Een multilabel Single Molecule Localization Microscopieprotocol voor het Onderzoek van Chromatine in de dichte nucleaire omgeving
5 juni 2026
We presenteren een driekleurig chromatine single molecule localization microscopy (SMLM) kleurings- en analyseprotocol dat reproduceerbare mapping van euchromatine, heterochromatine en RNAP II mogelijk maakt voor ruimtelijke analyse. Dit protocol maakt efficiënte meerkleurige etikettering mogelijk in dichte nucleaire omgevingen, inclusief chromatine-geassocieerde doelen, waardoor betrouwbare gelijktijdige detectie mogelijk is.
Ons onderzoek onderzoekt de epigenetische samenstelling van chromatine-verpakkingsdomeinen en hoe regulerende factoren hun structuur en functie vormen. Dit protocol is vooral nuttig voor het onderzoeken van ruimtelijke relaties tussen doelwitten en dichte cellulaire omgevingen, zoals de kern. Om te beginnen weeg je het rundvleesserumalbumine, zodat de uiteindelijke concentratie in het vereiste buffervolume voor het experiment 3% is. Voeg het rundse serumalbumine toe aan een centrifugebuis.
Kantel de centrifugebuis op een hoek van 45 graden om de rundserumalbuminekristallen uit te spreiden, en voeg vervolgens PBS toe aan de buis. Dit voorkomt klonteren van de kristallen. Laat alle serumalbuminekristallen van runderen natuurlijk oplossen bij kamertemperatuur en voorkom schudden of vortexen.
Zodra de kristallen volledig zijn opgelost, voeg je Triton X-100 toe om een uiteindelijke concentratie van 0,2% te bereiken. Als er kristallen overblijven, pipetteer je de oplossing meerdere keren op en neer om de oplossing langzaam te mengen zonder belletjes te vormen. Neem de levende cellen uit de broedmachine. Verwijder het celkweekmedium uit het schaaltje.
Was de cellen door genoeg PBS toe te voegen om de cellen te bedekken, en pipetteer daarna de PBS eruit. Vervolgens pipetteer je genoeg fixatieve oplossing om de cellen te bedekken en laat je de cellen 10 minuten fixeren. Met een balans weeg je natriumborhydride om een 0,1% afkoeloplossing te bereiden.
Voeg het natriumborhydride toe aan een centrifugebuis. Pipet de fixatieve oplossing uit het schaaltje. Voeg vervolgens genoeg PBS toe aan de schotel om het celoppervlak te bedekken.
Zet het schaaltje vijf minuten op een shaker om de cellen te wassen. Voeg vervolgens het benodigde volume PBS toe aan het natriumborhydride in de centrifugebuis. Draai de buis in vortex om de afkoeloplossing te mengen.
Haal het gerecht uit de shaker en gooi de PBS weg. Voeg genoeg afkoelingsoplossing toe om het oppervlak van het gerecht te bedekken. Plaats het schaaltje vervolgens zeven minuten op een shaker om autofluorescentie in de cellen te dempen.
Gooi de resterende afschrikoplossing in de centrifugebuis weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer. Haal het bakje uit de shaker en verwijder daarna de afschrikoplossing. Voeg vervolgens genoeg PBS toe aan het gerecht om het oppervlak te bedekken.
Zet het schaaltje vijf minuten op een shaker om de cellen te wassen. Na de incubatie verwijder je het PBS en herhaal je de wasbeurt met PBS nog twee keer. Voeg nu genoeg blokkeringsdemper toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken.
Incubeer de schaal minstens een uur op een shaker om de celmembranen te permeabiliseren en bindingsplaatsen te blokkeren. Om de primaire antistofkleuringsoplossing te bereiden, verplaats je het benodigde volume van de blokkeringsbuffer naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg het vereiste volume primaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de door de fabrikant gespecificeerde uiteindelijke concentratie te bereiken.
Vervang vervolgens de blokkeringsbuffer door voldoende primaire antistofkleuringsoplossing om het oppervlak van de schaal te bedekken en incubeer op een shaker gedurende één tot twee uur of een nacht. Na primaire antilichaamincubatie vervang je de primaire antistofoplossing door waspjes. Zet het schaaltje vervolgens vijf minuten op een shaker om de cellen schoon te maken.
