Eenvoudige en snelle detectie van topoisomerase 1-activiteit in ruwe biologische monsters op basis van versterking van de rollende cirkel

Dit protocol toont een rolling circle amplificatiemethode om topoisomerase 1 activiteit in ruwe monsters op een snelle en eenvoudige manier te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het ook gemakkelijk te volgen is door niet-ervaren onderzoekers, en het is gevoeliger in vergelijking met de andere op gel gebaseerde testen wanneer ruwe extracten worden gebruikt. De toepassing van dit protocol strekt zich uit van het meten van de respons op medicamenteuze behandeling tot screening van verbindingen met kleine moleculen met potentieel effect op kanker of anti-infectieziekten.

De procedure wordt gedemonstreerd door Karol Mizielinski, ontwikkelingsspecialist van ons laboratorium. Bevestig om te beginnen een op maat ontworpen siliconen isolatorrooster aan een gefunctionaliseerde dia, waardoor de putmaker wordt. Druk op het siliconenrooster om de vorming van luchtbellen tussen het oppervlak van het glas en de siliconen te voorkomen.

Bereid vervolgens de primermix voor door vijf micromolar, vijf prime amino primer toe te voegen in één printbuffer. Voeg vervolgens vier microliter van dit mengsel toe aan elke put en incubeer de putmaker in een hybridisatiekamer met verzadigd natriumchloride. Om gesloten cirkelvormige substraten te genereren, voegt u twee microliter van vijf micromolaire topoisomerase 1 specifiek substraat en twee microliter van het recombinante topoisomerase 1-enzym of een bereid celextract toe aan 16 microliter eenmalige topoisomerasereactiebuffer.

Incubeer dit cirkelmengsel op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten en stop de enzymreactie door twee microliter van 1% sds toe te voegen. Dompel de putmaker onder in een bak gevuld met buffer 1, voorverwarmd op 50 graden Celsius. Pipetteer de buffer in de putjes om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de putmaker achterblijven en incubeer de bak vervolgens gedurende 30 minuten bij 50 graden Celsius.

Verwijder na incubatie de buffer 1 en was tweemaal met gedestilleerd water met krachtig schudden gedurende één minuut tussen de wasbeurten. Verwijder het water, voeg vervolgens buffer 2, voorverwarmd op 50 graden Celsius toe aan de bak, incubeer en was de putmaker zoals eerder gedemonstreerd voor buffer 1. Was vervolgens de putmaker met 70% ethanol, met krachtig schudden gedurende één minuut en gebruik perslucht om de opstelling te laten drogen.

Om hybridisatie uit te voeren, voegt u vier microliter van het voorbereide cirkelmengsel toe aan elke overeenkomstige put en plaatst u de putmaker gedurende een uur in een vochtigheidskamer met gedestilleerd water van 37 graden Celsius. Was aan het einde van de incubatie de putmaker elk één minuut en buffer 3, buffer 4 en 70% ethanol en laat het vervolgens aan de lucht drogen. Bereid en voeg vier microliter van het RCA-mengsel toe aan elke put van de putmaker en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee uur in de vochtigheidskamer.

Om de versterkte fluorescerende rollencirkelproducten microscopisch te visualiseren, wast u eerst de dia met buffer 3, buffer 4 en 70% ethanol. Droog de dia met perslucht en lijm deze op een microscoopglaasje. markeer de positie van de putjes met een stift en verwijder vervolgens het siliconenrooster met een pincet.

Om visualisatie in de camera mogelijk te maken, monteer je de dia met twee microliter montagemedium zonder dapi en voeg je een afdekglas toe. Analyseer de dia met behulp van een fluorescentiemicroscoop, met een 60x olie-onderdompelingsobjectieflens en een camera. Importeer na het afdrukken de afbeeldingen naar afbeelding J en stapel de afbeeldingen door op Afbeelding te klikken, vervolgens stapels en afbeeldingen om te stapelen en vervolgens het afbeeldingstype te wijzigen in 8-bits.

