Name: Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer een modulaire workflow voor kwantitatieve en structurele analyse van Leptospira-biofilms met kristalviolet-assays, microscopie en in vivo-modellen. Deze gestandaardiseerde methode verhoogt reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 &micro;m steriele hydrofiele polycarbonaatmembraan</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm steriele glazen dekglas</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde (PFA)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>21G naald</td><td>BD Medical</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>24-well microplaat</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodemschaal</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>35-mm glazen bodem Hi-Q4 schaal</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplaat</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Antifade montage medium&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Carbon coater</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>CFDA/SE tracer</td><td>Biolegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Geleidende koolstoflijm</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Kristalviolet (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Donkerveldmicroscoop</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B uitgerust met een donkerveld condensor (cat nr&deg; 11505142)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>IJsazijn</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazaan</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde confocale microscoop</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Confocale microscoop SP8</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop uitgerust met fase-contrast optica</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Medium Base EMJH&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp;279410</td><td>EMJH medium voor Leptospira</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (OsO4)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodide&nbsp;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscoop</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Natrium cacodylat buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer Varioskan Lux</td><td>Thermo Scientific</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (1 mL)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 groen fluorescerende nucleïnezuurkleuring&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Wanneer het inoculum correct is bereid, gaan culturen binnen 3-5 dagen in de halverwege logitaritmafase en vertonen OD405-waarden van ~ 0,2-0,4 met heldere, sterk beweeglijke velden onder donkerveldmicroscopie (≥ 90% van de cellen beweeglijk) en geen zichtbare klonten. Suboptimale preparaten presenteren zich als trage bacteriën en heterogene motiliteit over het hele veld; Dergelijke culturen leveren vaak zwakke biofilms op en moeten worden weggegooid. In de praktijk minimaliseert het direct voor het zaaien naast elkaar bevestigen van motiliteit en OD mislukte runs. Het opzetten van deze kwaliteitscontrolepoorten in de inoculumfase is de beste voorspeller van succes in downstream toepassingen. Hoewel de methodologie geoptimaliseerd was voor L. interrogans serovar Manilae L495, werden dezelfde procedures ook toegepast op de stam Leptospira biflexa Patoc om de toepasbaarheid van verschillende soorten aan te tonen. L. biflexa vormt over het algemeen minder samenhangende en dunnere biofilms dan L. interrogans, maar de karakteristieke ontwikkelingssequentie en structurele kenmerken blijven detecteerbaar met passende parameteraanpassingen. Het opnemen van beide soorten benadrukt dus de aanpassingskracht van de workflow aan zowel pathogene als saprofytische Leptospira .
Na 21 dagen statische incubatie bij 30 °C in een bevochtigde kamer (of de juiste duur voor de gebruikte Leptospira-soort ), worden biofilms zichtbaar voor het blote oog op zowel glazen dekfolies als hydrofiele polycarbonaatmembranen. Succesvolle groei levert na 2-3 weken karakteristieke CV-patronen op, zoals stipachtige, vertakkende of netvormige voetafdrukken die aan het oppervlak vastzitten (Figuur 2A).
In een typische run bereikt wildtype L. interrogans Manilae L495 tegen week 3 ~ 50% oppervlaktedekking, terwijl de laag-biofilm mutanten een plateau van bijna ~ 20% en high-biofilm fenotypes ~ 70-80% naderen, wat een praktisch dynamisch bereik voor screening creëert. De mate van biofilmvorming kan ook variëren afhankelijk van de Leptospira-soort en stam; zo ontwikkelt L. biflexa Patoc-stam zichtbare biofilms sneller, waarbij eerdere studies structuren al vanaf 120 uur na de inoculatie als volwassen biofilms35 beschouwden.
