de TEM-voorwaarde, cameravoorwaarde en afbeeldings- of stockoptie in.
En geef vervolgens de status een naam of open het overzicht van de statusinstellingen om de opslaginstellingen te openen. Configureer vervolgens de Atlas-status door op het atlasstatuspalet te klikken en de parameters voor vergroting, verlichtingsomstandigheden en camerabelichtingstijd in te stellen en klik op volgende om naar de volgende status te gaan. Configureer vervolgens de rasterstatus door op het rasterstatuspalet te klikken, stel de parameters in voor microscoopbeeldvormingsoptiek, verlichtingsomstandigheden en camerabelichtingstijd en klik op Volgende.
Configureer de gatstatus door op het gatenpalet te klikken en stel de parameters voor beeldoptica, verlichtingsomstandigheden, binning en belichtingstijd van de camera in. Nadat u op Volgende hebt geklikt, configureert u de volgende focusstatus door op het scherpstelpalet te klikken en stelt u de microscoopinstellingen in voor beeldoptica, verlichtingsomstandigheden, binning en belichtingstijd van de camera. Richt je vervolgens op het amorfe koolstofgebied in de buurt van het gat en klik ernaast om naar de volgende toestand te gaan.
Configureer de gegevensstatus door op het gegevenspalet te klikken en de parameters voor microscoopinstellingen in te stellen en klik vervolgens op Volgende. Klik op het focusconfiguratiepalet met het bereik van onscherpe waarden en de stapgrootte op het gegeven tabblad en druk op de volgende knop om naar de volgende stap te gaan. Focus op de vereiste functies op het raster en klik op de opnameknop.
Plaats vervolgens het rode kruisteken op dezelfde functie op elke afbeelding van verschillende staten. Begin met focus-, gegevens- en gatstatussen, omdat het gezichtsveld groter is dan de atlas- en rasterstatussen. Zoom vervolgens in op Atlas- en Rasterstatussen om het rode kruisteken op dezelfde functie te plaatsen.
Als u de posities en offset tussen elk van de vijf verschillende toestanden wilt berekenen en de posities en verschuivingen wilt weergeven in het uitvoervenster, klikt u op de knop Berekenen. Klik op capture palette en kies de grootte van de Atlas om het gehele raster of een deel van het raster te bedekken op basis van de vereiste. Om de Atlas vast te leggen, navigeert u op de Atlas en selecteert u het rastervierkant op basis van de ijsdikte.
Zodra de gewenste rastervierkanten zijn geselecteerd, klikt u op de knop Plannen en ziet u hoe de tegels in het rasterplein zich vullen terwijl elk rastervierkant wordt vastgelegd. Zodra op de planningsknop is geklikt, selecteert u een representatief gat in het rastervierkant door de positie van het gat toe te voegen. Zodra de gatafbeelding is verkregen, definieert u de gegevens en focusposities en slaat u de lay-out op als een sjabloon.
Klik op automatisch zoeken, voer de gatgrootte in en klik op de zoekknop in het programma om de gaten automatisch te vinden op basis van de diameter. Stel de intensiteit in om de gaten van het rastervierkant en ijsverontreiniging te verwijderen. En nadat u de geselecteerde en gele markeringsgereedschappen hebt toegevoegd via automatisch zoeken, klikt u op de knop Plannen in breedtegraadtaken.
Volgens de eerste handmatige screening van bewegingsgecorrigeerde micrografieën met behulp van cisTEM-software, bleken de meeste gegevens zich binnen het gewenste signaalbereik te bevinden. Bovendien werden beelden die werden verzameld bij onscherpe bereiken, ook handmatig gecontroleerd door cisTEM. De spikedeeltjes werden handmatig gekozen om de 2D-klassegemiddelden voor structurele visualisatie te berekenen, wat sterk suggereerde, maar structurele karakterisering met hoge resolutie was mogelijk met behulp van de respectieve dataset.
De 3D-classificatie gaf aan dat Spike Protein 1RBD in up open bevestiging heeft en alle andere RBD in down close confirmation. De 1RBD-up open bevestigingen van het Spike-eiwit werden gereconstrueerd met behulp van C1-symmetrie. De Spike Protein-kaart wordt weergegeven in de bovenste en onderste zijaanzichten.