Herhaal de wasbuffer die nog twee keer gewassen wordt voor in totaal drie wasbeurten. Bereid de secundaire antistofkleuringsoplossing voor volgens de aanbevolen concentratie. Bereken het totale volume van de kleuringsoplossing door 0,5 milliliter toe te voegen aan het volume dat nodig is om de cellen te bedekken.
Breng het berekende volume van de blokkeringsbuffer over naar een nieuwe centrifugebuis om de kleuringsoplossing te bereiden. Voeg vervolgens het juiste volume secundaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de juiste uiteindelijke concentratie te verkrijgen. Wikkel de centrifugebuis met de secundaire antilichaamkleuringsoplossing in aluminiumfolie en meng de oplossing door op en neer te pipetten.
Voeg voldoende secundaire antistofkleuringsoplossing toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken. Plaats de schaal 40 minuten op een shaker om fluoroforen aan de gelabelde cellulaire doelen te bevestigen. Bedek de schaal met aluminiumfolie om fluoroforbleking te voorkomen.
Na 40 minuten voert u twee PBS-wasbeurten uit zoals eerder gedemonstreerd. Als opslag de voorkeur heeft, voeg dan genoeg PBS toe aan de schotel om het celoppervlak te bedekken voordat je het opbergt. Wikkel de schaal in met parafilm om verdamping van de vloeistof te voorkomen, en daarna met aluminiumfolie om fluoroforbleeken te voorkomen.
Bewaar het ingepakte schaaltje op vier graden Celsius tot het klaar is om te fotograferen. Het sequentiële kleuringsprotocol produceerde representatieve driekleurige chromatine dSTORM-beelden voor meerdere cellijnen, waaronder BJ Fibroblast-, HeLa- en MCF 10A-cellen. De analysepijplijn werd geëvalueerd met behulp van gesimuleerde datasets die normale, uniforme toroïdale en willekeurige ruimtelijke verdelingen weergeven, verankerd in heterochromatineclusterposities.
Verschillende ruimtelijke organisatiepatronen produceerden karakteristieke afstandshistogramprofielen wanneer lokalisatiecoördinaten werden geanalyseerd ten opzichte van heterochromatinecentroïden. Gesimuleerde ruimtelijk gescheiden markers in een normale choroïdale configuratie produceerden minimale gewrichtsdichtheid, wat resulteerde in een vlak verdelingsprofiel. Gesimuleerde overlappende markeringspatronen in een normale willekeurige configuratie veroorzaakten een afnemende hechtheid van de voegen met toenemende afstand tot referentiepunten.
DB-scan-gebaseerde identificatie van heterochromatinedomeinen maakte categorisatie in kleine, middelgrote en grote domeinen mogelijk op basis van effectieve straal. Kwantitatieve afstandsanalyse toonde aan dat RNA-polymerase II en H3K27ac zich nabij heterochromatinegrenzen lokaliseerden over kleine, middelgrote en grote domeinen. Gewrichtsdichtheidsanalyse toonde piek H3K27ac en RNA-polymerase II colokalisatie net buiten de grenzen van heterochromatineclusters.
Met dit protocol kunnen onderzoekers de schijnbaar ongeordende organisatie van chromatine onderzoeken om de relatie tussen de structuur, regulerende elementen en functionele uitkomsten te onderzoeken. Na deze procedure kunnen verschillende beeldgebaseerde of puntwolk-computationele analyses kwantitatieve structurele kenmerken uit ruimtelijke data halen, afhankelijk van de gebruikte beeldvormingsmodaliteit. Onderzoekers kunnen deze labelmethode uitbreiden door extra markers te optimaliseren en multikanaaldata te benutten om meer geavanceerde en uitgebreide analyses mogelijk te maken.