Kristalvioletkleuring biedt een betrouwbare en reproduceerbare methode om biofilmbiomassa te kwantificeren. In goed ontwikkelde biofilms resulteert kleuring in diepe paarse kleuring die gelokaliseerd is op het bedekkings- of membraangebied, wat wijst op hoge niveaus van gehechte biomassa (Figuur 2A). Visuele aanwijzingen tijdens de kleurings- en oplosbaarheidsstappen zijn ook nuttige indicatoren van het succes van het protocol. Zo kan een ongelijke CV-verdeling of bleke verkleuring het gevolg zijn van onderzaaiing, verdamping of agressief wassen dat vroege biofilms losmaakt.
Absorptiemetingen bij 570 nm weerspiegelen de hoeveelheid vastgehouden kleuring, en daarmee de relatieve biofilmdichtheid (Figuur 2B). In representatieve experimenten tonen L. interrogans-culturen die onder optimale omstandigheden zijn gekweekt, consistente en reproduceerbare OD₅₇₀-metingen over replicaten, wat een stabiele biofilmvorming weerspiegelt. Daarentegen worden vaak grote variaties tussen replicaten waargenomen wanneer monsters overmatig pipetteren tijdens mediumwisselingen, wat wijst op slechte adhesie of gedeeltelijke biofilmloslating. Dergelijke variabiliteit moet worden beschouwd als een teken van technische problemen, en de getroffen monsters moeten worden uitgesloten of het protocol zorgvuldig worden beoordeeld. Opmerkelijk is dat L. biflexa Patoc onder vergelijkbare omstandigheden uitgebreidere biofilms vormt op zowel glazen coverslips als polycarbonaatmembranen, wat tot uiting komt in hogere CV-absorptiewaarden, wat aantoont dat het protocol aanpasbaar en effectief is bij Leptospira-soorten .
Succesvolle SEM-voorbereiding kan extracellulaire matrixafzettingen al vanaf dag 3 onthullen, gevolgd door een opvallend gepolariseerde architectuur in volwassen biofilms: een ruwe, gekanaliseerde basale zijde (vaak met &gt; kanalen van 5 μm) die een poreuze binnenstructuur verankert, en een gladder apikal vlak waar spirocheten verstrengeld liggen in een dichte matrix (Figuur 2C, D, E, F). Velden met hoge vergroting vangen vaak vertakkende extracellulaire filamenten en af en toe paddenstoelachtige uitsteeksels op; kenmerken die overeenkomen met de coalescentiedynamiek die wordt gezien door time-lapse (Aanvullende video 1). In suboptimale preparaten kunnen ingestorte matrices, lading en onduidelijke celcontouren worden waargenomen, meestal wat leidt tot onvoldoende postfixatie, onvoldoende geleidende coating of slechte droging. Wanneer basaal-apikale polariteit en doordringende kanalen zichtbaar zijn, komen SEM-uitlezingen nauw overeen met confocale schattingen van dikte en porositeit, wat de succesvolle uitvoering van zowel voorbereiding als beeldvorming bevestigt.
In effectieve time-lapse-series verschijnen geïsoleerde puncta binnen 24-72 uur en smelten geleidelijk samen tot grotere aggregaten die over het oppervlak vegen voordat ruimtebeperkingen hun beweging vertragen (Figuur 3A, B, C). Kwantitatieve segmentatie zorgt voor een monotone toename van het totale bedekte gebied, terwijl de aggregate tellingen stijgen, pieken en vervolgens dalen doordat botsingen en fusies domineren tussen ~12 en 216 uur. Deze kinetiek (oppervlakte omhoog, aantal aggregaten omlaag) duidt op actieve accretie in plaats van eenvoudige sedimentatie. Mislukte of borderline runs missen vroege puncta, laten vlakke area-over-time curves zien, of hebben focus drift die in verband staat met onstabiele temperatuur/vochtigheid. Het behouden van een gestabiliseerde omgeving van 30 °C met 95% luchtvochtigheid en het gebruik van autofocus op elk tijdstip herstelt doorgaans duidelijke trajecten die geschikt zijn voor het vergelijken van mutanten of behandelingen.
