Ontwikkeling van een op microfluïdica gebaseerde benadering voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren

Microtubuli zijn cytoskeletpolymeren die een essentiële rol spelen bij celdeling en intracellulair transport. In deze studie gebruiken we microfluïdica om de mechanica van microtubuli in vitro te bestuderen. Dit werk behandelt twee specifieke beperkingen voor het bestuderen van microtubuli in microfluïdische apparaten, het potentieel voor luchtbellen, die eiwitten kunnen denatureren en het gebrek aan gebruik van tests met hoge doorvoer. Ons microfluïdische apparaat en protocol maken een reeks experimentele opstellingen mogelijk met robuustere testmogelijkheden met hoge doorvoer dan onze vorige flowceltesten.

[Docent] Om te beginnen, plasmareinigt u een siliciumwafel van drie inch gedurende vijf minuten onder vacuüm met behulp van zuurstof of schoon plasma met droge lucht. Zorg ervoor dat de vacuümdruk lager is dan vijf keer tien tot de macht min vijf torr. Centreer de schone siliciumwafer op de spincoder voor fotoresistente afzetting en deponeer één tot twee milliliter SPR 227.0 fotoresist op het midden van de siliciumwafel. Draai de fotoresist om een 13 micrometer dikke laag te verkrijgen met 1000 omwentelingen per minuut gedurende 30 seconden. Terwijl het contact met het gecoate oppervlak tot een minimum wordt beperkt, brengt u de siliciumwafel over naar een kookplaat die is ingesteld op 70 graden Celsius. Incubeer de siliciumwafel op de hete plaat en verhoog de temperatuur elke drie tot vijf minuten met 10 graden Celsius totdat de temperatuur 115 graden Celsius bereikt. Zet vervolgens de kookplaat uit en laat de siliciumwafel afkoelen tot de temperatuur onder de 65 graden Celsius is. Breng met een tang de afgekoelde wafer over naar de maskeraligner. Laad zowel de siliconenwafer als het juiste fotomasker in de aligner volgens de fabrikant- of locatiespecifieke protocollen, stel de wafer nu bloot aan ultraviolette straling met een energie van ongeveer 400 millijoule per vierkante centimeter. Bereken de vereiste belichtingstijd met behulp van de formule. Dompel de wafer na rehydratatie en warmtebehandeling onder in de juiste ontwikkelaar. Spoel vervolgens beide zijden van de wafel voorzichtig af met gedeïoniseerd water gedurende 30 seconden. Na het drogen van de ontwikkelde wafer met stikstofgas, brengt u deze over in een exsiccator Plaats een klein aluminium bakje in de exsiccator en voeg een druppel silaan toe aan het aluminium bakje. Giet na droging het gemengde en ontgaste polydimethylsiloxaan op de hoofdvorm in een petrischaaltje. Incubeer het gerecht een nacht bij 65 graden Celsius om PDMS volledig te laten uitharden. Gebruik rond de functies van het apparaat een scalpel of scheermesje om rechthoekige stukjes PDMS uit de hoofdlaag te snijden. Zorg ervoor dat elk stuk voldoende flankerende ruimte heeft voor een goed hechtingscontact en past op een glazen afdekglaasje van 22 bij 22 millimeter. Plaats het PDMS op een reserve opofferings-PDMS-laag en vermijd harde oppervlakken. Maak vervolgens met een schone perforator van 1,5 millimeter inlaat- en uitlaatgaten in elk PDMS-stuk. Pak nu een glazen afdekstrookje van 22 bij 22 millimeter en maak het schoon met een doekje dat is ingeklemd met isopropylalcohol. Reinig vervolgens de glazen afdekplaat vijf minuten onder vacuüm met behulp van schoon, droog luchtplasma. Veeg zowel het glazen afdekplaatje als de zijkant van het PDMS af met doekjes met isopropylalcohol voordat u beide in de plasmareiniger plaatst en reinig ze tegelijkertijd 30 seconden onder vacuüm met behulp van schoon, droog luchtplasma. Keer na het reinigen het PDMS om zodat de kant naar beneden wijst. Plaats de PDMS op de glazen afdekplaat en druk lichtjes aan om de hechting te bevorderen. Gestabiliseerde microtubuli-extensies werden gebogen door een stromende bufferoplossing loodrecht op hun groeirichting, wat het vermogen aantoont om richtingskracht in het apparaat uit te oefenen. De stroomsnelheid in de buurt van het oppervlak die door microtubuli werd ervaren, werd berekend als 92 micrometer per seconde met behulp van simulatie en analytische modellering op basis van de Navier-Stokes-vergelijking. Computationele simulaties toonden de vaststelling van stabiele gradiënten over het apparaat aan, experimenteel bevestigd door een fluorescerende kleurstof die voorspelbare concentratiepatronen vertoonde. Dubbel gelabelde microtubuli-extensies, bevestigde gradiëntgebaseerde partitionering met verschillende fluorescerende eiwitten die domineren in verschillende ruimtelijke zones langs het apparaat.