Overzicht
Dit artikel presenteert een sequentieel immunolabelingsprotocol voor robuuste driekleurige single molecule localization microscopy (SMLM) in dichte nucleaire omgevingen, wat high-fidelity imaging van chromatinecomponenten mogelijk maakt. De methode omvat geoptimaliseerde bufferformuleringen, fluorofoorselectie en strategieën voor antilichaamvalidatie om crosstalk en signaaldegradatie te minimaliseren. Het is geïntegreerd met een computationele analysepipeline die lokalisaties van één target gebruikt als ruimtelijke ankers om inter-target afstanden, lokale dichtheden en multi-label co-affiniteit te kwantificeren. Het protocol wordt gedemonstreerd in BJ-fibroblasten, HeLa- en MCF 10A-cellen en ondersteunt gedetailleerde ruimtelijke analyse op nanoschaal van de chromatinestructuur.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- Chromatinebiologie
Achtergrond
- Chromatine vertoont een organisatie op meerdere schalen, van nucleosomen tot domeinen op micronschaal, waarvoor resolutie-rijke en specifieke beeldvormingsbenaderingen vereist zijn.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), in het bijzonder STORM, maakt nanoscale mapping van epigenetische markeringen mogelijk.
- Multi-label imaging in de nucleus kampt met uitdagingen zoals een verminderde toegankelijkheid van antilichamen, aspecifieke binding en instabiliteit van fluoroforen.
- Bestaande protocollen missen vaak robuustheid in dichte subcellulaire omgevingen zoals de nucleus.
Doel van de studie
- Om een sequentieel immunolabelling-protocol te ontwikkelen dat is geoptimaliseerd voor nucleaire omgevingen met een hoge dichtheid.
- Om robuuste driekleurige SMLM mogelijk te maken met minimale overspraak en verminderde signaaldegradatie.
- Om het protocol te integreren met een computationele pijplijn voor kwantitatieve ruimtelijke analyse van chromatinecomponenten.
- Om een reproduceerbaar kader te bieden voor multi-component imaging in dichte subcellulaire omgevingen.
Gebruikte methoden
- Sequentiële immunolabeling met geoptimaliseerde bufferformuleringen en fluorofoorselectie.
- Blokkeren met 3% BSA, fixatie en quenching met 0,1% natriumborohydride om autofluorescentie te verminderen.
- Incubaties met primaire en secundaire antilichamen met wastappen om aspecifieke binding te minimaliseren.
- dSTORM-imaging onder gebufferde condities om fluoroforen te stabiliseren.
- Computationele analyse waarbij lokalisaties van één target als zaadpunten worden gebruikt om inter-target afstanden en gezamenlijke dichtheden te meten.
- DBscan-gebaseerde clustering om heterochromatine-domeinen te categoriseren op basis van de effectieve straal.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol leverde representatieve driekleurige dSTORM-beelden op in BJ-fibroblasten, HeLa- en MCF 10A-cellijnen.
- Gesimuleerde gegevens toonden verschillende afstandshistogramprofielen op basis van de ruimtelijke organisatie van markers ten opzichte van heterochromatine-centroïden.
- RNA-polymerase II en H3K27ac waren gelokaliseerd nabij heterochromatinegrenzen over kleine, middelgrote en grote domeinen.
- Joint density-analyse onthulde een piek in colocalisatie van H3K27ac en RNA-polymerase II net buiten de grenzen van heterochromatineclusters.
- De analysepijplijn maakte kwantificering van structurele kenmerken mogelijk vanuit ruimtelijke point cloud-gegevens afgeleid van SMLM.
Conclusies
- Het sequentieel immunolabelingsprotocol maakt betrouwbare SMLM met drie kleuren van hoge getrouwheid mogelijk in dichte kernomgevingen.
- Integratie met computationele analyse maakt nanometrische kwantificering van de ruimtelijke organisatie van chromatine mogelijk.
- De methode biedt een reproduceerbaar kader voor het bestuderen van ruimtelijke relaties tussen chromatinencomponenten en regulatoire factoren.
- Onderzoekers kunnen de aanpak uitbreiden door aanvullende markers te optimaliseren voor een uitgebreide multi-target analyse.
