Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty
25 kwietnia 2018
Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie zastosowania fotoaktywowanego peptydu MHC do indukowania spolaryzowanej sygnalizacji w limfocytach T. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transdukcji sygnału komórek odpornościowych, takie jak to, w jaki sposób limfocyty przekazują szybkie zlokalizowane sygnały, a następnie montują spolaryzowane odpowiedzi komórkowe na te sygnały. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje przestrzenną czasową kontrolę sygnalizacji limfocytów T.
Czyni to poprzez ustalenie dokładnego czasu i miejsca aktywacji receptora limfocytów T. Procedurę zademonstruje Elisa Sanchez, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od dodania biotynylowanej poli-L-lizyny lub bio-PLL, rozcieńczonej od jednego do 500 w destylowanej wodzie dejonizowanej do ośmiodołkowego szkła nakrywkowego.
Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie suszyć przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Powierzchnie pokryte bio-PLL należy zablokować buforem blokującym składającym się z buforowanej soli fizjologicznej HEPES z 2% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji należy usunąć bufor blokujący z powierzchni pokrytych bio-PLL, nie dopuszczając do wyschnięcia studzienek. Następnie dodaj streptawidynę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie umyj powlekane powierzchnie w HBS.
Napełnij i odwróć studzienki ślizgowe komory cztery do pięciu razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie pozwól, aby studzienki wyschły. Dodać specyficzne biotynylowane, fotoaktywowane peptydy, główne ligandy kompleksu zgodności tkankowej i cząsteczki adhezyjne dla limfocytów T CD4-dodatnich lub komórek CD8-dodatnich do powierzchni pokrytych bio-PLL.
Chronić przed światłem i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć jak poprzednio i pozostawić w HBS do momentu przygotowania do wysiewu. Na koniec dodaj 200 000 limfocytów T CD4 dodatnich lub CD8 dodatnich wyrażających odpowiedni TCR do odpowiednich dołków i pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania. Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym całkowitym odbiciem wewnętrznym wyposażonego w soczewkę obiektywową 150X zgodną z UV. Monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nanometrów i 561 nanometrów.
Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, w razie potrzeby wyreguluj ustawienia mikroskopu, aby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie Live (Na żywo) wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące Cię sondy fluorescencyjne. Ustal obszary skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego.
Następnie rozpocznij akwizycję. Zazwyczaj wymaganych jest 80 punktów czasowych w odstępie pięciu sekund między nimi. Pozostawia to czas na sekwencyjne ekspozycje 488 nanometrów i 563 nanometrów w przypadku eksperymentów z dwoma kolorami.
Następnie, po zdobyciu 10 punktów czasowych, fotoaktywuj wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na jedną do 1,5 sekundy. Po upływie czasu wybierz nowe pole komórek i powtórz proces. Zacznij od określenia intensywności fluorescencji obszaru tła poza komórką, który ma być używany do korekcji tła.
Narysuj kwadratowy obszar o wielkości mikronów na zewnątrz komórki i zrób maskę. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj, Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości.
Określ intensywność fluorescencji w obszarze aktywowanym fotoaktywem dla każdego punktu czasowego. Wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj, Statystyki maski.
Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i Eksportuj wartości. Uzyskaj współrzędne X i Y środka obszaru aktywowanego zdjęciem, wybierając opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Po podświetleniu regionu fotoaktywacji wybierz Analizuj, Statystyki maski, Środek obszaru i Eksportuj wartości.
Określ współrzędne X i Y interesującej Cię sondy fluorescencyjnej. Wybierz opcję Manual Particle Tracking (Ręczne śledzenie cząstek) i kliknij sondę fluorescencyjną, która Cię interesuje w miarę upływu czasu. Po wyśledzeniu wszystkich punktów czasowych wybierz Analizuj, Maskuj statystyki, Środek obszaru i Eksportuj wartości.
