Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol
19 oktober 2021
Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.
Dit protocol pakt de moeilijkheden en uitdagingen met micro-injecterende larven aan door een nauwkeurige methode te beschrijven die het gebruik van Drosophila melanogaster-larve mogelijk maakt als model voor verschillende immuun- en moleculaire studies. Dit is een eenvoudige injectietechniek die een efficiënte, kosteneffectieve en snelle methode biedt om herhaaldelijk een verscheidenheid aan stoffen op een uniforme manier af te leveren, wat consistente en betrouwbare resultaten mogelijk maakt. Begin met het selecteren van larven uit het derde instar-stadium en was ze met de oplossing van Ringer in een kleine petrischaal.
Doe een filtreerpapier in een petrischaaltje en bevochtig het met 5 ml Ringer's solution. Plaats vervolgens de larven op het filterpapier. Bereid haarvaten voor met behulp van 3,5"-glazen capillaire buisjes in een micropipette-trekker.
Open het glazen capillair met behulp van een rechte gekartelde middenpuntstang. Vul het open capillair met minerale olie met een plastic wegwerpspuit. Werp vervolgens de olie uit de capillaire buis met een nanoliter-injector.
Vul het capillair met het gewenste bacteriële preparaat voor injectie. Breng de verdoofde larven over op een filterpapier bevochtigd met ringer's oplossing. Oefen met een tang stevige druk uit op de dorsale kant van het achterste uiteinde van de larven, waar de tracheale spiracles zichtbaar zijn.
Steek vervolgens de naald horizontaal in, naar het achterste uiteinde van de larven, en injecteer de bacteriële voorraden. Verwijder de tang om morsen van hemolymfe of darm te voorkomen. Trek vervolgens de naald terug die eerder in larven is ingebracht.
Infecteer 20 larven voor elke experimentele aandoening. Breng met een penseel de geïnjecteerde larven voorzichtig over op een apart vochtig filterpapier. Voeg de oplossing van Ringer indien nodig toe om uitdroging te voorkomen.
Incubateer de petrischaal in een couveuse bij 25 C.Drosophila melanogaster larven geïnfecteerd met Photorhabdus asymbiotica vertoonden een overlevingspercentage van 57% gedurende 24 uur na injectie, terwijl larven geïnjecteerd met Escherichia coli een overlevingspercentage van 85% vertoonden op hetzelfde moment. Het belang van deze methode is dat de naald ongeveer parallel aan de larve wordt gehouden. De druk die wordt uitgeoefend om de larve vast te houden is zeer gering, wat de kans op hemolymfelekkage, dodelijk letsel of onvoldoende afgifte van de gewenste stof vermindert.
Deze techniek kan met oefening worden geperfectioneerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een injectietechniek voor larven van Drosophila melanogaster, bedoeld om het gebruik van larven in immuun- en moleculaire studies te vergemakkelijken. De methode pakt de uitdagingen bij het micro-injecteren van larven aan en biedt een betrouwbare aanpak voor de toediening van stoffen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Microbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een veelgebruikt modelorganisme.
- Het begrijpen van aangeboren antimicrobiële immuunresponsen is cruciaal.
- Larvale stadia bieden aanvullende inzichten in strategieën van microbiële infecties.
- Microinjectietechnieken zijn essentieel voor experimentele consistentie.
Doel van de studie
- Om D. melanogaster-larven te promoten als modelsysteem.
- Om een gedetailleerde methode te bieden voor micro-injectie in larven.
- Om de betrouwbaarheid van immuun- en moleculaire studies te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Selecteer larven in het derde stadium voor injectie.
- Was de larven met Ringers-oplossing.
- Bereid capillairen voor met behulp van glazen capillairbuisjes.
- Injecteer de stoffen gelijkmatig in de larven.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt een efficiënte toediening van stoffen mogelijk.
- De resultaten zijn consistent en betrouwbaar over verschillende experimenten heen.
