Name: Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC, umożliwiającą precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową sygnałowania komórkowego. Technika ta pozwala badać polaryzację odpowiedzi immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Huse za rady i pomoc. Wspierany przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01-AI087644 do M.H. i P30-CA008748 do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center).

1. Przygotowanie stymulujących powierzchni szklanych
<ol>
	<li>Pokryj szkło nakrywkowe z ośmiokomorową biotynylowaną poli-L-lizyną (Bio-PLL) rozcieńczoną w stosunku 1:500 w destylowanej, dejonizowanej wodzie (ddH2O). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Umyć za pomocąH2O.</li>
	<li>Suszyć przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powierzchnie pokryte Bio-PLL należy zablokować buforem blokującym (sól fizjologiczna buforowana przez HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], z 2% BSA) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 mg bromowodorku poli-L-lizyny w 1 ml 10 mM NaPO4 o pH 8,5.</li>
		<li>Dodać 125 μmol (0,55 mg) NHS-biotyny (z zapasu 100 mg/ml w DMSO) i sprawdzić pH reakcji. Jeśli pH jest poniżej 8,5, dodaj 2 μl 4 N NaOH, aby podnieść je do pH między 8,5 a 9,5.</li>
		<li>Wiruj przez 30 minut.</li>
		<li>Ugasić reakcję 50 μl 100 mM glicyny rozpuszczonej w 20 mM Tris pH 8,0.</li>
		<li>Wirować z pełną mocą przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. 
		UWAGA: Jakość Bio-PLL jest zwykle porównywana z poprzednimi preparatami poprzez seryjne dwukrotne rozcieńczenia materiału na 96-dołkowej płytce ELISA i ilościowe określenie zawartości biotyny po inkubacji ze streptawidyną sprzężoną z fosfatazą alkaliczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń bufor blokujący. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek. Dodać streptawidynę (100 μg/ml w buforze blokującym). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć w HBS. Napełnij i odwróć studzienki przesuwne komory 4 - 5 razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek.</li>
	<li>Dodaj biotynylowane ligandy pMHC i cząsteczki adhezyjne na powierzchnię. 
	UWAGA: MCC i OVA można fotoklatować poprzez dodanie grup ochronnych na bazie orto-nitrobenzylu (np. nitrofenyloetylu (NPE) lub nitroweratryloksykarbonylu (NVOC)) do grupy ε-aminowej kluczowych lizyn (K12 w MCC, K7 w OVA). Fotoklatki MCC i OVA można uzyskać od komercyjnych dostawców. Po rozpuszczeniu w buforze wodnym są one ponownie składane do ulegających ekspresji bakteryjnej I-Ek i H2-Kb przy użyciu ustalonych metod11,12.</li>
	<li>Walidacja fotoaktywowanego peptydu MCC lub OVA
	<ol>
		<li>Usuwanie peptydów chronionych przez NVOC poprzez naświetlanie promieniami UV za pomocą ręcznej lampy UV (patrz tabela materiałów) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Pulsować 1,0 x 105 APC z 1 μM peptydu niestymulującego (kontrola ujemna, np. Hb), nienapromieniowanego peptydu fotoaktywowanego, napromieniowanego peptydu fotoaktywowanego i peptydu agonistycznego (kontrola pozytywna, np. MCC) przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Aby stymulować limfocyty T wyrażające 5C. C7 / 2B4 / I TCR, użyj komórek CH12 lub CH27 B. Aby stymulować limfocyty T OT1, użyj komórek grasiczaka RMA-s lub EL4.</li>
		<li>Zmieszać pulsacyjne APC z równą liczbą limfocytów T w 96-dołkowych płytkach o okrągłym dnie w końcowej objętości 200 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-24 godziny.</li>
		<li>Odzyskać supernatanty z każdej studzienki i przeanalizować IL-2 za pomocą testu ELISA z detekcją kolorymetryczną streptawidyny i peroksydazy chrzanowej. 
