Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

We bestuderen biofilms als beschermende structuren die het voortbestaan van de omgeving en gastheer mogelijk maken, en onderzoeken de vormingsdynamiek, moleculaire samenstelling, adaptieve kenmerken en bijdrage aan infectie. Door kristalbio-assay, tijdtekstbeeldvorming, confocale microscopie, scanning-elektronenmicroscopie en transcriptomics in onze laboratoria te combineren, wordt biofilmonderzoek bevorderd door geïntegreerde multidimensionale analyse. Om te beginnen kweek je Leptospira-cellen in EMJH-medium in glazen buizen met platte schroefdop.

Incubeer de culturen onder aerobe omstandigheden bij 30 graden Celsius zonder te schudden totdat ze halverwege de logaritmische fase bereiken. Zorg ervoor dat de culturen een optische dichtheid bereiken tussen 0,2 en 0,4 op 405 nanometer, wat overeenkomt met twee tot vijf keer 10 tot de kracht van acht cellen per milliliter. Gebruik een donkerveldmicroscoop op 20x vergroting om te controleren of de cellen modaal zijn en niet samengeklontert.

Verdun de geverifieerde mid-log aritmische fasecultuur in een verhouding van één tot 100 in vers EMJH-medium tot ongeveer één keer 10 tot de kracht van zes cellen per milliliter en meng voorzichtig door inversie zonder vortexen. Gebruik nu een steriele pincet om één 0,1 micrometer steriel hydrofiel polycarbonaatmembraan plat op de bodem van elke put in een steriele 24-put plaat met deksel te plaatsen. Voeg één milliliter steriel EMJH-medium toe aan elke put en week het membraan twee uur voor bij 30 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de weekoplossing uit elke put zonder het membraan te verplaatsen en voeg 1,5 milliliter verdunde bacteriële suspensie toe, zodat het membraan aan de onderkant stevig op zijn plaats blijft. Plaats vervolgens een met water gevulde bak in de broedmachine om de vochtigheid te behouden. Incubeer de plaat bij 30 graden Celsius onder statische omstandigheden om biofilmvorming mogelijk te maken.

Laat de plaat tot drie weken liggen voor langzaam groeiende stammen. Op het gewenste tijdstip aspireer je zorgvuldig zoveel mogelijk kweekmedium zonder de biofilm te verstoren. Spoel elke plant voorzichtig af met één milliliter steriele PBS terwijl het membraan plat tegen de onderkant blijft.

Voeg één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS toe aan elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten om de biofilmmonsters te fixeren. Na de incubatie verwijder je het fixatiemiddel en spoel je voorzichtig twee keer met één milliliter PBS. Voeg één milliliter 0,1% gewichts per volume kristalvioletoplossing toe aan elke put en laat het 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen, waarbij je ervoor zorgt dat de deksel volledig onder water is.

Gooi daarna de kristalviolette kleurstof uit elke put en spoel twee keer af met één milliliter PBS. Kantel de plaat en laat alle resterende vloeistof aflekken. Laat de plaat op kamertemperatuur aan de lucht drogen totdat het substraat volledig droog lijkt, bij voorkeur een nacht.

Voeg vervolgens 500 microliter elucian-buffer toe, bestaande uit 50% ethanol en 50% glaciale azijnzuur per volume, aan elke put. Pipetteer op en neer om de vlek die aan de biofilm vastzit volledig op te lossen. Breng nu 200 microliter van elk monster over naar een optisch heldere microplaat met 96 putten.

Meet de absorptie op 570 nanometer en trek achtergrondwaarden af van niet-geïnënfiseerde controles die in alle stappen worden verwerkt. Noteer het gemiddelde en de standaarddeviatie voor ten minste drie technische replica's. Verkrijg de biofilms in putplaten zoals eerder getoond.

Voeg een oplossing van 4% paraformaldehyde en 1% glutaraldehyde toe in een 0,2 molaire natriumbuffer bij pH 7,4 in de putjes. Incubeer de vaste monsters 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder het fixatiemiddel en spoel het monster twee keer af met PBS om de aan het oppervlak vastzittende biofilm te behouden en loslating te minimaliseren.

Dompel nu de deksel onder in 1% osmiumtetroxide verdund in PBS en incubeer een uur om het contrast van de scanning-elektronenmicroscopie te verbeteren. Spoel daarna het substraat twee keer af met PBS. Dehydrateer de monsters door ze achtereenvolgens 10 minuten in een gegradeerde ethanolreeks te dompelen.

Voeg vervolgens 500 microliter hexamethyldisilazaan toe en incubeer vijf minuten. Vervang daarna met verse hexamethyldisilazaan en laat het nog eens vijf minuten incuberen. Verwijder daarna de overtollige oplossing en laat het monster volledig aan de lucht drogen onder een afzuigkap.

Bevestig nu de gedroogde monsters op scanning-elektronenmicroscopie-stompjes met dubbelzijdige geleidende koolstoftape. Sputter-coaten de monsters met een dunne laag, ongeveer 10 nanometer goud of platina, om het elektronencontrast voor beeldvorming te verbeteren. Laad tenslotte de voorbereide stompjes in de scanning elektronenmicroscoop met behulp van de juiste monsterhouder.

Ontruim de kamer indien mogelijk een nacht om de beeldkwaliteit te verbeteren. Vervolgens worden secundaire elektronbeelden verworven bij vijf tot vijftien kilovolt met geschikte vergrotingen om de ultrastructuur van de biofilm te visualiseren. Na 21 dagen incubatie onthulde kristalvioletkleuring zichtbare biofilmpatronen op zowel polycarbonaatfilters als glazen afdekkingen voor leptospira interrogans en leptospira biflexa.

Elke soort vertoont verschillende architectonische voetafdrukken zoals stipvorige, vertakkende of netvormige vormen. Absorptiemetingen op 570 nanometer bevestigden een grotere retentie van kristalviolet in leptospira byflexa-biofilms vergeleken met leptospira-interrogans over alle tijdspunten, wat wijst op een hogere biomassaaccumulatie in de stam. Scanning-elektronenmicroscopie van leptospira interrogans biofilms legde vroege extracellulaire matrixafzettingen vast in drie dagen oude biofilms, een rijpe en gekanaliseerde basale zijde met driedimensionale structuur na 14 dagen en volledig ontwikkelde matrixconsolidatie met dichte architectuur na 21 dagen.

Ons geoptimaliseerde protocol synchroniseert complementaire uitlezingen van identieke culturen, verhoogt de robuustheid, vermindert variabiliteit en onthult dynamische en structurele informatie die beschikbaar is met enkelmethode-benaderingen. Door complementaire analyse te integreren, standaardiseerden onze bevindingen biofilmbeoordeling en verduidelijkten we de dynamiek en architectuur van leptospira. Ze koppelen structuur aan virulentie en versterken reproduceerbaar vergelijkend onderzoek.

Toekomstige mutanten koppelen regulatie aan biofilmmorfologie en dynamiek, het verduidelijken van de omgevingspersistenz en het evalueren van strategieën die biofilminformatie verstoren of verspreiding bevorderen.