Clearing en fluorescentiemicroscopie combineren voor het visualiseren van veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties op Plasmodiophora brassicae

Plasmodiophora brassicae is de door de bodem overgedragen verplichte biotrofe ziekteverwekker die planten uit de Brassicaceae-familie aanvalt. Bij infectie veroorzaakt pathogeen de ontwikkeling van gallen op de ondergrondse delen van de plant, vandaar de naam van de ziekte clubroot. De ontwikkeling van gallen gaat gepaard met zeer complexe herprogrammering.

Daarom is de mogelijkheid om interne veranderingen tijdens ziekte te volgen cruciaal voor het begrijpen van deze plant-pathogeen interactie. Ons protocol verbetert de beeldvorming van complexe, dikke en gallen. Het vergemakkelijkt de visualisatie van veranderingen in genexpressie, fysiologische reacties, fytohormoonbalans, ziekteprogressie, sporenverdeling en lokale lignificatie.

Het protocol bewaart fluorescerende eiwitten in monsters, waardoor objecten gedurende een lange tijd kunnen worden opgeslagen en verwerkt. Het maakt het ook mogelijk om biochemische en structurele veranderingen te volgen die gepaard gaan met ziekteprogressie. Sara Blicharz, postdoctoraal onderzoeker in onze groep, Deeksha Singh, promovendus van ons laboratorium, en Kornel Michalak, promovendus van professor Agnieszka Bagniewska-Zadworna-groep aan de Adam Mickiewicz University, demonstreren de procedure.

Begin met het voorbereiden van het plantenweefsel. Verwijder voorzichtig grond uit de wortelsystemen van met clubwortel geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde planten. Reinig grondig met water en verzamel hypocotylen en gallen in microcentrifugebuizen.

Bevestig de monsters in 200 tot 500 microliter paraformaldehydefixatiemiddel gedurende één uur bij kamertemperatuur door een constant vacuüm van 700 millibar toe te passen met behulp van een vacuümpomp. Zorg ervoor dat het object volledig is ondergedompeld in de paraformaldehyde-oplossing. Gebruik 4% agarose voor het inbedden van niet-geïnfecteerde hypocotylen en geïnfecteerde gallen.

Kook de oplossing om agarose op te lossen en giet het wanneer het afkoelt terwijl het nog stroperig is. Droog het voorwerp een paar seconden lichtjes op een tissue om overtollig paraformaldehyde te verwijderen. Gebruik tandenstokers of tangen om het plantenobject zorgvuldig in agarose in te bedden en te oriënteren.

Om schuine secties te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat het object correct is georiënteerd en gegoten, zodat de as loodrecht staat op het vlak van het vibratomeblad. Om het stollen van agarose te versnellen, plaatst u een petri- of multicultuurplaat gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Snijd en vorm het object zorgvuldig met behulp van een mes in een agarose-blok, waarbij u de voorkeursoriëntatie voor secties noteert.

Plak het agaroseblok of de grote gal om het goed op de monsterhouder te monteren met behulp van cyanoacrylaat of instantlijm en afplaktape. Pas de dikte voor secties, snelheid en trillingsamplitude aan op basis van de dikte en grootte van de gal. Voeg gedestilleerd water toe aan het waterbad en begin met secties.

Verzamel secties zorgvuldig met behulp van een tang of borstel en breng ze over in een microcentrifugebuis met één milliliter 1X PBS-buffer. Verwijder 1X PBS uit de microcentrifugebuis en voeg 200 tot 500 microliter opruimoplossing toe. Vervang de clearingoplossing door de nieuwe als de kleur na enige tijd tijdens de monsterverwerking verandert.

Voer calcofluor-witte kleuring uit voor de celwanden van de uitgevende plantencellen door 5% calcofluor-witte vlek in de clearingoplossing te bereiden. Kleur de cellen vervolgens minstens vijf minuten in het donker. Kleur lipiden met Nijlrood en lignine met Basic Fuchsin lignine kleuring zoals beschreven in het tekstmanuscript en monteer de gewiste secties op de microscopiedia.

Observeer vervolgens de cellen onder een epifluorescentie of een confocale microscoop. Gebruik meerdere acquisitiemodi om meer dan één fluorescentiespectrum tegelijkertijd in beeld te brengen. Ziektedynamiek en pathogene accumulatie werden gevolgd in gallen gekoloniseerd door Plasmodiophora brassicae, en grote cellen met P.brassicae rustende sporen werden waargenomen na Nijlrode kleuring.

Veranderingen in xyleemdifferentiatie na P.brassicae-infectie werden gevisualiseerd met behulp van Basic Fuchsin-kleuring. De Arabidopsis-planten met pHCA2:erRFP-construct werden gebruikt om HCA2-genexpressie in floëemweefsel in clubwortelgalen te visualiseren. HCA2 co-gelokaliseerd met het floëem in de late stadia van P.brassicae-gedreven galontwikkeling, en de genactiviteit weerspiegelde het mechanisme waardoor P.brassicae de floëemcomplexiteit verhoogt.

16 dagen na inenting werden differentiële cytokinineresponsen tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde planten beoordeeld door de expressie van de TCS:GFP-marker bij het ontwikkelen van gallen te controleren. De cytokinineresponsen lijken significant verminderd te zijn in geïnfecteerde gallen, terwijl ze sterk bleven, vooral in de floëempool, in niet-geïnfecteerde planten. De meest kritieke stappen zijn fixatie in PFA, insluiten en secties.

Voor vibratomesecties moet men de snelheid, amplitude en dikteparameters optimaliseren en zorgvuldig aanpassen om secties van goede kwaliteit te verkrijgen. Vibratome sectioning en weefselzuiveringstechnieken hebben de weg vrijgemaakt voor het verbeteren van microscopische analyse van fysiologische reacties tijdens plant-microbe interacties en weefsels die secundaire groei vertonen met complexe cellulaire anatomie.