Name: Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Leer een kosteneffectieve methode om structurele varianten in bacteriële populaties te volgen met behulp van triplet-PCR en capillaire elektroforese. Deze techniek maakt dynamische tracking van allelfrequenties mogelijk gedurende experimentele evolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) aan S.B. De gegevens die in dit werk werden gebruikt, werden (gedeeltelijk) geproduceerd door de technische faciliteiten van GenSeq van het Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier met de steun van LabEx CeMEB, een ANR "Investissements d'avenir" -programma (ANR-10-LABX-04-01).

Het instellen van dit protocol vereist nauwkeurige kennis van het invoeg-, deletie-, inversie- of duplicatiepunt binnen de voorouderlijke reeks. Deze informatie wordt meestal verkregen door whole-genome sequencing (WGS) van de eind- of tussenpuntmonsters. In het volgende protocol wordt het algemene principe voor het geval van een insertiemutatie gegeven voor elke stap, naast een representatief geval waarin de frequentie van een IS10-insertie in het mutS-gen in een experimentele evolutiepopulatie van E. coli wordt gevolgd. In deze populatie identificeerde WGS van de eindpuntpopulatie de insertie van een IS10 van 1.329 bp tussen posities 2.463 en 2.471, wat resulteerde in de duplicatie van deze insertieplaats. Deze methode is van toepassing op de drie andere SV-typen en de specifieke kenmerken van elk geval worden in de discussie gegeven.
1. Ontwerp van triplet primers
<ol><li>Gebruik klassieke primerontwerppraktijken (18-24 bp, 40% -60% GC-gehalte, begin / einde met G / C-paren waar mogelijk, Tm verschil < 5 ° C) om primers FW1 en RV1 te produceren. Ontwerp primers om een korte amplicon op het WT-allel rond de gemuteerde allel-insertieplaats te versterken (figuur 1). OPMERKING: De amplicongrootte kan variëren van 100 bp tot maximaal 3.000 bp, in overeenstemming met de DNA-grootteladder die wordt gebruikt bij de capillaire elektroforese. In dit voorbeeld werd een amplicon van 155 bp versterkt. De hier gekozen kleine fragmentgrootte voorkomt off-target versterking van de gehele IS10-insertiesequentie (zie rubriek 2).</li>
	<li>Ontwerp een tweede voorwaartse primer FW2 binnen de invoegvolgorde om een tweede amplicon te produceren die ongeveer 5% groter of kleiner is dan het WT-amplicon (figuur 1). Dit verschil van 5% is het minimale grootteverschil dat het parallelle capillaire elektroforese-apparaat betrouwbaar kon onderscheiden. Ontwerp daarom de primers zo dat de twee amplicons een verschil in grootte hebben, dat boven maar zo dicht mogelijk bij de relatieve drempel ligt. OPMERKING: Zorg ervoor dat u het Tm-verschil en de vorming van primerdimeer minimaliseert. In dit voorbeeld werd een tweede voorwaartse primer ontworpen om een amplicon van 226 bp te produceren, 71 bp groter dan het WT-amplicon. In dit representatieve voorbeeld zijn de primersequenties als volgt: FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/64709fig01.jpg" style="opacity: 0.9;"> Figuur 1: Schema van triplet primer ontwerp op mutS WT gen en mutant mutS IS10 insertie. De zwarte driehoek vertegenwoordigt de IS10-insertieplaats in het mutS-gen. Het WT-gen is blauw en de IS10 is oranje. Primers FW1 en RV1 markeren de IS10-invoegplaats en produceren een WT-amplicon van 155 bp. De RV1 primer en de intra-IS10 primer FW2 produceren een tweede 226 bp amplicon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64709/64709fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
2. Optimalisatie van PCR-voorwaarden
<ol><li>Kweek een nachtelijke cultuur van vaste WT- en mutante allelklonen.</li>
	<li>Extraheer het DNA met behulp van een kit.</li>
	<li>Kwantificeer het DNA.</li>
	<li>Bereid het DNA-monster voor door de extractie van WT- en mutant-DNA te verdunnen tot 5 ng/μL. Meng de twee DNA-monsters in een verhouding van 50/50.</li>
