Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Mijn onderzoek richt zich op het membraan van T-cellen en heeft als doel nieuwe inzichten op nanoschaal te onthullen die relevant zijn voor therapeutische targeting. Bestaande beeldvormingsmethoden visualiseren doorgaans niet direct de interacties tussen nanolichamen en epitoop in cellen. Dit protocol overwint die beperking door directe observatie binnen de cellulaire omgeving mogelijk te maken.

Na het monteren van het monster op de microscoop en het afzetten van goudcolloïden op het oppervlak, gebruik je heldere veldverlichting om te verifiëren dat er voldoende colloïden zijn afgezet binnen het interessegebied. Controleer of de ideale dichtheid van 5 tot 10 goudcolloïden aanwezig is binnen het interessegebied voordat u verder gaat. Voor de optische configuratie van de antistofprobe fluorofore, open de beeldvormingssoftware en bekijk de optische configuratie-instellingen.

Selecteer de juiste dichroïsche spiegel en stel de golflengte en vermogensdichtheid van de laser in. Pas de integratietijd van de camera aan en selecteer het emissiefilter. Stel vervolgens de pixelbinning van de camera in om een pixelgrootte van 150 tot 160 nanometer te bereiken.

Maak nu een optische configuratie aan voor de fotobleachingstap door een fotobleachingmodus te selecteren in de beeldvormingssoftware. Stel het laservermogen in op 100% en stel de camera-integratietijd in op één seconde. Stel de beeldparameters in in de beeldopnamesoftware in door het niet-belichtingsinterval, het aantal frames en de frequentie van de fotobleekstap te definiëren.

Vervolgens bereidt u de beeldvormingsbuffer voor door het CD81-antilichaam te verdunnen tot een concentratie van 1 microgram per milliliter in 200 microliter 5% BSA geproduceerd in DPBS. De uiteindelijk aanbevolen antistofconcentratie is 0,5 nanomolaar voor Jurkat T-cellen, of 2 nanomolaar voor U-2 OS-cellen. Voeg de voorbereide beeldbuffer toe aan de put met de cellen en start de beeldopname in de software om te beginnen met de gegevensverzameling.

Gebruik de live view-functie in de beeldvormingssoftware die is geconfigureerd voor membraan-labeling van enkele antilichamen om de binding van antilichamen in realtime te monitoren. Stel de beeldparameters in de beeldverwervingssoftware zo in dat ze ten minste een opname van 10 frames verkrijgen en stel het niet-belichtingsinterval in op vijf seconden. Begin met de verwerving en evalueer de schaarsheid van enkele molecuullokalisaties in de opgenomen film.

Als er direct na toevoeging van de beeldvormingsbuffer meerdere overlappende antilichaambindingsgebeurtenissen worden waargenomen, of als enkele molecuullokalisaties zich in de loop van de tijd ophopen, breek dan de acquisitie af. Verlaag de antistofconcentratie met twee keer en herhaal de opname op een nieuw monster. Blijf de antistofconcentratie verdubbelen en het aantal gebeurtenissen per oppervlakte-eenheid opnieuw evalueren totdat de gewenste lokalisatiedichtheid van één molecuul is bereikt.

Als de gebeurtenisdichtheid schaars is, verhoog dan de antistofconcentratie in de beeldvormingsbuffer met verdubbeling. Herhaal de verwerving op een nieuw monster en verhoog de antistofconcentratie verdubbeld, terwijl het aantal bindingsgebeurtenissen per oppervlakte-eenheid wordt herzien totdat de gewenste lokalisatiedichtheid van één molecuul is bereikt. Voor niet-verlichtingsintervaloptimalisatie configureer je de beeldparameters in de beeldacquisitiesoftware om een 50-frame opname te verkrijgen.

Na toevoeging van het antilichaam en het starten van de verwerving, evalueer je de dichtheid en sparsiteit van de localisaties van één molecuul in de opgenomen film. Bepaal het laagste niet-verlichtende interval dat een optimale dichtheid van enkelmolecuulgebeurtenissenten oplevert. Tot slot, als ruimtelijk overlappende bindingsgebeurtenissen optreden tijdens de beeldverwerving, voer dan op regelmatige afstanden een fotobleekstap in.

Pas de fotobleekfrequentie aan zodat fluorescentie van gebonden antilichamen wordt verwijderd voordat overlappende gebeurtenissen zich ophopen. Stel het bestandspad in de MATLAB-software in op de map die het gereconstrueerde M-cel comma-separated values bestand bevat. Voer de code uit door op Run te klikken in de MATLAB-werkbalk.

Wanneer daarom wordt gevraagd, selecteer je het M-cel CSV-bestand en klik je op Open om het in het programma te laden. Voer de analyse uit met de eerder gedefinieerde invoer als uitgangspunt. Het evalueren van de verstrooiingsgrafiek met de ongeclusterde lokalisatiegegevens.

Kies een minimale puntwaarde die hoger is dan het aantal ruislokalisaties, maar lager dan het aantal lokalisaties op de cel. Evalueer het venster dat de geclusterde data weergeeft. Bevestig dat clusters op de cel met het verwachte fenotype behouden blijven, terwijl lokalisaties buiten de cel worden geminimaliseerd.

Als de clusterparameters te beperkend zijn, verlaag dan de minimale puntenwaarde en verhoog het epsilon. Als de clusterparameters te inclusief zijn, verhoog dan de minimale puntenwaarde en verlaag het epsilon. Tot slot, na het aanpassen van de minimale puntenwaarde en epsilon, voer je de code opnieuw uit om optimale clustering te verkrijgen.

Jurkat T-cellen werden met voldoende afstand geïmmobiliseerd om de integriteit van het membraan te behouden en antilichaamtoegang tot membraanepitopen mogelijk te maken. Goudcolloïden werden gevisualiseerd en gebruikt als fiduciale markers voor laterale driftcorrectie tijdens M-celbeeldverwerving. Optimalisatie van het niet-verlichtingsinterval toonde aan dat een interval van vijf seconden antilichaambindingsgebeurtenissen veroorzaakte met minimale ruimtelijke overlap vergeleken met kortere of langere intervallen bij één nanomolaire antilichaamconcentratie.

De toepassing van driftcorrectie verbeterde het gereconstrueerde M-celbeeld vergeleken met de ongecorrigeerde reconstructie. Dichtheidsgebaseerde clustering van M-cellokalisaties verminderde laagdichtheidsachtergrondinteracties en benadrukte geclusterde CD81-bindingsgebeurtenissen. We kunnen antilichamen observeren die interacteren met hun membraanepitopen in een cellulaire omgeving, wat inzicht geeft dat relevant is voor therapeutische antistoffen.

De antistofconcentratie, het niet-verlichtingsinterval en de fotobleachingstappen zijn cruciaal om te optimaliseren. Suboptimale parameters zullen de resultaten beïnvloeden. Labeling van enkele antilichamen kan worden uitgebreid om gelijktijdig de binding van membraaneiwitten door meerdere antilichamen binnen dezelfde cellulaire omgeving te evalueren.