Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties
3 februari 2023
We ontwikkelden een kosteneffectieve methode om niet-enkelvoudige nucleotide polymorfisme alleldynamica te volgen die gemakkelijk kan worden aangepast aan experimentele evolutie bevroren archieven. Een triplet PCR-techniek werd gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel in de loop van de experimentele evolutie te kwantificeren.
Structurele varianten zoals inserties, deleties, duplicaties en inversies zijn in het verleden moeilijker experimenteel te volgen geweest en hun frequenties kunnen niet nauwkeurig worden gemeten door ampliconsequencing. Hier bieden we een eenvoudige kosteneffectieve techniek, die drievoudig primerontwerp en parallelle capillaire elektroferese koppelt om structurele variant allelfrequenties in de loop van de tijd te volgen. Deze methode is ontworpen om endpoint sequencing in experimentele evolutie aan te vullen en om de frequenties van opkomende de novo allelen te traceren.
We hopen dat deze methode ook ten goede zal komen aan degenen die werken met pathogene gegevens over intra-hosts. De procedure wordt gedemonstreerd door Jeanne Hamet, een onderzoeksassistente van ons laboratorium. De verschillende stappen van de methoden zullen worden getoond in een geval waarin het afgeleide allel het resultaat is van een IS10-insertie in een bacterieel gen genaamd mutS.
Ontwerp eerst een paar primers om een kort amplicon op het wildtype allel rond de mutante insertieplaats te versterken. Ontwerp een derde primer voorwaartse primer twee binnen de invoegvolgorde om een lichte groottevariabele van het wildtype amplicon te produceren. Begin met het extraheren van DNA uit 24-uursculturen van vaste wilde en gemuteerde allelklonen.
Na het kwantificeren van het DNA, verdun elk DNA-extract tot vijf nanogram per microliter met water. Bevestig de twee monsters in een verhouding van 50/50. Stel een reactie van 20 microliter in met 10 nanogram DNA-monster, primers en PCR-mastermix.
Scheid vervolgens het PCR-product door elektroforese, met behulp van een 2% agarose-gel. Het grootteverschil tussen de amplicons van het wilde type en de mutant moet op de gel worden geverifieerd. Om een kalibratiecurve te verkrijgen, begint u met het mengen van het wildtype DNA en het mutante DNA in verschillende verhoudingen.
Verdun de PCR-producten tot 0,1 nanogram per microliterconcentratie. Om de scheidingsgel te bereiden, mengt u de verse gel en kleurstof. Vervang de inlaatbuffer.
Plaats de spoelbuffer op de juiste ladeplaats van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Voeg 22 microliter van de verdunningsmarker toe aan de putjes van een 96-putplaat. Voeg nu twee microliter van de verdunde PCR-producten toe aan elk monsterput.
Voeg aan één Well een DNA-grootteladder toe uit een hooggevoeligheidskit, variërend van één tot 6.000 basenparen in grootte. Plaats de microplaat in het parallelle capillaire elektroforese-instrument in geselecteerde run op de instrumentsoftware. Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware.
Identificeer eerst de pieken op basis van hun bekende grootte. Kwantificeer elk amplicon om een kalibratiecurve te produceren. Controleer ten slotte of de relatieve hoeveelheden van de twee allelen correct zijn gemeten.
Deze kalibratiecurve wordt vervolgens gebruikt om de hoeveelheid structurele varianten te berekenen na PCR-versterking en parallelle capillaire elektroforese. Deze representatieve resultaten volgen op een verstorende insertie in het mutS-gen. Knockdowns en mutS leiden tot een hypermutatorfenotype, waardoor bacteriën meer mutaties kunnen bemonsteren dan hun basismutatiesnelheid.
Met behulp van de gepresenteerde methode werd de frequentie van de mutS-structurele variant gevolgd over 1000 generaties. Een niet-monotoon traject van het opkomende mutante allel werd onthuld. Het gemuteerde allel werd voor het eerst gedetecteerd bij generatie 680.
Het allel nam vervolgens snel in frequentie toe en bereikte 67% bij generatie 713. Deze toename stagneerde vervolgens en nam slechts 10% toe in de volgende 53 generaties, tot 76% Onverwacht daalde de mutante allelfrequentie vervolgens van 76% tot 49% in de loop van 13 generaties, waarna het toenam tot fixatie. Deze methode zal ten goede komen aan degenen die werken aan experimentele evolutie.