	<li>Amplificeer 10 ng van de drie DNA-monsters (WT, mutant, 50/50 mix) met behulp van een 2x kant-en-klare PCR-mastermix, 0,5 μM FW1-primer, 1 μM RV1-primer en 0,5 μM FW2-primer in een reactievolume van 20 μL. Gebruik een 2% agarose-gel om het PCR-product te migreren door klassieke elektroforese en bepaal de optimale PCR-omstandigheden. OPMERKING: Rektijden moeten worden geminimaliseerd om de vorming van het FW1- en RV1-amplicon op het mutante allel te voorkomen. De gloeitemperatuur moet worden aangepast om vertekende versterking van de allelen en niet-specifieke versterking te minimaliseren.<ol><li>Om het programma in dit voorbeeld te volgen, gebruikt u de volgende instellingen: 98 °C gedurende 10 s, gevolgd door 25 cycli van 98 °C gedurende 1 s, 58 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 8 s en een laatste rekstap bij 72 °C gedurende 1 min. OPMERKING: De rektijd werd teruggebracht tot 8 s om versterking van het >1.000 bp product van de voorwaartse primer en de RV1-primer op het mutante allel te voorkomen (mutS met IS10-insertie).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kalibratiecurve
<ol><li>Meng de twee DNA-monsters, WT en mutant, in de verhoudingen 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 en 90/10. OPMERKING: Biologische replicaties worden bereid uit onafhankelijke nachtelijke bacterieculturen.</li>
	<li>Versterken met behulp van geoptimaliseerde PCR-condities (zie rubriek 2).</li>
	<li>Kwantificeer het ampliconproduct.</li>
	<li>Verdun de PCR-producten tot 0,1 ng/μl.</li>
	<li>Bereid het parallelle capillaire elektroforese-instrument voor.<ol><li>Meng verse gel en kleurstof (NGS kwantitatieve analysekit (22, 33 of 55); HS NGS fragment 1-6.000 bp voor dit voorbeeld). OPMERKING: Zie de parallelle capillaire elektroforese HS NGS fragmentgids voor gedetailleerde instructies (zie de tabel met materialen).</li>
	</ol></li>
	<li>Vervang de capillaire opslagoplossing en de inlaatbuffer en plaats de spoelbufferplaat op de juiste ladeplaatsen van het parallelle capillaire elektroforese-instrument.</li>
	<li>Voeg 2 μL HS-verdunningsmarker toe aan 22 μL van elk verdund monster in een plaat met 96 putten.</li>
	<li>Voeg een grootteladder (DNA-grootteladder; bereik 1-6.000 bp) van een HS NGS kwantitatieve analysekit toe aan één put van de 96-putplaat.</li>
	<li>Plaats de 96-putsplaat in de juiste lade van het parallelle capillaire elektroforese-instrument en selecteer Uitvoeren op de software van het parallelle capillaire elektroforese-instrument.</li>
	<li>Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware, die elke piek van de grootteladder detecteert en identificeert en elke piek van de monsters toewijst aan hun bekende werkelijke grootte.<ol><li>Wanneer u een kwantitatieve kit gebruikt, gebruikt u de software om de DNA-hoeveelheid van elk fragment te bepalen door het gebied onder de piek te integreren, zoals bij chromatografiegegevensanalyse. Nogmaals, vergelijk monsters met bekende hoeveelheden in normen om elke piek uit een steekproef te kwantificeren en bereken de verhoudingen tussen de verschillende pieken die in de monsters zijn gedetecteerd.</li>
		<li>Construeer een kalibratiecurve (figuur 2), waarbij de bekende verhouding van het gemuteerde allel (DNA-mix) wordt gekoppeld aan de verhouding die is gemeten met behulp van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Met deze kalibratiecurve kan de betrouwbaarheid van de methode worden geëvalueerd en gecorrigeerd voor kleine versterkingsbias.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Monstervoorbereiding
<ol><li>Kweek tijdpuntmonsters 's nachts in standaardomstandigheden.</li>
	<li>Extraheer het DNA.</li>
	<li>Kwantificeer het DNA.</li>
	<li>Amplificeer de monsters met behulp van geoptimaliseerde PCR-omstandigheden (zie rubriek 2).</li>
	<li>Voer de monsters uit in het parallelle capillaire elektroforese-instrument (zie stappen 3.5-3.10).</li>
</ol>5. Kwantificering van allel
<ol><li>Extraheer mutante allelhoeveelheden uit de parallelle capillaire elektroforese-instrumentgegevens met de software en bereken de werkelijke verhoudingen door deze waarden op de kalibratiecurve uit te zetten.</li>
</ol>

