Absolute DNA-dichtheid in celkernen in kaart brengen met behulp van lokalisatiemicroscopie met één molecuul

De huidige methode maakt absolute DNA-dichtheidsmetingen in celkernen mogelijk om de ruimtelijke beperkingen in chromatinestructuren te onderzoeken die anders alleen worden gekenmerkt door post-translatie histonmodificaties. Voronoi-tessellatie in combinatie met SMLM maakt absolute dichtheidsschattingen van DNA mogelijk in termen van basenpaar per vierkante micrometer. De enige apriori kennis die nodig is, is het totale DNA-gehalte van de gemeten celkern.

In toekomstige experimenten zou het interessant zijn om te onderzoeken of absolute dichtheidsverschillen correleren met biologische informatie uit andere methoden, zoals immunofluorescentie van epigenetische modificaties of Hi-C-gegevens. Begin met het reconstrueren van het gescande gebied door de vooraf opgenomen afzonderlijke afbeeldingen naast elkaar te leggen. Open CellProfiler en laad vervolgens de pijplijn cellcycleanalysis.cpproj.

In de eerste stap afbeeldingen van de pijplijn, slepen en neerzetten de afbeeldingen, inclusief de referentieafbeelding. Definieer vervolgens een locatie waar de referentieafbeeldingen worden opgeslagen. Klik vervolgens op het pictogram Testmodus starten, gevolgd door Uitvoeren.

Zodra het histogram van de kernen in de te analyseren afbeelding wordt weergegeven, bepaalt u de intensiteitsintervallen voor de G1-, S- en G2-fasen en zorgt u ervoor dat deze worden ingevoerd in de volgende filterobjectstappen van de pijplijn en dat deze stappen actief zijn. Klik vervolgens nogmaals op de knop Uitvoeren om verder te gaan met de tweede helft van de pijplijn. Bekijk de drie afbeeldingen met de overlays die de verschillende stadia van de celcyclus vertegenwoordigen, G1, S of G2, en selecteer de kernen in G1 of G2 voor verdere beeldvorming, zodat de hoeveelheid DNA in basenparen van de beeldkernen bekend is.

Verplaats de cellen op de lokalisatiemicroscoop met één molecuul en zorg ervoor dat het FPALM-proces goed knippert. Neem eerst een 3D-stapel van de gekozen kern op met slechts 500 frames per plak. Dit maakt het mogelijk om de relatieve hoeveelheid DNA in de buik te bepalen, die later wordt afgebeeld met veel meer frames om de ultrastructuur te onthullen.

Begin met het vastleggen van de beeldreeksen met een belichtingstijd van 50 milliseconden, wat resulteert in een framesnelheid van ongeveer 20 frames per seconde. Neem een Z-stack door de kern met stapintervallen van 200 nanometer en slechts 500 frames per lichte optische sectie. Nadat de stapel is verkregen, keert u terug naar de oorspronkelijke z-positie en verkrijgt u de hoofddataset van 50.000 frames met dezelfde belichtingstijd van 50 milliseconden.

Open de FPALM-gegevensset in ImageJ. Om de instellingen voor de detectie van knipperende signalen te optimaliseren, klikt u op ThunderSTORM en vervolgens op Analyse uitvoeren. Kies nu Camera-instelling.

Voer de juiste pixelgrootte van de afbeeldingsgegevens, het A/D-aantal, de kwantumefficiëntie van de gebruikte camera, het basisniveau en de EM-versterking in en klik vervolgens op OK. Kies het algoritme om de lokalisatiecoördinaten te bepalen door de knipperende signalen aan te passen. Gebruik in het gedeelte Afbeeldingsfiltering het waveletfilter B-Spline met een B-Spline orde 3 en een B-Spline schaal 2. Stel vervolgens de methode voor geschatte lokalisatie van moleculen in op lokaal maximum, stel de drempel voor piekintensiteit en connectiviteit in op 8-buurt.

Kies in de sectie Subpixellokalisatie van moleculen als methode de optie PSF-geïntegreerd Gaussiaans, stel Aanpassingsradius px in op 3, selecteer Aanpasmethode als Maximale waarschijnlijkheid en stel Initiële sigma in op 1,6. Klik vervolgens op OK om de detectie van de signalen en de reconstructie van het beeld te starten. Als de acquisitie is gepartitioneerd in verschillende afbeeldingsstapels, voegt u de lokalisatietabellen samen in ThunderSTORM.

Klik hiervoor op Importeren in het pop-upvenster. Zorg ervoor dat de optie Toevoegen aan huidige tabel is geactiveerd en dat het juiste startnummer wordt gebruikt om te voorkomen dat lokalisaties in de tabel worden overschreven. Selecteer vervolgens het bestandspad en klik op OK om het ene bestand na het andere te importeren.

Als u wilt voorkomen dat signalen over opeenvolgende frames worden overgeteld, voegt u de lokalisatiegegevens samen met een maximale afstand van 20 nanometer, 1 maximum off-frames en 0 maximale frames per molecuul en klikt u vervolgens op Samenvoegen. Als u drift wilt meten en corrigeren door gegevenssubsecties met elkaar te correleren, opent u het menu Driftcorrectie en klikt u op de pijlen. Voeg 3 bakken toe en stel de vergroting in op 5.