Dit protocol stelt de gebruiker in staat om bevroren archieven te nemen en evolutionaire trajecten te verkennen die anders niet waarneembaar zijn met endpoint sequencing-gegevens.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe kosteneffectieve methode voor het volgen van de dynamiek van structurele variant-allelen, specifiek inserties, tijdens experimentele evolutie. Door het ontwerp van triplicate primers te combineren met parallelle capillaire elektroforese, kan de techniek veranderingen in allelfrequenties in de loop van de tijd onthullen, wat het nut ervan aantoont bij het bestuderen van evolutionaire trajecten.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Genetica
- Experimentele evolutie
- Structurele varianten
Achtergrond
- Structurele varianten waren lastig te kwantificeren met behulp van conventionele methoden.
- Het amplificeren en meten van de frequentie van insertie-allelen is essentieel voor het begrijpen van hun rol in de evolutie.
- De methode is bedoeld als aanvulling op bestaande sequencingtechnieken.
Gebruikte methoden
- Triplet PCR-techniek gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese
- Bacterieel modelsysteem (mutS-gen)
- Kwantitatieve beoordeling van allelfrequenties
Belangrijkste resultaten
- Een niet-monotoon traject van een mutS-allel over 1000 generaties is succesvol gevolgd.
- Complexe dynamiek is onthuld waarbij de mutatiefrequentie aanvankelijk sterk steeg en daarna afnam vóór fixatie.
- De toepassing bij het analyseren van gefixeerde bevroren monsters voor evolutionaire studies is aangetoond.
Conclusies
- De studie introduceert een robuuste methode voor het observeren van de dynamiek van structurele varianten die anders door endpoint-sequencing over het hoofd worden gezien.
- Deze aanpak biedt belangrijke implicaties voor onderzoekers die experimentele evolutie en pathogeendynamiek bestuderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het kwantificeren van de dynamiek van allelen van structurele varianten (SV) is essentieel voor het begrijpen van genetische adaptatie en fenotypische diversiteit in microbiële populaties en pathogenen. Deze methode maakt een precieze en kosteneffectieve tracking van SV-frequenties mogelijk, waardoor een belangrijk hiaat in de genomica in de ontdekkingsfase wordt opgevuld en het voorspellende vertrouwen in functionele studies naar varianten wordt ondersteund. De schaalbaarheid en compatibiliteit met gepoolde monsters maken het tot een waardevol instrument voor vroege ontdekking en translationele onderzoekspijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve tracking van SV-allelfrequenties mogelijk om variant-gestuurde fenotypes te verduidelijken.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door de opkomst van de novo allelen in evoluerende populaties te monitoren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door niet-monotone varianttrajecten over tijd bloot te leggen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door SV's in gepoolde monsters te kwantificeren.
- Standaardiseert de detectie van SV's met reproduceerbaar primerontwerp en capillaire elektroforese-uitlezingen.
- Maakt schaalbare, geparallelliseerde analyse mogelijk die geschikt is voor high-throughput variant-screeningworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante systemen door SV-kwantificering in intra-host pathogeenpopulaties mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door variantdynamiek in gearchiveerde monsters te volgen.
- Biedt voorspellende waarde voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in microbiologisch en pathogeenonderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door dynamische SV-tracking mogelijk te maken, van vroege hypothese-testen tot translationeel onderzoek, in het bijzonder bij microbiële systemen en pathogenen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseonderzoek en het verduidelijken van pathways door het kwantificeren van opkomende SV's.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve SV-metingen voor assay-gereedheid.
- Analytics: Biedt kalibratiegebaseerde kwantificering en vergelijkende analyse van allelfrequenties.
- Translationeel Onderzoek: Maakt SV-tracking mogelijk in natuurlijke en intra-host populaties, ter ondersteuning van biomarker-afstemming.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een breed toepasbare, kosteneffectieve workflow voor SV-kwantificering in diverse projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar SV-gedreven processen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare SV-kwantificering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door de impact van varianten in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van SV-gerelateerde targets en modellen mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primerontwerp en instrumentatie voor capillaire elektroforese.
- Toegang tot parallelle capillaire elektroforese en software voor kwantitatieve analyse is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van kalibratie- en normalisatieprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende SV-typen en contexten van samengevoegde monsters met geschikte primer-sets.
- Beperkt door de vereiste voor detecteerbare verschillen in amplicongrootte en kalibratienauwkeurigheid.