<ol><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variant+calling%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246(2019).</li>
<li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846(2014).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li>
<li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li>
<li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li>
<li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li>
<li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980(2021).</li>
<li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li>
<li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50%2C000-generation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li>
<li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li>
<li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635(2015).</li>
<li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li>
<li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8(2019).</li>
<li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutators%2C+population+size%2C+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Hier hebben we een kosteneffectieve methode voorgesteld waarmee de dynamiek van opkomende adaptieve SV-allelen in experimentele evolutiepopulaties kan worden gevolgd. Deze methode koppelt klassieke PCR-technieken en geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese, waardoor de relatieve hoeveelheden van twee allelen kunnen worden bepaald. Eenmaal ingesteld, maakt het de kwantificering van allelverhoudingen in veel monsters parallel mogelijk en is het veel goedkoper dan WGS. Deze methode kan worden gezien als een equi...

Structurele varianten (SV's) zijn veranderingen van de genomische sequentie, die over het algemeen 50 bp of meer beïnvloeden. De vier categorieën beschreven SV's zijn grote inserties, grote deleties, inversies en duplicaties. Tot voor kort werd meer aandacht besteed aan single-nucleotidevarianten (SNV's) dan aan structurele varianten, in termen van hun fenotypische effecten en hun rol als genetische determinanten van ziekte, of hun bijdrage aan aanpassing. Dit komt waarschijnlijk omdat het gemakkelijker is om zowel SNV's te detecteren als hun fenotypische effecten te voorspellen. Kort- en langleestechnologieën voor diepe sequencing hebben de detectie van SV's echter sterk verbeterd, althans in individuele of klonale genomen1. Tegelijkertijd zijn hun fenotypische effecten beter gekarakteriseerd en zijn er veel voorbeelden van hun implicatie als genetische determinanten van menselijke ziekte 2,3 of aanpassing aan een nieuwe omgeving4 gedocumenteerd.
Deleties en inserties, vaak als gevolg van mobiele genetische element (MGE) inserties, zijn veel disruptiever dan single nucleotide polymorphisms (SNP's) en leiden tot frameshift mutaties en eiwitstructuurmodificaties. Deleties en MGE-inserties in genen resulteren bijna altijd in geninactivatie, en inserties in niet-coderende regio's kunnen leiden tot repressie of constitutieve expressie van aangrenzende genen wanneer insertiesequenties (IS's) promotor- of beëindigingssequenties bevatten5. Hoewel het uitschakelen van essentiële genen leidt tot duidelijke schadelijke effecten op bacteriële fitheid, is het verlies van niet-essentiële genen in sommige gevallen gunstig. Ondanks hun inherente kosten kunnen duplicaties ook voordelig zijn en deelnemen aan aanpassing omdat ze leiden tot een verandering in de gendosering; Een toename van de activiteit van een specifiek eiwit kan voordelig zijn, afhankelijk van de omstandigheden6.
