Een multilabel Single Molecule Localization Microscopieprotocol voor het Onderzoek van Chromatine in de dichte nucleaire omgeving
5 juni 2026
We presenteren een driekleurig chromatine single molecule localization microscopy (SMLM) kleurings- en analyseprotocol dat reproduceerbare mapping van euchromatine, heterochromatine en RNAP II mogelijk maakt voor ruimtelijke analyse. Dit protocol maakt efficiënte meerkleurige etikettering mogelijk in dichte nucleaire omgevingen, inclusief chromatine-geassocieerde doelen, waardoor betrouwbare gelijktijdige detectie mogelijk is.
Ons onderzoek onderzoekt de epigenetische samenstelling van chromatine-verpakkingsdomeinen en hoe regulerende factoren hun structuur en functie vormen. Dit protocol is vooral nuttig voor het onderzoeken van ruimtelijke relaties tussen doelwitten en dichte cellulaire omgevingen, zoals de kern. Om te beginnen weeg je het rundvleesserumalbumine, zodat de uiteindelijke concentratie in het vereiste buffervolume voor het experiment 3% is. Voeg het rundse serumalbumine toe aan een centrifugebuis.
Kantel de centrifugebuis op een hoek van 45 graden om de rundserumalbuminekristallen uit te spreiden, en voeg vervolgens PBS toe aan de buis. Dit voorkomt klonteren van de kristallen. Laat alle serumalbuminekristallen van runderen natuurlijk oplossen bij kamertemperatuur en voorkom schudden of vortexen.
Zodra de kristallen volledig zijn opgelost, voeg je Triton X-100 toe om een uiteindelijke concentratie van 0,2% te bereiken. Als er kristallen overblijven, pipetteer je de oplossing meerdere keren op en neer om de oplossing langzaam te mengen zonder belletjes te vormen. Neem de levende cellen uit de broedmachine. Verwijder het celkweekmedium uit het schaaltje.
Was de cellen door genoeg PBS toe te voegen om de cellen te bedekken, en pipetteer daarna de PBS eruit. Vervolgens pipetteer je genoeg fixatieve oplossing om de cellen te bedekken en laat je de cellen 10 minuten fixeren. Met een balans weeg je natriumborhydride om een 0,1% afkoeloplossing te bereiden.
Voeg het natriumborhydride toe aan een centrifugebuis. Pipet de fixatieve oplossing uit het schaaltje. Voeg vervolgens genoeg PBS toe aan de schotel om het celoppervlak te bedekken.
Zet het schaaltje vijf minuten op een shaker om de cellen te wassen. Voeg vervolgens het benodigde volume PBS toe aan het natriumborhydride in de centrifugebuis. Draai de buis in vortex om de afkoeloplossing te mengen.
Haal het gerecht uit de shaker en gooi de PBS weg. Voeg genoeg afkoelingsoplossing toe om het oppervlak van het gerecht te bedekken. Plaats het schaaltje vervolgens zeven minuten op een shaker om autofluorescentie in de cellen te dempen.
Gooi de resterende afschrikoplossing in de centrifugebuis weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer. Haal het bakje uit de shaker en verwijder daarna de afschrikoplossing. Voeg vervolgens genoeg PBS toe aan het gerecht om het oppervlak te bedekken.
Zet het schaaltje vijf minuten op een shaker om de cellen te wassen. Na de incubatie verwijder je het PBS en herhaal je de wasbeurt met PBS nog twee keer. Voeg nu genoeg blokkeringsdemper toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken.
Incubeer de schaal minstens een uur op een shaker om de celmembranen te permeabiliseren en bindingsplaatsen te blokkeren. Om de primaire antistofkleuringsoplossing te bereiden, verplaats je het benodigde volume van de blokkeringsbuffer naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg het vereiste volume primaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de door de fabrikant gespecificeerde uiteindelijke concentratie te bereiken.
