Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

We hebben grootschalige microfluïdische chips ontwikkeld om multiomics-analyse mogelijk te maken, met als doel het metabolische mechanisme van neuronen na axonale beschadiging te illustreren. We gebruiken voornamelijk microfluïdische technologie, metabole fluxanalyse en transcriptomics om het onderzoek naar de metabole mechanismen van neuronen tijdens axonale beschadiging en regeneratie vooruit te helpen. We ontdekten dat er metabole verschillen zijn tussen corticale neuronen bij verschillende ontwikkelingsstoornissen en dat jonge neuronen metabole hermodellering ondergaan na uitwendig letsel.

Het belangrijkste voordeel van ons protocol ligt in het ontwerp van het microfluïdische platform op grotere schaal en de operationele standaarden, die nauwkeurige multiomics en de grootte van miljoenen cellen mogelijk maken. Breng om te beginnen de PDMS-basis en het uithardingsmiddel over in een centrifugebuis. Plaats de centrifugebuis met het mengsel in een centrifugaalmenger.

Centrifugeer tweemaal gedurende vier minuten bij 2 000 G om te mengen en te ontgassen. Giet 13 tot 15 gram van de ontgaste PDMS in de microfluïdische mal en zorg ervoor dat de bodem van de mal volledig bedekt is. Plaats nu de mal in een vacuümexsiccator en gebruik vervolgens een vacuümpomp om lucht gedurende vijf tot 10 minuten te evacueren om luchtbellen grondig uit het PDMS te verwijderen.

Tik met een rubberen bol zachtjes op het oppervlak van het PDMS om eventuele resterende oppervlaktebellen te breken. Breng de vorm over naar een heteluchtoven en bak 100 minuten op 80 graden Celsius om de polydimethylsiloxaan uit te harden. Zodra het PDMS volledig is uitgehard, schuift u de punt van een scalpel voorzichtig onder de rand van het PDMS om het voorzichtig op te tillen en van de vorm te scheiden.

Gebruik een biopsiepons met een diameter van 2,0 tot 2,5 millimeter om gaten in het PDMS te maken voor infusie van kweekmediums en celbelasting. Verwijder eventuele onzuiverheden op het oppervlak van het PDMS met plakband, plaats het vervolgens in een schone glazen schaal en wikkel het in aluminiumfolie voor opslag. Voorafgaand aan het experiment autoclaveert u het microfluïdische apparaat gedurende vijf minuten op 121 graden Celsius en 101 kilopascal om steriliteit te garanderen.

Plaats een dekglaasje bedoeld voor conventionele microfluïdische apparaten in een kweekschaaltje van 35 millimeter. Voeg twee milliliter 0,1 milligram per milliliter poly-D-lysineoplossing toe aan het gerecht. Incubeer het gerecht zes uur of een nacht op 37 graden Celsius.

Haal na de incubatie voorzichtig de poly-D-lysineoplossing op voor hergebruik of correcte verwijdering. Voeg nu twee milliliter steriel ultrapuur water toe aan de schaal. Draai het 50 keer met de klok mee, gevolgd door 50 keer tegen de klok in.

Zuig het water op met behulp van een vacuümpomp die is aangesloten op een steriele pipetpunt en verzamel afval in een container voor vloeibaar afval. Nadat alle wasbeurten zijn voltooid, laat u de dekglaasjes voor gebruik op natuurlijke wijze aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast. Plaats met behulp van een steriele tang met fijne punt de geautoclaveerde microfluïdische chip in het midden van het glasoppervlak met de microkanalen naar beneden gericht.

Druk de chip voorzichtig op het glasoppervlak met behulp van een pipetpunt van 200 microliter om een volledige hechting te garanderen. Markeer vervolgens de linkerkamer met een stip met behulp van een permanente marker om het soma-compartiment aan te duiden. Zuig 10 microliter neuronale suspensie op met een pipet van 10 microliter en doseer de suspensie vervolgens langzaam in de laadpoort boven het gemarkeerde soma-compartiment.

Controleer of de vloeistof goed in het onderste reservoir van de linkerkamer stroomt. Breng de kweekschaal gedurende 20 minuten over naar een bevochtigde broedmachine op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Plaats de schaal na incubatie onder een 20X-microscoop om de media-overvloed van het soma-compartiment naar het axonale compartiment via de microkanalen te bevestigen.

Piket nu 150 microliter neuronaal basaal medium naar de bovenste poort van het axonale compartiment. Voeg op dezelfde manier 150 microliter compleet neuronaal medium toe aan de bovenste poort van het soma-compartiment. Giet vervolgens 20 milliliter ultrapuur water in een kweekschaal van 150 millimeter om een vochtigheidskamer te creëren.