Representatieve Z-stacks uit volwassen biofilms vertonen schuimachtige, meerlaagse architectuur die doorgaans meer dan 50 μm dik is, waarbij de meeste cellen levend kleuren (SYTO 9-positief) en af en toe centrale holtes die wijzen op collectieve herschikkingen tijdens groei (Figuur 3D). Matrixprobes kunnen worden gebruikt om matrixsamenstelling te onderzoeken: WGA benadrukt polysaccharide epitopen, BOBO-3 labelt overvloedig extracellulair DNA, en eiwitselectieve kleuringen leveren weinig extern celgeassocieerd signaal (Figuur 3E). Suboptimale resultaten zijn dunne of discontinue stapels die worden gedomineerd door propidiumjodide, sterke fotobleaching of inconsistente versterkingsinstellingen, die elk de kwantitatieve vergelijkbaarheid ondermijnen. Het samen interpreteren van dikte-, biovolume- en live/dead-verhoudingen (terwijl laservermogen, detectorversterking en gaatje constant blijven over omstandigheden) bevestigt de rijpingsstatus en ondersteunt directe vergelijkingen met SEM-ultrastructuur en CV-biomassa.
Het proces van biofilmvorming van Leptospira volgt doorgaans verschillende fasen, hoewel exacte tijdstippen en waarden kunnen variëren afhankelijk van de soort of stam. Met L . interrogans-stam Manilae L495 als referentie omvat de verwachte progressie over 21 dagen een beginfase (dagen 0-3) waarin bacteriën grotendeels planktonisch blijven met minimale biofilm (Figuur 4A). Hierop volgt een exponentiële groeifase (dag 3-7) waarin zowel planktonische als biofilm-geassocieerde bacteriën toenemen, tot ongeveer 9 x 10⁸ cellen/mL, gepaard met de vorming en uitbreiding van biofilmaggregaten. Tussen dag 7 en 12 nemen planktonische bacteriën aanzienlijk af, terwijl biofilm-geassocieerde cellen pieken en ongeveer 80% van de populatie vertegenwoordigen. Ten slotte neemt tijdens de rijpingsfase (dag 12-21) het aantal biofilmbacteriën af zonder toename van planktonische cellen, maar de grootte en complexiteit van de biofilm blijven toenemen. Het observeren van deze reeks veranderingen geeft aan dat het protocol effectief de dynamische ontwikkeling en rijping van Leptospira-biofilms vastlegt.
Wanneer correct uitgevoerd, gebruikt het infectieprotocol inocula met ~2 x 10⁸ leptospitsen in 200 μL EMJH, bereid uit goed gedefinieerde planktonische (5-daags) of biofilm (21-dagen) culturen. Hoewel deze twee kweektypen verschillende fysiologische toestanden vertegenwoordigen, is dit verschil opzettelijk, aangezien het experiment wil bepalen of Leptospira-biofilms – gekenmerkt door verminderde metabole activiteit en structurele differentiatie – het vermogen behouden om infectie te initiëren. Dit contrast wordt ondersteund door transcriptomische studies die grote verschuivingen in genexpressie tussen planktonische en biofilm Leptospira35,36 aantonen. Biofilmaggregaten worden zorgvuldig geoogst om hun structuur te behouden en blijven intact na passage door een 21 G-naald, zoals bevestigd vóór injectie (Figuur 4C, D). Na intraperitoneale injectie vertonen gouden Syrische hamsters meestal klinische tekenen van leptospirose binnen 3 tot 5 dagen (bijv. lusteloosheid, ruige vacht, prostratie). Negatieve controles die alleen met EMJH-medium zijn geïnjecteerd, vertonen geen tekenen van ziekte. De progressie en ernst van klinische symptomen, evenals de tijd tot euthanasie, variëren afhankelijk van het inoculum: planktonische bacteriën veroorzaken vaak eerder en meer acute symptomen, terwijl biofilm-afgeleide aggregaten een vertraagde maar aanhoudende infectie kunnen veroorzaken (Figuur 4B). Door twee keer per dag tot 21 dagen te monitoren, kan het volledige ziekteverloop vasthouden.