		UWAGA: Zdecydowanie zaleca się potwierdzenie statusu chętnięcia wszystkich peptydów za pomocą spektrometrii mas elektrorozpylania przed ponownym złożeniem do kompleksów MHC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj składanie i oczyszczanie MHC, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Na przykład, owiń reakcje fałdowania w folię aluminiową i przeprowadź chromatografię filtracji żelowej przy wyłączonej lampie UV. 
	UWAGA: Stwierdzono, że fotoaktywowane MCC-I-Ek i OVA-H2-Kb indukują niezależną od UV aktywację limfocytów T przy dużej gęstości, prawdopodobnie z powodu niepełnego funkcjonalnego umieszczania w klatkach. W związku z tym fotoaktywowany pMHC jest rozcieńczany do 10-30-krotnego nadmiaru niestymulującego pMHC (np. I-Ek zawierającego peptyd hemoglobiny64-76 (Hb)) na etapie immobilizacji. Zwiększa to stosunek sygnału do szumu w kolejnym eksperymencie obrazowania.</li>
	<li>Aby fotoaktywować limfocyty T CD4 +, należy wspólnie użyć mieszaniny biotynylowanych Hb-I-Ek (3 μg / ml), biotynylowanych fotoaktywowanych MCC-I-Ek (0,1 μg / ml) i biotynylowanego przeciwciała przeciwko MHC H2-Kk klasy I (0,5 μg / ml). Przeciwciało anty-H2-Kk zachęca do 5C. Limfocyty C7/2B4/I T, które eksprymują H2-Kk, rozprzestrzeniają się na powierzchnię szkła bez poddawania się aktywacji.</li>
	<li>W przypadku limfocytów T CD8 + należy użyć mieszaniny biotynylowanych H2-Db zawierających peptyd KAVYDFATL (1 μg/ml), biotynylowanego fotoaktywowanego OVA-H2-Kb (0,1 μg/ml) oraz domeny zewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej ICAM-1 (2 μg/ml wytwarzanej przez hodowlę komórek owadów13). ICAM-1 zachęca do tworzenia bliskiego kontaktu poprzez angażowanie integryny LFA1 na powierzchni limfocytów T.</li>
	<li>Umieścić wszystkie mieszaniny białek w buforze blokującym, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Gęstość molekularna na powierzchniach tego rodzaju wynosząca ~8000 na μm2 została wcześniej określona6. Biorąc pod uwagę, że fotoaktywowany pMHC stanowi ~1/30tysięcznej biotynylowanego białka na powierzchni, jego gęstość wyniesie ~267 cząsteczek na μm2 przed delegacją.</li>
	<li>Umyć jak w kroku 1.6 i pozostawić w HBS do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać 200 000 limfocytów T CD4 + lub CD8 + wyrażających odpowiedni TCR do każdej studzienki i pozostawić komórkom do przylegania w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania. 