En de EM-kaart is uitgerust met een atomaire structuur voor een betere visualisatie van de zijketens. De RBD down close bevestigingen werden verfijnd met C3 symmetrie en de spike 3D verfijnde model en EM kaart, uitgerust met atomaire structuur zoals getoond. En tussentijdse bevestiging van het Spike-eiwit geïdentificeerd als het S2-subdomein gaf de zijketens van individuele aminozuurresiduen aan.
De resultaten suggereerden dat Latitude-S cryo EM-gegevens met hoge resolutie van biologische macromoleculen kan verzamelen. Deze geautomatiseerde gegevensverzamelingssoftware kan worden gebruikt voor elk ander elektronenmicroscopiesysteem om gegevens automatisch te verzamelen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt de implementatie van Latitude-S, een geautomatiseerde data-acquisitiesoftware voor cryo-elektronenmicroscopie. Het benadrukt het belang van een gebruiksvriendelijke pijplijn voor high-throughput dataverzameling van biomoleculen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cryo-elektronenmicroscopie
- Structurele biologie
- Geautomatiseerde data-acquisitie
Achtergrond
- Cryo-elektronenmicroscopie van enkelvoudige deeltjes is cruciaal voor structurele karakterisering.
- Geautomatiseerde software is noodzakelijk voor efficiënte dataverzameling.
- Gevitrificeerd biomoleculen vereisen beeldvorming onder laag-dosis omstandigheden.
- Pathogeen biologie is een belangrijk toepassingsgebied.
Doel van het onderzoek
- Om een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie te presenteren.
- Om een praktische pijplijn voor dataverzameling te vestigen.
- Om de efficiëntie van cryo-elektronenmicroscopie workflows te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van Latitude-S software voor geautomatiseerde data-acquisitie.
- Configuratie van sessies op basis van eerdere instellingen.
- Laag-dosis beeldvormingstechnieken voor biomoleculen.
- Karakterisering van verschillende biologische macromoleculen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implementatie van Latitude-S voor high-throughput dataverzameling.
- Effectieve karakterisering van structuren gerelateerd aan pathogenen zoals mycobacterium en HIV.
- Streamlined workflow voor geautomatiseerde dataverzameling.
- Aangetoonde capaciteit van de software in laag-dosis omstandigheden.
Conclusies
- Latitude-S verbetert aanzienlijk de efficiëntie van cryo-elektronenmicroscopie.
- Geautomatiseerde data-acquisitie is essentieel voor structureel biologisch onderzoek.
- De software vergemakkelijkt de studie van belangrijke biologische macromoleculen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Automated data acquisition in cryo-EM enables high-throughput structural characterization of pathogen-associated macromolecules, supporting target validation and lead identification in early discovery. The Latitude-S software streamlines workflow efficiency, reducing manual intervention and increasing data reproducibility for structural biology teams. This capability enhances predictive confidence in mechanistic de-risking by providing reliable, quantitative structural data for infectious disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-resolution structural visualization of pathogen proteins like SARS-CoV-2 spike.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying conformational states and functional mechanisms of macromolecular targets.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by delivering atomic-resolution data that informs target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating consistent, high-quality cryo-EM datasets.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fully automated imaging under controlled low-dose conditions.
- Scalability: Enables screening readiness and platform reuse, as demonstrated by acquisition of ~3,000 movie images in a single 48-hour session.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation by providing structural insights into pathogen biology.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by identifying conformational states (e.g., 1-RBD up/open and all RBD down/closed) that inform functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects structural data to decision-making for target prioritization in antiviral development programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, where structural data informs hit-to-lead progression and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling structural characterization of macromolecular complexes involved in pathogen entry and replication.
- Screening: Describes assay readiness through automated, high-throughput data collection that yields quantitative, reproducible outputs for downstream analysis.
- Analytics: Highlights measurements such as defocus values, image quality metrics, and 3D classification outputs that enable comparison of structural states and conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via structural models that inform functional assays and biomarker alignment for pathogen targets.
- Enterprise Reuse: Frames the software as a reusable capability across multiple targets and projects, reducing redundancy in data acquisition setup.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in structural studies of pathogenic macromolecules.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data acquisition across sessions and users.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early structural insights.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on high-confidence structural data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cryo-EM operation, software configuration, and structural data interpretation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 200 keV cryo-TEM, direct electron detector, and computing resources for image processing.
- Cross-team standardization requirements for session templates, parameter settings, and data naming conventions.
- Adaptation considerations across model systems, including vitrified samples of varying size, symmetry, and stability.
- Practical limitations include dependency on sample quality, ice thickness, and initial manual screening for motion correction and particle picking.