Limfocyty T umieszczono w komorze na szkle nakrywkowym zawierającym fotoaktywowany MCC-IEFK. C1-GFP, sonda dla drugiego przekaźnika lipidowego DAG, została zobrazowana za pomocą mikroskopii TIRF i RFP-tubuliny w trybie epifluorescencji. Zlokalizowana fotoaktywacja powierzchni pod limfocytem T indukuje akumulację DAG w napromieniowanej strefie.
Po tym następuje w ciągu kilku sekund reorientacja centrosomu w tym samym regionie. Akumulację C1-GFP można określić ilościowo, obliczając znormalizowaną intensywność fluorescencji po korekcji tła w środku obszaru aktywowanego fotoaktywem w czasie. Reorientację centrosomów w odpowiedzi na fotoaktywację można określić ilościowo, obliczając odległość między centrosomem a środkiem obszaru aktywowanego fotoaktywem w funkcji czasu.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż jeden dzień, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zazwyczaj w tym czasie generujemy od 15 do 20 filmów poklatkowych do analizy. Takie podejście utorowało naukowcom drogę do zbadania precyzyjnej kinetyki i polaryzacji aktywacji sygnalizacji w limfocytach T.
Został również przystosowany do badania sygnalizacji hamującej w komórkach NK. W rezultacie, mamy teraz lepsze zrozumienie tego, w jaki sposób komunikacyjne interakcje komórek odpornościowych są składane i rozpuszczane.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T z wykorzystaniem fotoaktywnego kompleksu peptyd-MHC, co umożliwia precyzyjną spatiotemporalną kontrolę aktywacji komórek T. Technika ta pozwala badaczom na analizę sposobu, w jaki limfocyty transdukują szybkie, zlokalizowane sygnały i generują spolaryzowane odpowiedzi komórkowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Sygnalizacja komórkowa
- Neuronauka
Wprowadzenie
- Zrozumienie aktywacji limfocytów T jest kluczowe dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Fotoaktywne peptydy MHC stanowią nowatorskie podejście do badania sygnalizacji limfocytów T.
- Metoda ta umożliwia badanie dynamiki przestrzenno-czasowej w komórkach odpornościowych.
- Polaryzacja sygnalizacji w limfocytach T jest niezbędna dla skutecznych odpowiedzi immunologicznych.
Cel badania
- Opisanie metody indukowania sygnalizacji spolaryzowanej w limfocytach T.
- Zbadanie mechanizmów szybkiej lokalnej transdukcji sygnału w komórkach odpornościowych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu umożliwiającego badaczom powtórzenie badania.
Zastosowane metody
- Zastosowanie biotynilowanej poli-L-lizyny (bio-PLL) w komorowych szkiełkach podstawowych.
- Wykorzystanie fotoaktywowalnego peptydu MHC do aktywacji limfocytów T.
- Techniki obrazowania służące do monitorowania odpowiedzi limfocytów T.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez studenta studiów doktoranckich.
Główne wyniki
- Skuteczna aktywacja limfocytów T z precyzyjną kontrolą przestrzenną.
- Wykazanie polaryzacji sygnalizacji w odpowiedzi na lokalne bodźce.
- Przedstawienie wglądu w dynamikę aktywacji receptorów limfocytów T.
- Umożliwienie dalszej eksploracji szlaków sygnalizacyjnych komórek odpornościowych.
Wnioski
- Protokół stanowi cenne narzędzie do badania aktywacji limfocytów T.
- Przestrzenno-czasowa kontrola zwiększa zrozumienie odpowiedzi immunologicznych.