Om de drempel in te stellen, klikt u op Afbeelding, Aanpassen en vervolgens op Drempel. Stel de onderste balk in op 255 en pas de bovenste balk zo aan dat alleen de rechtersignalen rood zijn en de achtergrond zwart. Veeg door de afzonderlijke afbeeldingen en zorg ervoor dat ze overeenkomen met de afbeeldingen voordat u de drempel aanpast.

Zorg ervoor dat de drempel zo laag mogelijk wordt ingesteld voordat de echte signalen beginnen te verdwijnen. Als u de signalen wilt tellen, klikt u op Analyseren, gevolgd door Deeltjes analyseren en zorgt u ervoor dat het samengevatte veld in de J-instellingen van de afbeelding is aangevinkt. Voeg vier microliter verdunde paardenradijsperoxidase-geconjugeerde anti-biotine antilichaam toe aan elke put en incubeer bij 15 tot 25 graden Celsius gedurende 50 minuten in de vochtigheidskamer.

Was aan het einde van de incubatie de putmaker drie keer met buffer 5 gedurende drie minuten elk en laat het drogen. Om de chemiluminescentie te visualiseren, voegt u twee microliter vers bereide ECL-luminol- en waterstofperoxidemix toe aan de putten en visualiseert u de dia met behulp van een CCD-camera of op röntgenfilms. Als alternatief, om te visualiseren met TMB, verwijdert u het siliconenrooster na de buffer 5 wasbeurt en voegt u 400 microliter TMB toe aan de hele dia.

Bewaar de glijbaan in een vochtigheidskamer en wacht vijf tot 10 minuten op kleurontwikkeling. Was na een kleurontwikkeling de dia met 70% tethanol en fotografeer de dia met een camera of mobiele telefoon voor analyse met image J-software. Importeer de afbeelding naar afbeelding J en wijzig het afbeeldingstype in 8-bits door op Afbeeldingstype en vervolgens op 8-bits te klikken.

Beperk het gemeten gebied door het gereedschap rechthoektekenen op de werkbalk te gebruiken om de banden afzonderlijk te meten en het gewenste gebied te tekenen. Meet de intensiteit door te klikken op Analyseren en vervolgens meten. Verplaats vervolgens het oorspronkelijk getekende gebied naar de volgende band en meet.

Na het meten van de intensiteit voor alle banden, plot de gegevens in de gewenste software. De Topoisomerase 1-activiteit zoals bepaald door een fluorescentiescanneruitlezing wordt hier weergegeven, zoals blijkt uit de kwantificering. Deze uitlezing heeft een detectielimiet van 12,5 nanogram, representatieve beelden en de resulterende kwantificering verkregen met behulp van de fluorescentiemicroscoopuitlezing, worden hier weergegeven.

Deze uitleesmethode heeft een detectielimiet van 0,1 nanogram, de detectiedrempel van de verbeterde chemiluminescentie en de color o'metric uitleesmethoden was 6 nanogram. Met dezelfde uitlezingen was de detectielimiet 1.250 cellen voor de ECL en 312 cellen voor TMB. Wanneer topoisomerase 1 activiteit werd gemeten uit extracten van colorectaal adenocarcinoom afgeleide cellen.

Als voorbeeld van een drug screening toepassing, werd de topoisomerase 1 activiteit gemeten in de aanwezigheid van camptothecine of dimethylsulfoxide. De kwantificeringsresultaten toonden aan dat camptothecine topoisomerase 1 één gemedieerde circularisatie van het substraat remt zoals verwacht. Dit is een eenvoudig protocol dat alleen specifieke aandacht vereist voor de wasstappen en de reactie-incubatietijden.

Het is ook mogelijk om te onderzoeken hoe geneesmiddelen topoisomerase 1-activiteit remmen, het gebruik van Reid is zeer gevoelig en gemakkelijk uit te voeren, het maakt een snelle screening van potentiële topoisomerase 1-remmers mogelijk en het gebruik van topoisomerase 1-activiteit als biomarker voor medicijnrespons bij kankers.