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figuur 2. Kristalviolette kleuring, kwantificering en ultrastructurele beeldvorming van Leptospira-biofilms. (A) Kristalviolet (CV) kleuring van biofilms die op verschillende substraten zijn gegroeid. CV-kleuring maakt visualisatie mogelijk van biofilmarchitectuur en initiële hechtingspatronen voor verschillende soorten en substraten. i. L. interrogans op een polycarbonaatfilter; ii. L. biflexa op polycarbonaatfilter; iii. L. ondervragingen op glazen dekmantel; iv. L. biflexa op glazen omslaglijst. (B) Voorbeeld van kwantitatieve biofilmvorming beoordeeld door CV-absorptie (OD570 nm) over de tijd voor L. interrogans en L. biflexa. Deze kinetische meting legt zowel vroege adhesie als biomassa-accumulatie dynamiek vast, en benadrukt verschillen in biofilmgroei tussen pathogene en saprofytische soorten. Dit cijfer is aangepast van27. (C-E) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) van L. interrogans-biofilms: (c) 3 dagen oude biofilm die vroege microkolonievorming en initiële extracellulaire matrixafzetting toont; (d) 14 dagen oude biofilm met volwassen architectuur met uitgebreide matrix en driedimensionale organisatie; (E-F) 3 weken oude biofilm die structurele consolidatie en matrixrijping over langdurige kweek illustreert. Deze combinatie van CV-kleuring, kwantitatieve OD-metingen en SEM-beeldvorming biedt een uitgebreid overzicht van de ontwikkeling van biofilms, van vroege hechting tot volwassen ultrastructurele organisatie, waardoor directe vergelijking tussen soorten en kweekduur mogelijk is. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3. Visualisatie van de vorming van Leptospira-biofilm . Fasecontrastbeelden die met een BioStation zijn gemaakt, tonen biofilmontwikkeling bij (A) 48 uur, (B) 96 uur en (C) 144 uur. (D) CLSM-reconstructie van een Leptospira-biofilm die het totale biovolume toont met orthogonale sneden voor 3D-visualisatie. (E) Confocale kleuring van een rijpe biofilm met DAPI (groen) en WGA (rood), waarbij bacteriële cellen en extracellulaire matrixcomponenten worden benadrukt. Deze figuur is aangepast van37. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figuur 4. Tijdsopgeloste kwantificering van planktonische en biofilmfracties en functionele beoordeling van Leptospira-biofilms . (A) Kinetiek van biofilmvorming gemeten door absorptie bij 405 nm. Voor elk tijdstip werden metingen genomen van de totale put, de biofilmfractie en de supernatant met planktonische leptospires, waardoor onderscheid kon worden gemaakt tussen vastzittende en vrij zwemmende bacteriën. (B) Voorbeelden van overlevingscurves van hamsters die zijn geïnjecteerd met biofilmaggregaten, planktonische leptospitsen of EMJH-controle. Biofilm-geïnjecteerde dieren vertonen een verminderde virulentie, waarvan sommige 21 dagen overleven, terwijl planktonische leptospitsen snelle sterfte veroorzaken. (C-D) Voorlopige validatie van biofilmintegriteit: aggregaten zijn zichtbaar in de spuit vóór injectie (C) en blijven intact na passage door een 21 G naald (D, witte pijlen), wat bevestigt dat de biofilmstructuur tijdens het gebruik behouden blijft. Dit cijfer is aangepast van36. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Here, we present an integrated suite of protocols for the cultivation, quantitative monitoring, structural and functional characterization of Leptospira ...

a-modular-workflow-for-quantitative-structural-functional-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van...

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Leer een modulaire workflow voor kwantitatieve en structurele analyse van Leptospira-biofilms met kristalviolet-assays, microscopie en in vivo-modellen. Deze gestandaardiseerde methode verhoogt reproduceerbaarheid.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Meer video's verkennen