	UWAGA: Transdukcja retrowirusowa efektorowych limfocytów T za pomocą sond do obrazowania fluorescencyjnego jest szczegółowo opisana elswhere6,7. Sygnalizację wapniową można również badać za pomocą nietransdukowanych limfocytów T obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Fluo-46. Barwnik ratiometryczny Fura-2 nie jest zalecany, ponieważ wymaga wzbudzenia w zakresie UV, co również indukuje deaging fotoaktywowanego pMHC.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Do akwizycji obrazu należy użyć odwróconego mikroskopu TIRF wyposażonego w soczewkę obiektywu 150X zgodną z promieniowaniem UV. Promieniowanie UV naświetla obszary zdefiniowane przez użytkownika za pomocą cyfrowego systemu membranowego podłączonego do lampy rtęciowej o mocy 100 W (HBO). Skierować światło UV z tej lampy na próbkę za pomocą lustra o długości fali 400 nm.</li>
	<li>Korzystaj z oprogramowania do analizy obrazu do zlokalizowanej fotoaktywacji i akwizycji poklatkowej. W większości eksperymentów monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nm i 561 nm. Światło lasera jest kierowane na próbkę za pomocą dwupasmowego zwierciadła dichroicznego, które transmituje również w zakresie UV (aby umożliwić deklarację). Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów i Rysunek 6, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat konfiguracji mikroskopu.</li>
	<li>Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, w razie potrzeby wyreguluj ustawienia, aby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie na żywo wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące nas sondy fluorescencyjne. Ustal obszary w skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję poklatkową. Zazwyczaj pozyskiwanych jest 80 punktów czasowych w odstępie 5 s między każdym punktem czasowym. Pozostawia to więcej niż wystarczająco dużo czasu na sekwencyjne ekspozycje 488 nm i 563 nm, w przypadku eksperymentów z dwoma kolorami.</li>
	<li>Po upływie 10 punktów czasowych fotoaktywuj wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na 1 - 1,5 s.</li>
	<li>Po upływie czasu wybierz nowe pole komórek i powtórz proces.</li>
</ol>
3. Analiza danych
UWAGA: Zlokalizowana fotoaktywacja unieruchomionych ligandów tworzy dobrze zdefiniowany, stacjonarny region stymulujący, który może być wykorzystany do ilościowej analizy odpowiedzi sygnałowych i zdarzeń przebudowy cytoszkieletu. Protokoły analizy zazwyczaj obejmują albo ilościowe określenie intensywności fluorescencji w napromieniowanym obszarze, albo wykorzystanie napromieniowanego obszaru jako pozycyjnego punktu końcowego do pomiarów odległości (np. do oceny polaryzacji centrosomu w stosunku do napromieniowanego obszaru). Oba protokoły analizy zostały opisane poniżej. Różne interaktywne programy do analizy obrazu mogą być używane do wykonywania pomiarów intensywności i odległości, które można następnie wyprowadzić do dodatkowego przetwarzania i analizy.
<ol>
	<li>Intensywność fluorescencji
	<ol>
		<li>Określ intensywność fluorescencji (FI) obszaru tła na zewnątrz komórki (FIb). Zostanie to wykorzystane do korekcji tła.
		<ol>
			<li>Narysuj kwadratowy obszar o wielkości mikronów na zewnątrz komórki i zrób maskę. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj | Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości. 
			UWAGA: Szczegóły proceduralne (np. 3.1.1.1) odnoszą się do oprogramowania Slidebook (patrz Spis materiałów). Implementacja tego protokołu przy użyciu innych pakietów oprogramowania (np. FIJI) będzie nieco inna.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ FI w obszarze aktywowanym fotografią dla każdego punktu czasowego.
		<ol>
			<li>Wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj | Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odejmij FI tła od zmierzonych wartości FI w regionie. Następnie znormalizuj skorygowane pomiary FI, dzieląc przez średnią, skorygowaną o tło FI pierwszych 9 klatek przed fotoaktywacją. ΔF/F = ((FI-FIb)/średnia(FI1-9)-FIb)). 
		UWAGA: Wykres ΔF/F w funkcji czasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odległość
	<ol>
		<li>Uzyskaj współrzędne x i y środka obszaru aktywowanego zdjęciem.
		<ol>
			<li>Aby określić współrzędne x i y środka obszaru aktywowanego zdjęciem, wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Po podświetleniu regionu fotoaktywacji wybierz opcję Analizuj | Statystyki maski | Środek obszaru i wyeksportuj wartości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ współrzędne x i y dla interesującej nas sondy fluorescencyjnej dla każdego punktu czasowego. Zazwyczaj osiąga się to poprzez ręczne lub automatyczne śledzenie cząstek.
