Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Ons laboratorium bestudeert PARP1- en PARP2-afhankelijke DNA-reparatie en DNA-schade responsroutes in normale en getransformeerde cellen. Een uitdaging in het veld is de kwantitatieve analyse van PARP1- en PARP2-activatie in cellen, waarbij cellyse wordt vermeden. Dit maakt subcellulaire lokalisatiestudies mogelijk.

Om te beginnen voeg je 375 microliter foetaal rundserum en penicilline-streptomycine vrije DMEM toe aan een 1,5 milliliter steriele microcentrifugatiebuis. Voeg vervolgens 10 microliter van een lipiden-gebaseerd transfectie-reagens en alle benodigde plasmiden toe aan de buis. Tik voorzichtig op de microcentrifugatiebuis om het medium, transfectiereagens en plasmide-DNA te mengen.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten om de vorming van DNA- en transfectie-reagenscomplexen mogelijk te maken. Voeg vervolgens het plasmide- en transfectie-reagensmengsel druppelgewijs toe aan de 60-millimeterschaal met de gekweekte 293FT-cellen zonder het medium te verwijderen en de cellen 48 uur terug te brengen in de broedmachine. Vervolgens verzamel je het kweekmedium uit de getransfecteerde cellen van 293 voet.

Om de lentivirusdeeltjes te isoleren, filter je het verzamelde medium door een steriel 0,45-micrometer filter om celresten van de lentivirale deeltjes te scheiden. Voor transductie wordt de gewenste cellen gedurende 24 uur gekweekt en gecontroleerd dat de celconfluentie tussen 20% en 40% ligt. Voeg vervolgens één milliliter virus, één milliliter groeimedium en twee microliter Polybrene toe aan een 15-milliliter conische buis, voorzichtig gemengd door inversie. Verwijder nu het groeimedium van de zes-hol plaat.

Voeg het virus, medium en Polybreen-mengsel toe aan elke put. Plaats de cellen met het transductiemengsel in een broedmachine met een bevochtigde atmosfeer van 32 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 16 tot 18 uur. Om de expressie van de RNF146-aminozuren te valideren, 100 tot 182 EGFP, zaad 200.000 LivePAR-expressieve cellen per kweekschotel met dekfolie.

Laat de cellen 24 tot 36 uur aan de afdekstukken hechten, conditioner het medium en begin met repliceren. Vervolgens worden de LivePAR-expressieve cellen blootgesteld aan de gegeven reagentia. Voeg de verbindingen direct toe aan het medium met de cellen op de deksels, en draai het medium voorzichtig in de celkweekschaaltjes om de verbindingen te verspreiden.

Incubeer de 60-millimeter schalen op 37 graden Celsius gedurende 60 tot 90 minuten. Om de cellen te herstellen, verwijder je het medium en was je de cellen met PBS. Geef de cellen een prefix met 4% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de formaldehyde spoel je de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens drie milliliter koud methanol en aceton toe aan de cellen in een verhouding van 7:3 om ze te fixeren. Zet de schalen negen minuten op min 20 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de methanol-acetonoplossing. Na het drie keer wassen van de cellen met PBS, pipetteer je 15 microliter antifade-medium met DAPI op een glazen glaasje. Bevestig voorzichtig de deksel op het montagemedium met de cellen naar binnen gericht, terwijl je bellen minimaliseert.

Centreer en bevestig de deksel op de glazen schuin en sluit de zijkanten af door een kleine hoeveelheid transparante topcoat nagelemaille aan te brengen. Leg de glaasjes in het donker zodat het nagelglazuur kan drogen. Na het downloaden en installeren van Image J open je Image J en installeer je het macro-tekstbestand LivePAR_Macro door op Plugins te klikken, Macro's te selecteren en Installeren te kiezen.

Open alle confocale bestanden in Image J en sla de bestanden op als TIFF-bestanden om de originele bestanden te behouden. Open vervolgens een spreadsheetdocument en sla het op als Date_CellLineFociAnalysis. Analyseer één TIFF-bestand tegelijk.

Druk op 1 om de kernen te vinden. Wanneer het ROI-managervenster opent, selecteer je alle vermeldingen en druk je op toevoegen om het kerngebied over de originele afbeelding te leggen. Verwijder verkeerd geïdentificeerde kernen en sluit kernen uit die niet volledig binnen het kader vallen.

Teken vervolgens de kern met het Freehand Selection-instrument en druk op 2 om PAR-foci te kwantificeren. Selecteer elke kern in de ROI-manager en tel het aantal brandpunten per kern. Kopieer en plak de gekwantificeerde gegevens in het open spreadsheetdocument nadat alle kernen in het bestand zijn gescoord.

Herhaal de analyse op dezelfde manier voor alle TIFF-bestanden. Als je klaar bent, teken je PAR-brandpunten per kern in de software van keuze. Voertuigcontrolecellen vertoonden pancellulaire EGFP-kleuring.

Met genotoxine behandelde cellen toonden een ophoping van nucleaire foci die lokalisatie binnen de kern vertegenwoordigen. Voorbehandeling met de PARP1- en PARP2-remmer veliparib resulteerde in het verlies van PAR-foci. Kwantificering van het aantal PAR-foci per kern als functie van tijd en behandelomstandigheden liet vergelijkbare resultaten zien.

Dit protocol stelt ons in staat de activatie van de PARP1- en PARP2-signaalas te kwantificeren als reactie op genotoxines en na genetische veranderingen. We hebben traditionele immunofluorescentietechnieken gebruikt bij deze assay om colocalisatie van eiwitten met poly ADP-ribose te valideren. Vooruitkijkend gebruiken we deze assay voor genotoxiciteitstests, voor high-throughput-analyses van PARP1-, PARP2- of PARP-remmers, en voor het identificeren van nieuwe factoren die betrokken zijn bij PARP1- en PARP2-signalering.