Microbiële experimentele evolutiepopulaties worden meestal gestart met klonen. Deze aanvankelijke afwezigheid van genetische diversiteit, gecombineerd met de "gesloten omgeving" die kenmerkend is voor reageerbuizen, leidt tot een zeer beperkt potentieel van evolutie door genwinst door horizontale genoverdracht en recombinatie. In deze specifieke omstandigheden is de bijdrage aan de aanpassing van deleties, duplicaties en intragenomische MGE-insertie bijzonder belangrijk; bacteriën passen zich vaak aan door mutaties in functieverlies (voornamelijk als gevolg van deleties of MGE-inserties), waardoor genen worden aangetast die niet nuttig zijn in stabiele, vaak voedselrijke, monocultuur kunstmatige omgevingen7. In het langstlopende E. coli-evolutie-experiment komen IS150-inserties vooral vaak voor bij populaties die na 50.000 generaties zijn geëvolueerd, waarbij IS-elementen 35% van de mutaties vertegenwoordigen die een hoge frequentie bereiken in populaties die hun voorouderlijke puntmutatiesnelheidbehouden 8.
Evolueren en resequence studies koppelen experimentele evolutie en next-generation sequencing (NGS) technologieën om te onderzoeken hoe bacteriën zich aanpassen, op fenotypisch en genomisch niveau, aan verschillende omgevingsomstandigheden en stress, zoals verschillende koolstof- en energiebronnen, antibiotica en osmotische stress 9,10,11 . Deze studies verkrijgen meestal genomische informatie over de geëvolueerde populaties of klonen alleen op het experimentele eindpunt, en in sommige gevallen op een aantal tussenliggende tijdstippen12,13,14. Deze gegevens geven inzicht in genen en paden die betrokken zijn bij de aanpassing aan een bepaalde omgeving, maar stellen onderzoekers zelden in staat om de dynamiek van de novo opkomende en vegende allelen in de loop van de tijd te volgen.
Een benadering om deze dynamiek te volgen is om een beperkt aantal scheidende allelen van belang te kiezen (vanwege de functie van de genen die ze beïnvloeden, omdat ze parallel lopen in onafhankelijke populaties, enz.) en ampliconsequencing te gebruiken om de allelverhouding te kwantificeren, waarbij veel tijdspunten in dezelfde sequencingrun15 worden samengevoegd. Deze methode is met succes gebruikt om de dynamiek van kleine varianten (SNP's of 1 bp indels) te volgen in experimentele16 en natuurlijke17 populaties van microben. In het geval van grotere indels of MGE-inserties veroorzaakt het grootteverschil van de amplicons echter PCR-efficiëntieverschillen, die de relatie tussen lees- en allelverhoudingen verstoren. In bepaalde gevallen is het grootteverschil tussen de twee allelen superieur aan de klassieke lengte van het amplicon. Hier hebben we een triplet PCR-techniek gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel te kwantificeren op basis van groottediscriminatie. Deze benadering maakt het mogelijk om onderbenutte experimentele tijdspunten te benutten om de dynamiek van een opkomend mutant allel te bepalen en de frequentie ervan te volgen tot fixatie of verlies, op een kosteneffectieve manier. We pasten deze methode toe om opkomende mutS-allelen te volgen, gemuteerd door een IS10-insertie, waardoor het gemuteerde genotype een hypermutatorfenotype kreeg.
Deze methode vereist twee doelallelen met een verschil van ≥5% in grootte. Ten eerste zijn primer-drielingen ontworpen om fragmenten van vergelijkbare grootte te produceren, die een gemeenschappelijke primer delen. Ten tweede worden pcr-condities geoptimaliseerd en wordt een kalibratiecurve geproduceerd met behulp van mixen van wild-type (WT) en mutant gDNA. Ten slotte worden monsters versterkt door PCR en wordt de relatieve frequentie van elk allel gekwantificeerd door parallelle kwantitatieve capillaire elektroforese.