		<ol>
			<li>Aby określić współrzędne x i y interesującej nas sondy fluorescencyjnej, wybierz opcję Ręczne śledzenie cząstek i kliknij sondę fluorescencyjną, która Cię interesuje w czasie. Po śledzeniu wszystkich punktów czasowych wybierz pozycję Analizuj | Statystyki maski | Środek obszaru i wyeksportuj wartości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oblicz odległość między interesującym białkiem fluorescencyjnym a środkiem obszaru fotoaktywowanego dla każdego punktu czasowego za pomocą równania: Odległość = √(x2-x 1)2+(y2-y 1)2), w którym x2 i y2 są współrzędnymi interesującego białka fluorescencyjnego, a x1 i y1 są współrzędnymi środka obszaru aktywowanego fotoaktywem.</li>
		<li>Wykres odległości w funkcji czasu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Perspect.Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).</li>
<li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-14463-4_11">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li>
<li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading%3A+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li>
<li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+microbiology+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li>
<li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a, Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+%CE%B1+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82(2014).</li>
<li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li>
<li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li>
<li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li>
<li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li>
<li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li>
<li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC%3A+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li>
<li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-A2-peptide+complexes%3A+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li>
<li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+improved+light-induced+dimer+%28iLID%29+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li>
<li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+cell%2Funder+auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li>
<li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach światło stało się doskonałym narzędziem do czasowo kontrolowanej aktywacji procesów komórkowych. Opracowano różne metodologie, z których każda ma swoje zalety i wady. Opisany tutaj system, który opiera się na degeneracji unieruchomionych, zewnątrzkomórkowych ligandów, idealnie nadaje się do analizy szybkich, subkomórkowych, spolaryzowanych odpowiedzi sygnałowych. Podejście to zastosowano do zbadania tworzenia IS w limfocytach T, jak opisano powyżej. Ponadto zmodyfikowano ligandy w klatkach dla innych r...

Limfocyty T (limfocyty T) odgrywają kluczową rolę w odporności komórkowej, rozpoznając peptydy antygenowe wyświetlane w kontekście MHC na powierzchni komórki. Rozpoznawanie antygenu, w którym pośredniczy TCR, napędza różnicowanie naiwnych limfocytów T i sprzyja dostarczaniu odpowiedzi cytolitycznych i komunikacyjnych przez populacje efektorowe. Zaangażowanie TCR wywołuje również dramatyczne zmiany w architekturze komórkowej. W ciągu kilku minut limfocyty T zbrylają się po stronie komórki prezentującej antygen (APC), tworząc spolaryzowany interfejs znany jako synapsa immunologiczna (IS)1,2. IS nasila odpowiedzi efektorowe limfocytów T, umożliwiając kierunkowe uwalnianie cytokin lub, w przypadku cytotoksycznych limfocytów T (CTL), białek litycznych, które niszczą APC.
Zaangażowanie TCR przez pMHC indukuje szybką fosforylację wielu kolejnych cząsteczek adaptorowych, w tym Linkera do aktywacji limfocytów T (LAT), co ostatecznie sprzyja solidnej przebudowie cytoszkieletu synaptycznego2. Korowa aktyna nitkowa (F-aktyna) napędza rozprzestrzenianie się limfocytów T po powierzchni APC, a następnie przekształca się w strukturę pierścieniową charakteryzującą się akumulacją F-aktyny na obrzeżach IS i zubożeniem od środka. Tworzenie pierścienia F-aktyny jest ściśle sprzężone z reorientacją centrum organizacyjnego mikrotubul (MTOC, zwanego również centrosomem w komórkach T) do pozycji tuż poniżej środka interfejsu. Oba zdarzenia zachodzą w ciągu kilku minut od początkowego rozpoznania antygenu i ustanawiają kontekst architektoniczny, w którym zachodzą kolejne zdarzenia aktywacji i odpowiedzi efektorowe.
