Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Dit protocol pakt de moeilijkheden en uitdagingen met micro-injecterende larven aan door een nauwkeurige methode te beschrijven die het gebruik van Drosophila melanogaster-larve mogelijk maakt als model voor verschillende immuun- en moleculaire studies. Dit is een eenvoudige injectietechniek die een efficiënte, kosteneffectieve en snelle methode biedt om herhaaldelijk een verscheidenheid aan stoffen op een uniforme manier af te leveren, wat consistente en betrouwbare resultaten mogelijk maakt. Begin met het selecteren van larven uit het derde instar-stadium en was ze met de oplossing van Ringer in een kleine petrischaal.

Doe een filtreerpapier in een petrischaaltje en bevochtig het met 5 ml Ringer's solution. Plaats vervolgens de larven op het filterpapier. Bereid haarvaten voor met behulp van 3,5"-glazen capillaire buisjes in een micropipette-trekker.

Open het glazen capillair met behulp van een rechte gekartelde middenpuntstang. Vul het open capillair met minerale olie met een plastic wegwerpspuit. Werp vervolgens de olie uit de capillaire buis met een nanoliter-injector.

Vul het capillair met het gewenste bacteriële preparaat voor injectie. Breng de verdoofde larven over op een filterpapier bevochtigd met ringer's oplossing. Oefen met een tang stevige druk uit op de dorsale kant van het achterste uiteinde van de larven, waar de tracheale spiracles zichtbaar zijn.

Steek vervolgens de naald horizontaal in, naar het achterste uiteinde van de larven, en injecteer de bacteriële voorraden. Verwijder de tang om morsen van hemolymfe of darm te voorkomen. Trek vervolgens de naald terug die eerder in larven is ingebracht.

Infecteer 20 larven voor elke experimentele aandoening. Breng met een penseel de geïnjecteerde larven voorzichtig over op een apart vochtig filterpapier. Voeg de oplossing van Ringer indien nodig toe om uitdroging te voorkomen.

Incubateer de petrischaal in een couveuse bij 25 C.Drosophila melanogaster larven geïnfecteerd met Photorhabdus asymbiotica vertoonden een overlevingspercentage van 57% gedurende 24 uur na injectie, terwijl larven geïnjecteerd met Escherichia coli een overlevingspercentage van 85% vertoonden op hetzelfde moment. Het belang van deze methode is dat de naald ongeveer parallel aan de larve wordt gehouden. De druk die wordt uitgeoefend om de larve vast te houden is zeer gering, wat de kans op hemolymfelekkage, dodelijk letsel of onvoldoende afgifte van de gewenste stof vermindert.

Deze techniek kan met oefening worden geperfectioneerd.