Plaats de 35 millimeter kweekschaal in de grote schaal, breng vervolgens het hele kweeksysteem over naar de broedmachine en onderhoud deze gedurende de vereiste duur. Gebruik een petrischaaltje van 10 centimeter breed voor het plaatsen van het grootschalige microfluïdische apparaat. Kies voor seeding met een volledig kanaal of een intervalkanaal op basis van experimentele behoeften, aangezien elke methode verschillende protocollen voor axonale beschadiging vereist.

Nadat het zaaien is voltooid, voegt u vijf milliliter compleet neuronkweekmedium toe aan de petrischaal om de groei van neuronen te behouden. Breng een geschikte hoeveelheid neuronaal basale media over in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter voor later gebruik. Plaats een microfluïdisch apparaat met corticale neuronen op een schone bank.

Droog met pluisvrij papier de bodem van de 35 millimeter kweekschaal en gebruik vervolgens een pipet van 200 microliter om het medium uit de twee gaten aan de rechterkant van het microfluïdische apparaat op te zuigen. Sluit vervolgens de slang van een vacuümpomp aan op een steriele, filtervrije pipetpunt van 200 microliter. Zet de vacuümpomp aan met een zuigsnelheid van 60 liter per minuut en richt de punt op het verbindingspunt tussen het onderste gat van de axon-aansluitkamer en de kamer om het oude medium aan te zuigen, waardoor axonbreuk ontstaat als gevolg van onderdruk.

Plaats de pipetpunt terug en zuig 150 microliter neuronaal basaal medium op, voeg het langzaam toe door het onderste gat van de rechterkamer. Vervang na vier keer toevoegen en aspiratie door een vers compleet neuronaal medium, aspireer vervolgens het oude medium uit het zijgat van het cellichaam en voeg indien nodig een vers compleet neuronaal medium met medicijnen toe. Plaats het microfluïdische apparaat samen met de kweekschaal in een kweekschaal van 150 millimeter en blijf gedurende de vereiste tijd, zoals 24 uur, kweken.

Voor handmatige axonale verwonding, zaad neuronen in alle kamers van het grootschalige microfluïdische apparaat. Incubeer het apparaat drie dagen lang bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Op dag zeven in vitro verwijdert u het kweekschaaltje met het microfluïdische apparaat uit de broedmachine en plaatst u het op een steriel podium.

Bereid een microscoop voor met een vergroting van 20x en steriliseer het werkgebied met 75% ethanol. Houd een steriel gefilterde pipetpunt van 10 microliter vast en identificeer axonbundels in de originele microkanaaltjes onder microscoopbegeleiding. Maak longitudinale krassen langs elke axonbundel met behulp van de pipetpunt.

Bekijk de axonbreuk onder de microscoop in realtime. De microkanalen van een standaard microfluïdisch apparaat maken de groei van axonen mogelijk, maar niet van soma, zoals bevestigd door bèta-drie tubulinekleuring na zeven dagen in vitro. Neuronale dichtheid vertoonde geen significant verschil na axonale beschadiging, wat wijst op geen waarneembare neuronale dood.

Voor multiomics-analyses werd een grootschalig microfluïdisch apparaat met een driedimensionaal uitbreidbaar ontwerp ontwikkeld. Zowel ongeperforeerde als geperforeerde PDMS-replica's hechtten stevig op schotels van 10 centimeter of printplaten. Axonale schade veroorzaakt door krassen aan de pipetpunt leidde tot duidelijk afgesneden axonen met verstoorde morfologie, in tegenstelling tot intacte axonen voorafgaand aan de verwonding.

Axonale regeneratie werd zowel zes uur als 24 uur na het letsel waargenomen, terwijl niet-beschadigde axonen stabiel bleven. De neuronale eiwitconcentratie steeg significant van 1420,4 microgram per milliliter bij aanvang tot 1748,9 per milliliter na zes uur en 1823,7 microgram per milliliter 24 uur na het letsel. RNA-opbrengsten van controle- en axonbeschadigde groepen waren bijna identiek.

RNA-sequencing onthulde 595 letselspecifieke genen en 609 controlespecifieke genen, met 17.471 genen gedeeld tussen groepen. Analyse van de KEGG-route identificeerde significante opregulatie van oxidatieve fosforylering, respons van reactieve zuurstofsoorten, autofagie en TCA-cyclusroutes na verwonding.