<table><tbody><tr><td>96 Well Skirted PCR Plate</td><td>4titude</td><td>4Ti - 0740</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Agarose molecular biology grade</td><td>Eurogentec</td><td>EP-0010-05</td><td>Agarose gel elektroforese&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td><td>Agilent</td><td></td><td>PDF instructiehandleiding</td></tr><tr><td>Buffer TBE</td><td>Panreac appliChem</td><td>A4228,5000Pc</td><td>Agarose gel elektroforese&nbsp;</td></tr><tr><td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td><td>LABELIANS</td><td>8175CSR40H</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA extractie</td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td>Amilabo</td><td>ST606T</td><td>Agarose gel elektroforese&nbsp;</td></tr><tr><td>Fragment Analyzer Automated CE System</td><td>Agilent</td><td></td><td>Parallel capillaire elektroforese</td></tr><tr><td>Fragment DNA Ladder</td><td>Agilent</td><td>DNF-396, range 1-6000bp</td><td>Parallel capillaire elektroforese</td></tr><tr><td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264-1G</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>High Sensitivity diluent marker</td><td>Agilent</td><td>DNF-373</td><td>Parallel capillaire elektroforese</td></tr><tr><td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td><td>Agilent</td><td>DNF-474</td><td>Parallel capillaire elektroforese</td></tr><tr><td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td>Agarose gel elektroforese&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td><td>Millipore</td><td>28713</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F548L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Prosize data analysis software v.4</td><td>Agilent</td><td>V.4</td><td>Parallel capillaire elektroforese</td></tr><tr><td>Qubit assays</td><td>Invitrogen</td><td>MAN0010876</td><td>DNA kwantificatie</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td><td>Q32854</td><td>DNA kwantificatie</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>Ep gradients</td><td>PCR</td></tr><tr><td>UVbox, eBOX VX5</td><td>Vilber Lourmat</td><td></td><td>Agarose gel elektroforese visualisatie</td></tr><tr><td>Water for injectable preparation</td><td>Aguettant</td><td>PROAMP</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Van structurele varianten (SV's) (d.w.z. deleties, inserties, duplicaties en inversies) is nu bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij fenotypische variatie, en bijgevolg bij processen zoals ziektebepaling of aanpassing aan een nieuwe omgeving. Single-nucleotidevarianten krijgen echter veel meer aandacht dan SV's, waarschijnlijk omdat ze gemakkelijker te detecteren zijn en hun fenotypische effecten gemakkelijker te voorspellen zijn. De ontwikkeling van short- en long-read deep sequencing-technologieën heeft de detectie van SV's sterk verbeterd, maar de kwantificering van hun frequentie uit poolseq-gegevens (poolseq) is technisch nog steeds complex en duur.
Hier presenteren we een vrij eenvoudige en goedkope methode, waarmee onderzoekers de dynamiek van SV-allelfrequentie kunnen volgen. Als voorbeeld van toepassing volgen we de frequentie van een insertiesequentie (IS) insertie in experimentele evolutiepopulaties van bacteriën. Deze methode is gebaseerd op het ontwerp van drietallen van primers rond de structurele variantranden, zodanig dat de ampliconen geproduceerd door amplificatie van het wild-type (WT) en afgeleide allelen ten minste 5% in grootte verschillen en dat hun versterkingsefficiëntie vergelijkbaar is. De hoeveelheid van elk amplicon wordt vervolgens bepaald door parallelle capillaire elektroforese en genormaliseerd tot een kalibratiecurve. Deze methode kan eenvoudig worden uitgebreid tot de kwantificering van de frequentie van andere structurele varianten (deleties, duplicaties en inversies) en tot pool-seq-benaderingen van natuurlijke populaties, inclusief pathogene populaties binnen de patiënt.