Aby badać powstawanie IS, różne laboratoria opracowały metody, w których APC jest zastępowane szklaną powierzchnią, która albo zawiera unieruchomione ligandy TCR, albo wspiera dwuwarstwę lipidową, która sama zawiera ligandy3,4. Limfocyty T tworzą na tych powierzchniach kontakty podobne do IS, które można obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej, umożliwiając badania w wysokiej rozdzielczości wczesnej aktywacji limfocytów T i tworzenia IS.
Chociaż te podejścia pozwoliły na doskonałą wizualizację w pełni złożonego IS, większość sygnalizacji po ligacji TCR:pMHC następuje w ciągu kilku sekund, komplikując wysiłki zmierzające do dokładnego określenia sekwencji zdarzeń następujących po aktywacji TCR. Aby obejść ten problem, opracowano podejście fotoaktywacyjne, w którym fotoaktywowany pMHC jest używany do osiągnięcia czasoprzestrzennej kontroli aktywacji TCR5,6,7. W tym systemie limfocyty T są przyłączone do szklanych powierzchni zawierających fotoaktywowany pMHC, który nie stymuluje TCR, dopóki nie zostanie naświetlony światłem ultrafioletowym (UV). Naświetlanie promieniami UV mikronowego obszaru powierzchni pod komórką T usuwa fotoklatkę, tworząc strefę stymulacyjną, która może być rozpoznana przez komórkę T. Kolejne zdarzenia sygnalizacyjne i przebudowa cytoszkieletu są następnie monitorowane za pomocą genetycznie kodowanych reporterów fluorescencyjnych. Opracowano dwie fotoaktywowane wersje peptydów antygenowych, cytochrom c88-103 (MCC) i albuminę jaja kurzego257-264 (OVA), które są przedstawione odpowiednio w kontekście klasy II MHCI-E k i klasy I MHCH2-K b (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Umożliwia to analizę obu limfocytów T CD4 + specyficznych dla MCC-I-Ek (wyrażających 5C. C7, 2B4 lub AND TCR) i limfocyty T CD8 + specyficzne dla OVA-H2-Kb (wyrażające TCR OT1).
W ciągu ostatniej dekady, metoda fotoaktywacji i obrazowania TCR została wykorzystana do ustalenia precyzyjnej kinetyki wczesnych etapów sygnalizacji TCR, a także do identyfikacji szlaków molekularnych rządzących spolaryzowaną przebudową cytoszkieletu5,6,7,8,9,10. Na przykład test odegrał zasadniczą rolę w ustaleniu, że reorientacja centrosomów w kierunku APC odbywa się za pośrednictwem zlokalizowanego gradientu drugiego przekaźnika lipidowego diacyloglicerolu wyśrodkowanego w IS. Przewiduje się, że metodologia ta będzie nadal przydatna w zastosowaniach, które wymagają analizy obrazowej funkcji limfocytów T w wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Będzie musiał wyprodukować biotynylowany poli-L-lizynę</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotyna</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Będzie musiał wyprodukować biotynylowany poli-L-lizynę</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowej BirA</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Będzie stosowany do biotynylacji białek</td></tr><tr><td>Biotynylowane Hb I-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w pozycji bibliograficznej 6. Do biotynylacji należy użyć zestawu BirA</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) można kupić w Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &alpha; Przeciwciało H2-Kk</td><td>Przeciwciało BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane NPE-OVA H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) można kupić w Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Niestandardowe zsyntetyzowane białko (KAVYDFATL) można kupić w Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w odniesieniu w protokole. Do biotynylacji należy użyć zestawu BirA</td></tr><tr><td>Ręczna lampa UV</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lampa jest trzymana < 1 cm od próbki.&nbsp; 30 s światła 365 wystarcza do wykrywalnego decytacji, 20 minut do ilościowego decytacji.</td></tr><tr><td>System Olympus IX-81 OMAC TIRF.