Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie zastosowania fotoaktywowanego peptydu MHC do indukowania spolaryzowanej sygnalizacji w limfocytach T. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transdukcji sygnału komórek odpornościowych, takie jak to, w jaki sposób limfocyty przekazują szybkie zlokalizowane sygnały, a następnie montują spolaryzowane odpowiedzi komórkowe na te sygnały. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje przestrzenną czasową kontrolę sygnalizacji limfocytów T.

Czyni to poprzez ustalenie dokładnego czasu i miejsca aktywacji receptora limfocytów T. Procedurę zademonstruje Elisa Sanchez, doktorantka z mojego laboratorium. Zacznij od dodania biotynylowanej poli-L-lizyny lub bio-PLL, rozcieńczonej od jednego do 500 w destylowanej wodzie dejonizowanej do ośmiodołkowego szkła nakrywkowego.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie suszyć przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Powierzchnie pokryte bio-PLL należy zablokować buforem blokującym składającym się z buforowanej soli fizjologicznej HEPES z 2% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji należy usunąć bufor blokujący z powierzchni pokrytych bio-PLL, nie dopuszczając do wyschnięcia studzienek. Następnie dodaj streptawidynę i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po godzinie umyj powlekane powierzchnie w HBS.

Napełnij i odwróć studzienki ślizgowe komory cztery do pięciu razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie pozwól, aby studzienki wyschły. Dodać specyficzne biotynylowane, fotoaktywowane peptydy, główne ligandy kompleksu zgodności tkankowej i cząsteczki adhezyjne dla limfocytów T CD4-dodatnich lub komórek CD8-dodatnich do powierzchni pokrytych bio-PLL.

Chronić przed światłem i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć jak poprzednio i pozostawić w HBS do momentu przygotowania do wysiewu. Na koniec dodaj 200 000 limfocytów T CD4 dodatnich lub CD8 dodatnich wyrażających odpowiedni TCR do odpowiednich dołków i pozwól komórkom przylegać w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania. Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym całkowitym odbiciem wewnętrznym wyposażonego w soczewkę obiektywową 150X zgodną z UV. Monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nanometrów i 561 nanometrów.

Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, w razie potrzeby wyreguluj ustawienia mikroskopu, aby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie Live (Na żywo) wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące Cię sondy fluorescencyjne. Ustal obszary skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego.

Następnie rozpocznij akwizycję. Zazwyczaj wymaganych jest 80 punktów czasowych w odstępie pięciu sekund między nimi. Pozostawia to czas na sekwencyjne ekspozycje 488 nanometrów i 563 nanometrów w przypadku eksperymentów z dwoma kolorami.

Następnie, po zdobyciu 10 punktów czasowych, fotoaktywuj wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na jedną do 1,5 sekundy. Po upływie czasu wybierz nowe pole komórek i powtórz proces. Zacznij od określenia intensywności fluorescencji obszaru tła poza komórką, który ma być używany do korekcji tła.

Narysuj kwadratowy obszar o wielkości mikronów na zewnątrz komórki i zrób maskę. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj, Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości.

Określ intensywność fluorescencji w obszarze aktywowanym fotoaktywem dla każdego punktu czasowego. Wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj, Statystyki maski.

Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i Eksportuj wartości. Uzyskaj współrzędne X i Y środka obszaru aktywowanego zdjęciem, wybierając opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Po podświetleniu regionu fotoaktywacji wybierz Analizuj, Statystyki maski, Środek obszaru i Eksportuj wartości.

Określ współrzędne X i Y interesującej Cię sondy fluorescencyjnej. Wybierz opcję Manual Particle Tracking (Ręczne śledzenie cząstek) i kliknij sondę fluorescencyjną, która Cię interesuje w miarę upływu czasu. Po wyśledzeniu wszystkich punktów czasowych wybierz Analizuj, Maskuj statystyki, Środek obszaru i Eksportuj wartości.

Limfocyty T umieszczono w komorze na szkle nakrywkowym zawierającym fotoaktywowany MCC-IEFK. C1-GFP, sonda dla drugiego przekaźnika lipidowego DAG, została zobrazowana za pomocą mikroskopii TIRF i RFP-tubuliny w trybie epifluorescencji. Zlokalizowana fotoaktywacja powierzchni pod limfocytem T indukuje akumulację DAG w napromieniowanej strefie.

Po tym następuje w ciągu kilku sekund reorientacja centrosomu w tym samym regionie. Akumulację C1-GFP można określić ilościowo, obliczając znormalizowaną intensywność fluorescencji po korekcji tła w środku obszaru aktywowanego fotoaktywem w czasie. Reorientację centrosomów w odpowiedzi na fotoaktywację można określić ilościowo, obliczając odległość między centrosomem a środkiem obszaru aktywowanego fotoaktywem w funkcji czasu.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż jeden dzień, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zazwyczaj w tym czasie generujemy od 15 do 20 filmów poklatkowych do analizy. Takie podejście utorowało naukowcom drogę do zbadania precyzyjnej kinetyki i polaryzacji aktywacji sygnalizacji w limfocytach T.

Został również przystosowany do badania sygnalizacji hamującej w komórkach NK. W rezultacie, mamy teraz lepsze zrozumienie tego, w jaki sposób komunikacyjne interakcje komórek odpornościowych są składane i rozpuszczane.