Vervang vervolgens de blokkeringsbuffer door voldoende primaire antistofkleuringsoplossing om het oppervlak van de schaal te bedekken en incubeer op een shaker gedurende één tot twee uur of een nacht. Na primaire antilichaamincubatie vervang je de primaire antistofoplossing door waspjes. Zet het schaaltje vervolgens vijf minuten op een shaker om de cellen schoon te maken.
Herhaal de wasbuffer die nog twee keer gewassen wordt voor in totaal drie wasbeurten. Bereid de secundaire antistofkleuringsoplossing voor volgens de aanbevolen concentratie. Bereken het totale volume van de kleuringsoplossing door 0,5 milliliter toe te voegen aan het volume dat nodig is om de cellen te bedekken.
Breng het berekende volume van de blokkeringsbuffer over naar een nieuwe centrifugebuis om de kleuringsoplossing te bereiden. Voeg vervolgens het juiste volume secundaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de juiste uiteindelijke concentratie te verkrijgen. Wikkel de centrifugebuis met de secundaire antilichaamkleuringsoplossing in aluminiumfolie en meng de oplossing door op en neer te pipetten.
Voeg voldoende secundaire antistofkleuringsoplossing toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken. Plaats de schaal 40 minuten op een shaker om fluoroforen aan de gelabelde cellulaire doelen te bevestigen. Bedek de schaal met aluminiumfolie om fluoroforbleking te voorkomen.
Na 40 minuten voert u twee PBS-wasbeurten uit zoals eerder gedemonstreerd. Als opslag de voorkeur heeft, voeg dan genoeg PBS toe aan de schotel om het celoppervlak te bedekken voordat je het opbergt. Wikkel de schaal in met parafilm om verdamping van de vloeistof te voorkomen, en daarna met aluminiumfolie om fluoroforbleeken te voorkomen.
Bewaar het ingepakte schaaltje op vier graden Celsius tot het klaar is om te fotograferen. Het sequentiële kleuringsprotocol produceerde representatieve driekleurige chromatine dSTORM-beelden voor meerdere cellijnen, waaronder BJ Fibroblast-, HeLa- en MCF 10A-cellen. De analysepijplijn werd geëvalueerd met behulp van gesimuleerde datasets die normale, uniforme toroïdale en willekeurige ruimtelijke verdelingen weergeven, verankerd in heterochromatineclusterposities.
Verschillende ruimtelijke organisatiepatronen produceerden karakteristieke afstandshistogramprofielen wanneer lokalisatiecoördinaten werden geanalyseerd ten opzichte van heterochromatinecentroïden. Gesimuleerde ruimtelijk gescheiden markers in een normale choroïdale configuratie produceerden minimale gewrichtsdichtheid, wat resulteerde in een vlak verdelingsprofiel. Gesimuleerde overlappende markeringspatronen in een normale willekeurige configuratie veroorzaakten een afnemende hechtheid van de voegen met toenemende afstand tot referentiepunten.
DB-scan-gebaseerde identificatie van heterochromatinedomeinen maakte categorisatie in kleine, middelgrote en grote domeinen mogelijk op basis van effectieve straal. Kwantitatieve afstandsanalyse toonde aan dat RNA-polymerase II en H3K27ac zich nabij heterochromatinegrenzen lokaliseerden over kleine, middelgrote en grote domeinen. Gewrichtsdichtheidsanalyse toonde piek H3K27ac en RNA-polymerase II colokalisatie net buiten de grenzen van heterochromatineclusters.
Met dit protocol kunnen onderzoekers de schijnbaar ongeordende organisatie van chromatine onderzoeken om de relatie tussen de structuur, regulerende elementen en functionele uitkomsten te onderzoeken. Na deze procedure kunnen verschillende beeldgebaseerde of puntwolk-computationele analyses kwantitatieve structurele kenmerken uit ruimtelijke data halen, afhankelijk van de gebruikte beeldvormingsmodaliteit. Onderzoekers kunnen deze labelmethode uitbreiden door extra markers te optimaliseren en multikanaaldata te benutten om meer geavanceerde en uitgebreide analyses mogelijk te maken.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