- Dit protocol bevordert het onderzoek naar structuur-functie-relaties van chromatine in natuurlijke cellulaire contexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol pakt een kritieke bottleneck in chromatinonderzoek aan: het bereiken van robuuste, gemultiplexte superresolutie-imaging in de dichte nucleaire omgeving, waar antilichaamtoegankelijkheid en signaalstabiliteit belangrijke beperkingen vormen. Door kwantitatieve nanoscale-mapping mogelijk te maken van epigenetische markeringen en regulatoire factoren ten opzichte van heterochromatinedomeinen, biedt het een mechanistisch tool voor risico-reductie bij targetvalidatie in epigenetische geneesmiddelenontwikkeling. De geïntegreerde computationele pipeline transformeert ruwe lokalisatiegegevens naar bruikbare ruimtelijke metrieken, wat de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege hypothesetests voor targets ondersteunt.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om ruimtelijke relaties tussen chromatinemarkeringen, transcriptiefactoren en heterochromatine te onderzoeken om mechanistische hypothesen over epigenetische regulatie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar kader voor gemultiplexte co-lokalisatiestudies van targets in dichte subcellulaire omgevingen.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert nanoschaalnabijheid en co-affiniteit tussen targets, wat targetprioritering op basis van ruimtelijke context en functionele relevantie ondersteunt.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde, high-fidelity three-color SMLM-data die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en reproductiebeoordeling in studies naar nuclear target engagement.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt uitbreiding naar aanvullende markers via sequentiële labeling, wat schaalbare multi-parameter profilering van de chromatinarchitectuur mogelijk maakt.
- Analytische output: Levert kwantificeerbare ruimtelijke kenmerken op, zoals inter-target afstanden, lokale dichtheden en gezamenlijke dichtheidsprofielen voor de validatie van screening hits in een downstream fase.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert de studie van chromatinorganisatie in ziekte-relevante celmodellen, waarbij de modulatie van epigenetische targets wordt gekoppeld aan structurele resultaten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ruimtelijke inzichten uit de ontdekkingsfase en preklinische validatie door het leveren van consistente, kwantificeerbare nucleaire imaging-readouts.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanistische risicoreductie van epigenetische targets mogelijk door directe visualisatie van hun nanoscopische chromatinomgeving en regulatoire buren.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, vanaf de generatie van doelhypotheses tot aan de identificatie van leads, waarbij de ruimtelijke chromatincontext inzicht geeft in de behandelbaarheid van het doelwit en het werkingsmechanisme. Het maakt de ontwikkeling van screening-klare assays mogelijk door gestandaardiseerde, gemultiplexte nucleaire imagingdata met kwantitatieve output te leveren. De computationele pijplijn biedt analyseklare ruimtelijke metrieken die een cross-functionele vergelijking mogelijk maken van verbindingen of genetische perturbaties op de chromatinarchitectuur.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door epigenetische markeringen en regulatoire factoren in kaart te brengen ten opzichte van heterochromatinedomainen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare driekleurige SMLM-gegevens met minimale crosstalk voor een betrouwbare beoordeling van het effect van verbindingen op nucleaire targets.
- Analytiek: Genereert metingen van de afstand tussen targets, lokale dichtheidskaarten en gezamenlijke dichtheidsprofielen op basis van lokalisatiegegevens om ruimtelijke relaties te kwantificeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen over de organisatie van chromatine op nanoschaal met preklinische continuïteit via gestandaardiseerde, kwantificeerbare ruimtelijke read-outs.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd protocol voor multi-target nucleaire imaging dat toepasbaar is binnen verschillende ontdekkingsprogramma's gericht op chromatine.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van epigenetische targets door middel van directe ruimtelijke mapping op nanoschaal van chromatinecomponenten en regulatoren.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie, reproduceerbaarheid en signaaltrouw bij gemultiplexte nucleaire SMLM via geoptimaliseerde blocking, antilichaamvalidatie en bufferformuleringen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen in epigenetische targetprogramma's door een ruimtelijke context te bieden die functionele target-interactie en pathway-modulatie voorspelt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets mogelijk op basis van gevalideerde chromatinelokalisatie en co-affiniteit met belangrijke regulatoire elementen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in superresolutie-microscopie, immunokleuring en point-cloud-analyse voor een nauwkeurige interpretatie van de gegevens.
- Afhankelijk van instrumentatie die geschikt is voor SMLM en de selectie van stabiele fluoroforen die compatibel zijn met sequentiële labeling en buffercondities.
- Vraagt om standaardisatie tussen teams wat betreft antilichaamvalidatie, blokkingsefficiëntie en quenching-protocollen om batchvariabiliteit te minimaliseren.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende chromatinetargets, inclusief epitope-toegankelijkheid en antilichaampenetratie in gefixeerde dichte kernen.
- Beperkt door het sequentiële karakter van de kleuring, wat de totale protocoltijd verhoogt en een zorgvuldige optimalisatie vereist om targetverlies of signaaldegradatie over meerdere ronden te voorkomen.