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dodatkowe informacje na temat systemu obrazowania można znaleźć w Rysunek 6</td></tr><tr><td>Mosaic cyfrowa membrana</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Slidebook</td><td>Inteligentne innowacje w obrazowaniu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów t za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Limfocyty T angażują się w szybką, spolaryzowaną sygnalizację, która następuje w ciągu kilku minut po aktywacji TCR. Powoduje to tworzenie synapsy immunologicznej, stereotypowego połączenia komórka-komórka, które reguluje aktywację limfocytów T i kierunkowo celuje w odpowiedzi efektorowe. Aby skutecznie badać te procesy, konieczne jest podejście do obrazowania, które jest dostosowane do uchwycenia szybkich, spolaryzowanych reakcji. Protokół ten opisuje taki system, który opiera się na fotoaktywowanym peptydowo-głównym kompleksie zgodności tkankowej (pMHC), który nie jest stymulujący, dopóki nie zostanie wystawiony na działanie światła ultrafioletowego. Ukierunkowane detrykowanie tego odczynnika podczas eksperymentów wideomikroskopowych umożliwia precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji TCR i monitorowanie w wysokiej rozdzielczości kolejnych odpowiedzi komórkowych za pomocą obrazowania całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Podejście to jest również zgodne z genetycznymi i farmakologicznymi strategiami perturbacji. Pozwala to na tworzenie dobrze zdefiniowanych szlaków molekularnych, które łączą sygnalizację TCR z tworzeniem spolaryzowanych struktur cytoszkieletu, które leżą u podstaw synapsy immunologicznej.

Podejście oparte na fotoaktywacji i obrazowaniu umożliwia obserwację oraz łatwą kwantyfikację szybkich, spolaryzowanych odpowiedzi sygnalizacyjnych. Aby zilustrować jego możliwości, przedstawiono tutaj eksperyment badający korelację czasoprzestrzenną pomiędzy indukowaną przez TCR akumulacją DAG a reorientacją centrosomu. Blasty limfocytów T 5C.C7 zostały transdukowane retrowirusowo dwoma reporterami fluorescencyjnymi: biosensorem DAG zawierającym tandemowe domeny C1 z kinazy białkowej C-θ...

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie zastosowania fotoaktywowanego peptydu MHC do indukowania spolaryzowanej sygnalizacji w limfocytach T. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transdukcji sygnału komórek odpornościowych, takie jak to, w jaki sposób limfocyty przekazują szybkie zlokalizowane sygnały, a następnie montują spolaryzowane odpowiedzi komórkowe na te sygnały. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje przestrzenną czasową kontrolę sygnalizacji limfocytów T.Czyni to poprzez ustalenie dokładnego czasu i miejsca aktywacji receptora limfocytów T. Procedurę zademonstruje Elisa Sanchez, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od dodania biotynylowanej poli-L-lizyny lub bio-PLL, rozcieńczonej od jednego do 500 w destylowanej wodzie dejonizowanej do ośmiodołkowego szkła nakrywkowego.Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie suszyć przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Powierzchnie pokryte bio-PLL należy zablokować buforem blokującym składającym się z buforowanej soli fizjologicznej HEPES z 2% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji należy usunąć

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film demonstruje metodę dedukowania fotoaktywowanego kompleksu zgodności tkankowej peptydowego za pomocą promieniowania UV. Proces degeneracji odsłania natywną sekwencję peptydową, umożliwiając precyzyjną aktywację limfocytów T.

Ocena kontrolowanej aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

W tym protokole, kinaza białkowa A (PKA), bioefektor transdukcji sygnału komórkowego, została unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczki, mikrowstrzyknięta do cytozolu i aktywowana przez przekonwertowane światło UV z bliskiej podczerwieni (NIR), indukując rozpad włókien naprężeniowych w cytozolu.

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Poznaj metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC, umożliwiającą precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową sygnałowania komórkowego. Technika ta pozwala badać polaryzację odpowiedzi immunologicznych.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Przeglądaj więcej filmów