Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Structurele varianten zoals inserties, deleties, duplicaties en inversies zijn in het verleden moeilijker experimenteel te volgen geweest en hun frequenties kunnen niet nauwkeurig worden gemeten door ampliconsequencing. Hier bieden we een eenvoudige kosteneffectieve techniek, die drievoudig primerontwerp en parallelle capillaire elektroferese koppelt om structurele variant allelfrequenties in de loop van de tijd te volgen. Deze methode is ontworpen om endpoint sequencing in experimentele evolutie aan te vullen en om de frequenties van opkomende de novo allelen te traceren.

We hopen dat deze methode ook ten goede zal komen aan degenen die werken met pathogene gegevens over intra-hosts. De procedure wordt gedemonstreerd door Jeanne Hamet, een onderzoeksassistente van ons laboratorium. De verschillende stappen van de methoden zullen worden getoond in een geval waarin het afgeleide allel het resultaat is van een IS10-insertie in een bacterieel gen genaamd mutS.

Ontwerp eerst een paar primers om een kort amplicon op het wildtype allel rond de mutante insertieplaats te versterken. Ontwerp een derde primer voorwaartse primer twee binnen de invoegvolgorde om een lichte groottevariabele van het wildtype amplicon te produceren. Begin met het extraheren van DNA uit 24-uursculturen van vaste wilde en gemuteerde allelklonen.

Na het kwantificeren van het DNA, verdun elk DNA-extract tot vijf nanogram per microliter met water. Bevestig de twee monsters in een verhouding van 50/50. Stel een reactie van 20 microliter in met 10 nanogram DNA-monster, primers en PCR-mastermix.

Scheid vervolgens het PCR-product door elektroforese, met behulp van een 2% agarose-gel. Het grootteverschil tussen de amplicons van het wilde type en de mutant moet op de gel worden geverifieerd. Om een kalibratiecurve te verkrijgen, begint u met het mengen van het wildtype DNA en het mutante DNA in verschillende verhoudingen.

Verdun de PCR-producten tot 0,1 nanogram per microliterconcentratie. Om de scheidingsgel te bereiden, mengt u de verse gel en kleurstof. Vervang de inlaatbuffer.

Plaats de spoelbuffer op de juiste ladeplaats van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Voeg 22 microliter van de verdunningsmarker toe aan de putjes van een 96-putplaat. Voeg nu twee microliter van de verdunde PCR-producten toe aan elk monsterput.

Voeg aan één Well een DNA-grootteladder toe uit een hooggevoeligheidskit, variërend van één tot 6.000 basenparen in grootte. Plaats de microplaat in het parallelle capillaire elektroforese-instrument in geselecteerde run op de instrumentsoftware. Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware.

Identificeer eerst de pieken op basis van hun bekende grootte. Kwantificeer elk amplicon om een kalibratiecurve te produceren. Controleer ten slotte of de relatieve hoeveelheden van de twee allelen correct zijn gemeten.

Deze kalibratiecurve wordt vervolgens gebruikt om de hoeveelheid structurele varianten te berekenen na PCR-versterking en parallelle capillaire elektroforese. Deze representatieve resultaten volgen op een verstorende insertie in het mutS-gen. Knockdowns en mutS leiden tot een hypermutatorfenotype, waardoor bacteriën meer mutaties kunnen bemonsteren dan hun basismutatiesnelheid.

Met behulp van de gepresenteerde methode werd de frequentie van de mutS-structurele variant gevolgd over 1000 generaties. Een niet-monotoon traject van het opkomende mutante allel werd onthuld. Het gemuteerde allel werd voor het eerst gedetecteerd bij generatie 680.

Het allel nam vervolgens snel in frequentie toe en bereikte 67% bij generatie 713. Deze toename stagneerde vervolgens en nam slechts 10% toe in de volgende 53 generaties, tot 76% Onverwacht daalde de mutante allelfrequentie vervolgens van 76% tot 49% in de loop van 13 generaties, waarna het toenam tot fixatie. Deze methode zal ten goede komen aan degenen die werken aan experimentele evolutie.

Dit protocol stelt de gebruiker in staat om bevroren archieven te nemen en evolutionaire trajecten te verkennen die anders niet waarneembaar zijn met endpoint sequencing-gegevens.