- Kosteneffectieve methode die geschikt is voor diverse studies.
- Faciliteert het onderzoek naar immuunresponsen in larven.
Conclusies
- De techniek van larvale injectie is een waardevol instrument voor onderzoekers.
- Het breidt de bruikbaarheid van D. melanogaster in wetenschappelijke studies uit.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode benutten voor diepgaandere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Larven van Drosophila melanogaster bieden een kosteneffectief, genetisch hanteerbaar model voor het bestuderen van aangeboren immuniteit en gastheer-pathogeeninteracties, waardoor validatie van targets in een vroeg stadium mogelijk is met een verminderde ethische en financiële belasting. Het injectieprotocol voor larven verbetert de reproduceerbaarheid in assays voor immuunrespons, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie van antimicrobiële en immunomodulerende kandidaten. Deze aanpak slaat een brug tussen ontdekkingsbiologie en preklinische evaluatie door kwantificeerbare overlevings- en infectiegegevens te leveren in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & validatie van doelen
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot aangeboren immuunroutes en virulentiemechanismen mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbaar systeem voor functionele target-validatie met behulp van microbiële challenge-modellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het genereren van kwantitatieve infectie- en overlevingsgegevens voor de beoordeling van lead-verbindingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Levert gestandaardiseerde procedures voor de preparatie en injectie van larven voor een consistente blootstelling aan stoffen.
- Kwantitatieve output: Maakt het mogelijk om overlevingspercentages en de pathogenenlast te meten als afhankelijke variabelen in screeningscampagnes.
- Reproduceerbaarheid: Vermindert technische variabiliteit door gecontroleerde injectiemechanismen en omgevingscondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert menselijk relevante aangeboren immuunresponsen op bacteriële pathogenen zoals Photorhabdus asymbiotica en Escherichia coli.
- Translationele continuïteit: Faciliteert de overgang van target-hitvalidatie naar preklinische effectiviteitstesten in de context van het gehele organisme.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt gastheerdefensiepaden en de bijdragen van virulentiefactoren voorafgaand aan studies bij zoogdieren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode voor injectie in larven past binnen het continuüm van vroege ontdekking, ondersteunt hypothese-gestuurde validatie van targets en maakt reproduceerbare assay-formaten mogelijk voor het screenen van verbindingen voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de functionele validatie van immuungerelateerde targets via gecontroleerde pathogenen-challenge in larven.
- Screening: Genereert dosis-responswerking en overlevingsgegevens die geschikt zijn voor high-content screening van immunomodulerende of antimicrobiële middelen.
- Analytics: Levert kwantitatieve overlevingsmetrieken (bijv. overlevingspercentages na 24 uur) die vergelijking tussen experimentele condities en behandelingen mogelijk maken.
- Translational Research: Vestigt een ziekte-relevant systeem voor het evalueren van de therapeutische impact op infectie-uitkomsten voorafgaand aan de overgang naar knaagdiermodellen.
- Enterprise Reuse: Vormt een gestandaardiseerd, kosteneffectief platform dat toepasbaar is op meerdere projecten binnen het onderzoek naar immunologie en infectieziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in gastheer-pathogeeninteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door gedefinieerde injectieparameters en omgevingscontroles.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege signalen van effectiviteit en toxiciteit in een model met het hele dier te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van overlevings- en infectieklaringgegevens.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van larven, anesthesie en microinjectietechnieken.
- Is afhankelijk van toegang tot micropipet-trekkers, nanoliter-injectoren en hulpmiddelen voor de preparatie van glazen capillairen.
- Vereist een gestandaardiseerde bereiding van de Ringer-oplossing en omgevingsincubatie bij 25°C voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het testen van verschillende microbiële stammen of substantieviscositeiten.
- Wordt beperkt door de grootte van de larven en beperkingen in het injectievolume, wat de afgifte van grote moleculen of particulate stoffen kan beperken.