- Metoda ta może prowadzić do postępów w badaniach immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji receptora limfocytów T, odpowiadając na kluczową potrzebę w badaniach nad immunologią i immunoterapią w zakresie analizy szybkich, spolaryzowanych zdarzeń sygnalizacyjnych. Poprzez powiązanie stymulacji TCR z następczą reorganizacją cytoszkieletu, metoda ta stanowi narzędzie do mechanistycznej weryfikacji ryzyka przy walidacji celów w terapiach angażujących limfocyty T. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając ilościowy, wysokorozdzielczy monitoring dynamiki transdukcji sygnału, istotny dla opracowywania biologicznych i małocząsteczkowych immunomodulatorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez umożliwienie lokalnej aktywacji TCR, co pozwala wyjaśnić szlaki sygnalizacyjne prowadzące do tworzenia synapsy immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez odczyty polaryzacji odpowiedzi, takie jak akumulacja DAG i reorientacja centrosomu.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez ujawnienie kinetycznych i przestrzennych parametrów transdukcji sygnału, które są krytyczne dla skuteczności immunomodulatorów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy oddziaływań limfocytów T z pMHC do dalszego screeningu związków lub przeciwciał z kontrolowanym czasem aktywacji.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia standaryzowany pomiar zmian intensywności fluorescencji w sondach lipidowych (np. C1-GFP) oraz repozycjonowanie organelli jako odczyty funkcjonalne.
- Skalowalność i ponowne użycie: Kompatybilność z perturbacjami genetycznymi i farmakologicznymi pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnych klasach celów i strategiach perturbacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje tworzenie synapsy immunologicznej, kluczowego procesu w odporności zapśredniczonej przez limfocyty T, istotnego w przypadku wskazań autoimmunologicznych, zakaźnych i onkologicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesne zdarzenia sygnałowe z efektami funkcjonalnymi, wspierając decyzje o postępach w modelach przedklinicznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Wyjaśnia związek przyczynowy między zaangażowaniem TCR a polaryzacją cytoszkieletu, zmniejszając niejednoznaczność w badaniach nad mechanizmem działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celów terapeutycznych oraz umożliwiając opracowanie testów do przesiewowej analizy immunomodulatorów przed etapem identyfikacji wiodących kandydatów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację aktywacji TCR jako zmiennej niezależnej w celu zbadania węzłów sygnalizacyjnych i zależności szlaków w dół kaskady.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnej, kontrolowanej światłem aktywacji oraz mierzalnym odczytom fluorescencyjnym kompatybilnym z obrazowaniem zautomatyzowanym.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (np. znormalizowaną intensywność fluorescencji, przemieszczenie centrosomu), co umożliwia porównywanie warunków i modelowanie dynamiki sygnałów.
- Badania translacyjne: Łączy molekularne zdarzenia inicjujące z polaryzacją komórkową, co jest zgodne z funkcjonalnymi testami powiązanymi z biomarkerami w walidacji przedklinicznej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę obrazowania do kontroli czasoprzestrzennej, która ma zastosowanie w różnych parach TCR–pMHC i typach komórek odpornościowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej we wczesnych zdarzeniach sygnalizacyjnych TCR.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki precyzyjnej aktywacji kontrolowanej światłem oraz mierzalnym odczytom opartym na TIRF.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę wierności sygnału i zdolności polaryzacyjnej immunomodulatorów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie angażowania celu z funkcjonalnym tworzeniem synaps, co jest prognostykiem skuteczności terapeutycznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli limfocytów T, transfekcji sond fluorescencyjnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.
- Zależy od zastosowania optyki kompatybilnej z promieniowaniem UV, fotoaktywowalnych odczynników pMHC oraz infrastruktury do obrazowania dwukolorowego.
- Wymaga standaryzacji czasu fotoaktywacji, wyboru obszaru oraz korekcji tła we wszystkich grupach użytkowników i ośrodkach.
- Obejmuje kwestie adaptacji dla różnych swoistości TCR, sond fluorescencyjnych i podtypów komórek odpornościowych (np. komórek NK).
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko fototoksyczności wynikające z ekspozycji na promieniowanie UV oraz konieczność szybkiej akwizycji obrazów w celu uchwycenia subsekundowej dynamiki sygnalizacji.