Klik vervolgens op Toepassen en het venster met de afwijking x en y verschijnt. Om de hoeveelheid signaal te bepalen die evenredig is met het DNA-gehalte in elk segment van de vooraf opgenomen 3D-stapel met 500 frames voor elk segment, kiest u Plug-ins, vervolgens ThunderSTORM, gevolgd door Importeren/Exporteren, en importeert u de resultatentabel voor het eerste deel van de stapel. Om te voorkomen dat signalen van andere beeldvlakken van de 3D-stapel worden overgeteld, moeten signalen van buiten het stapinterval van 200 nanometer in z tussen de plakjes worden verwijderd.

Druk op Histogram plotten en kies in het geopende distributiedialoogvenster z en druk op OK. Bepaal de positie van de piek en gebruik het filterveld om de signalen te selecteren met de optische stapgrootte van 200 nanometer. Klik op Visualisatie en kies de optie Histogrammen en klik vervolgens op OK. Sla de resulterende afbeelding op in een map in de TIFF-indeling. Open alle segmenten en combineer ze met Afbeelding gevolgd door Stapels en vervolgens Afbeeldingen om te stapelen.

Nadat u het hele afbeeldingsgebied hebt geselecteerd, gaat u naar Analyseren, klikt u op Extra en selecteert u de ROI-manager. Klik op Toevoegen, klik vervolgens op Analyseren, gevolgd door Metingen instellen en selecteer Geïntegreerde dichtheid. Kies nu de optie Meer, selecteer Multi Measure, vink Meet alle stapels en Eén rij per segment aan.

Klik op OK en de resultaten worden weergegeven. De som van de intensiteiten van alle plakjes is evenredig met het DNA-gehalte van de hele kern, net zoals de intensiteit van individuele plakjes evenredig is met hun fractie van het hele genoom. Na het openen van de resultatentabel van het middenvlak die de signalen van 50.000 frames bevat, filtert u deze tot een dikte van 100 nanometer.

Maak het histogram van de resulterende signalen zoals eerder gedemonstreerd, en meet de geïntegreerde dichtheid van het middengedeelte. Converteer de grote ThunderSTORM-lokalisatietabel met de ultrastructurele informatie uit het middengedeelte van het csv-formaat naar het ORTE-formaat door het MATLAB-script TS2orte uit te voeren. m, die de lokalisatietabel omzet in een MATLAB-matrix en opslaat in het mat-formaat.

Ga naar de map LAND-voronoi en open in de submap coreAlgorithm het bestand voronoicluster. m en pas het DNA-gehalte, de fractie van het waargenomen middengedeelte van het DNA en de lokalisaties van de hele kernfractie aan, en de conversiefactor volgens het gebruikte celtype en de celcyclusfase voor de berekening van de absolute dichtheid. Bewerk het script waarmee de analyse voronoi.m wordt gestart.

Pas het bestandspad aan naar de orte-lokalisatiegegevens en de uitvoermap voor de resultaatbestanden. Specificeer de coördinaten die het gebied definiëren waarin de vlakvulling moet worden uitgevoerd. Definieer meerdere gebieden die moeten worden berekend binnen dezelfde invoergegevensset.

Nadat u het script hebt uitgevoerd, zoekt u naar de afbeelding met de absolute DNA-dichtheden samen met andere bestanden die grafieken bevatten die het histogram van de gebiedsverdeling en een dichtheid weergeven. m bestand met de dichtheden van elke berekende Voronoi-cel in de uitvoermap. De FPALM-meting, bestaande uit 50.000 frames, resulteerde in 2,68 keer 10 tot de macht van 6 gedetecteerde lokalisaties binnen een 100 nanometer dikke middensectie.

De lokalisatienauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld was 10 nanometer. Het grote aantal lokalisaties maakte de combinatie mogelijk van beeldvorming met superresolutie en het tonen van absolute DNA-dichtheden. Het was duidelijk dat de gemeten DNA-dichtheden niet uniform over de kern waren verdeeld en een uitgebreid dynamisch bereik besloegen.

Hogere vergrotingen van gebieden in de kern die grotere Voronoi-cellen vertoonden, duidden op lage DNA-dichtheden, terwijl kleinere cellen op hoge DNA-dichtheden duidden. DNA-dichtheden gemeten in een G1C3H10T halve kern toonden de absolute DNA-dichtheidsverdeling binnen de kern van een ander type en soort. Hoewel de basisorganisatie leek op de vroege G1 HeLa-kern, bezat deze ook constitutieve clusters van paracentrisch heterochromatine.

Er werden geen dramatische architecturale veranderingen waargenomen in een G2-kern, ondanks een iets grotere nucleaire grootte. De met TSA behandelde HeLa-kern vertoonde opmerkelijke verschillen met betrekking tot nucleaire topografie en DNA-dichtheid. Met uitzondering van het perifere heterochromatine, dat eilanden met een hogere DNA-dichtheid vertoonde, zag de rest van het chromatine er veel homogener en gedecondenseerder uit.