Met behulp van DNA geëxtraheerd uit een voorouderlijke kloon en een hypermutatorkloon geïsoleerd uit de S2.11-populatie bij generatie 1.000, hebben we de kalibratiecurve vastgesteld die in figuur 2 wordt weergegeven. De werkelijke mutante verhoudingen van in het laboratorium bereide DNA-mengsels en gemeten door het parallelle capillaire elektroforese-instrument waren verbonden door een lineaire relatie van helling 1,0706, met een R2 van 0,9705. Daarnaast was er een goede overeenko...

We ontwikkelden een kosteneffectieve methode om niet-enkelvoudige nucleotide polymorfisme alleldynamica te volgen die gemakkelijk kan worden aangepast aan experimentele evolutie bevroren archieven. Een triplet PCR-techniek werd gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel in de loop van de experimentele evolutie te kwantificeren.

Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Structurele varianten zoals inserties, deleties, duplicaties en inversies zijn in het verleden moeilijker experimenteel te volgen geweest en hun frequenties kunnen niet nauwkeurig worden gemeten door ampliconsequencing. Hier bieden we een eenvoudige kosteneffectieve techniek, die drievoudig primerontwerp en parallelle capillaire elektroferese koppelt om structurele variant allelfrequenties in de loop van de tijd te volgen. Deze methode is ontworpen om endpoint sequencing in experimentele evolutie aan te vullen en om de frequenties van opkomende de novo allelen te traceren.We hopen dat deze methode ook ten goede zal komen aan degenen die werken met pathogene gegevens over intra-hosts. De procedure wordt gedemonstreerd door Jeanne Hamet, een onderzoeksassistente van ons laboratorium. De verschillende stappen van de methoden zullen worden getoond in een geval waarin het afgeleide allel het resultaat is van een IS10-insertie in een bacterieel gen genaamd mutS.Ontwerp eerst een paar primers om een kort amplicon op het wildtype allel rond de mutante insertieplaats te versterken. Ontwerp een derde primer voorwaartse primer twee binnen de invoegvolgorde om een lichte groottevariabele van het wildtype amplicon te produceren. Begin met het extraheren van DNA uit 24-uursculturen van vaste wilde en gemuteerde allelklonen.Na het kwantificeren van het DNA, verdun elk DNA-extract tot vijf nanogram per microliter met water. Bevestig de twee monsters in een verhouding van 50/50. Stel een reactie van 20 microliter in met 10 nanogram DNA-monster, primers en PCR-mastermix.Scheid vervolgens het PCR-product door elektroforese, met behulp van een 2% agarose-gel. Het grootteverschil tussen de amplicons van het wilde type en de mutant moet op de gel worden geverifieerd. Om een kalibratiecurve te verkrijgen, begint u met het mengen van het wildtype DNA en het mutante DNA in verschillende verhoudingen.Verdun de PCR-producten tot 0,1 nanogram per microliterconcentratie. Om de scheidingsgel te bereiden, mengt u de verse gel en kleurstof. Vervang de inlaatbuffer.Plaats de spoelbuffer op de juiste ladeplaats van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Voeg 22 microliter van de verdunningsmarker toe aan de putjes van een 96-putplaat. Voeg nu twee microliter van de verdunde PCR-producten toe aan elk monsterput.Voeg aan één Well een DNA-grootteladder toe uit een hooggevoeligheidskit, variërend van één tot 6.000 basenparen in grootte. Plaats de microplaat in het parallelle capillaire elektroforese-instrument in geselecteerde run op de instrumentsoftware. Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware.Identificeer eerst de pieken op basis van hun bekende grootte. Kwantificeer elk amplicon om een kalibratiecurve te produceren. Controleer ten slotte of de relatieve hoeveelheden van de twee allelen correct zijn gemeten.Deze kalibratiecurve wordt vervolgens gebruikt om de hoeveelheid structurele varianten te berekenen na PCR-versterking en parallelle capillaire elektroforese. Deze representatieve resultaten volgen op een verstorende insertie in het mutS-gen. Knockdowns en mutS leiden tot een hypermutatorfenotype, waardoor bacteriën meer mutaties kunnen bemonsteren dan hun basismutatiesnelheid.Met behulp van de gepresenteerde methode werd de frequentie van de mutS-structurele variant gevolgd over 1000 generaties. Een niet-monotoon traject van het opkomende mutante allel werd onthuld. Het gemuteerde allel werd voor het eerst gedetecteerd bij generatie 680.Het allel nam vervolgens snel in frequentie toe en bereikte 67% bij generatie 713. Deze toename stagneerde vervolgens en nam slechts 10% toe in de volgende 53 generaties, tot 76% Onverwacht daalde de mutante allelfrequentie vervolgens van 76% tot 49% in de loop van 13 generaties, waarna het toenam tot fixatie. Deze methode zal ten goede komen aan degenen die werken aan experimentele evolutie.Dit protocol stelt de gebruiker in staat om bevroren archieven te nemen en evolutionaire trajecten te verkennen die anders niet waarneembaar zijn met endpoint sequencing-gegevens.

following-dynamics-structural-variants-experimentally-evolved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Moleculair genetische strategie voor het vinden van de novo mutaties veroorzaken veel voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie.

Een strategie om de Novo Mutaties Leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Hier presenteren we een protocol laboratorium adaptieve evolutie van micro-organismen onder omstandigheden met behulp chemostaat cultuur te verkrijgen. Ook is genomische analyse van het vrijkomende stam besproken.

Procedure voor Adaptive Laboratorium Evolutie van micro-organismen met behulp van een Chemostat

Het evolver Framework maakt een continue microbiële cultuur met hoge resolutie en dynamische controle over experimentele parameters mogelijk. Dit protocol laat zien hoe het systeem toe te passen om een complex fitness-experiment, begeleiden gebruikers op de programmering geautomatiseerde controle over vele individuele culturen, meten, verzamelen en interactie met experimentele gegevens in real-time.

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Dit analytische computationele platform biedt praktische richtlijnen voor microbiologen, ecologen en epidemiologen die geïnteresseerd zijn in bacteriële populatiegenomica. In het bijzonder demonstreerde het hier gepresenteerde werk hoe uit te voeren: i) fylogenie-geleide mapping van hiërarchische genotypen; ii) op frequentie gebaseerde analyse van genotypen; iii) verwantschaps- en klonaliteitsanalyses; iv) identificatie van afstammingsonderscheidende accessoire loci.

Heuristische mijnbouw van hiërarchische genotypen en accessoire genoom loci in bacteriële populaties

Dit protocol beschrijft hoe het Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) kan worden gehandhaafd door de dagelijkse overdrachten en periodieke bevriezingen uit te voeren en hoe wedstrijdtests kunnen worden uitgevoerd om fitnessverbeteringen in geëvolueerde bacteriën te meten. Deze procedures kunnen dienen als een sjabloon voor onderzoekers die hun eigen microbiële evolutie-experimenten starten.

Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

De huidige HIV-1-strategieën handelen om de virale levenscyclus te onderdrukken, maar niet werkelijk uit te roeien infectie. Hier tonen we aan dat een aangelegde recombinase efficiënt kunnen accijnzen geïntegreerd HIV-1 proviraal DNA van het genoom van de geïnfecteerde cellen.

Interview: HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase

We beschrijven een proces met behulp van laser-capture microdissectie te isoleren en RNA uittreksel uit een homogene celpopulatie, piramidale neuronen, in laag III van de superieure temporale gyrus in postmortale de menselijke hersenen. We vervolgens lineair versterken (T7-based) mRNA, en hybridiseren het monster op de Affymetrix menselijke X3P microarray.

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

Leer een kosteneffectieve methode om structurele varianten in bacteriële populaties te volgen met behulp van triplet-PCR en capillaire elektroforese. Deze techniek maakt dynamische tracking van allelfrequenties mogelijk gedurende experimentele evolutie.

Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Meer video's verkennen