Name: Przetwarzanie mikromacierzy cDNA sosny Loblolly PtGen2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj techniki przetwarzania mikromacierzy cDNA PtGen2 sosny loblolly, w tym mycie przed i po hybrydyzacji. Ta metoda zapewnia spójność sygnału i redukcję tła w analizie ekspresji genów iglastych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisane tutaj protokoły znakowania, hybrydyzacji i płukania zawierają pewne modyfikacje metod opracowanych wcześniej przez dr. J. Quackenbusha w The Institute for Genomic Research (TIGR), dr. Shawna Levy’ego w Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) oraz dr. Roba Albę w Boyce Thompson Institute (BTI) przy Cornell University.

(Uwaga: Sekcje 1 - 4 nie zostały przedstawione w filmie)
Przygotowanie znakowanego Cy cDNA docelowego
Poniżej przedstawiono protokół stosowany do syntezy cDNA z całkowitego RNA sosny loblolly oraz pośredniego znakowania cDNA przed hybrydyzacją mikromacierzy. Pomimo wprowadzenia kilku istotnych modyfikacji, poniższy protokół jest zbliżony do procedury opisanej w instrukcji dołączonej do zestawu Invitrogen’s SuperScript Indirect cDNA Labeling Kit.
Część 1: Reakcja syntezy pierwszej nici cDNA
<ol>
	<li>Przed użyciem wymieszać i krótko odwiruzować każdy składnik zestawu.</li>
	<li>Przygotować reakcje w następujący sposób:
	<ul>
		<li>Xµl DEPC-H2O</li>
		<li>Xµl całkowitego RNA, 20 µg/reakcję (wstępnie potraktowane Turbo DNase firmy Ambion)</li>
		<li>2µl Anchored Oligo(dT)20 Primer (2,5µg/µl)</li>
		<li>1µl Random Hexamer Primer</li>
		<li style="list-style:none;">Objętość całkowita = 18µl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 70°C przez 5 minut, a następnie umieścić na lodzie na 1-2 minuty.</li>
	<li>Do każdej probówki z reakcją na lodzie dodać:
	<ul>
		<li>6µl 5X First-Strand buffer</li>
		<li>1,5µl 0,1M DTT</li>
		<li>1,5µl 10mM dNTP mix</li>
		<li>1µl RNaseOUT (40U/µl)</li>
		<li>2µl SuperScript III RT (400U/µl)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i krótko odwiruzować. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 45°C.</li>
	<li>Do każdej probówki z reakcją dodać 15µl 1M NaOH i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 70°C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 15µl 1M HCl; delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 20µl 3M octanu sodu (pH 5,2); delikatnie wymieszać.</li>
</ol>
Część 2: Oczyszczanie cDNA pierwszej nici.
<ol>
	<li>Dodać 500µl buforu do ładowania (Loading Buffer) do cDNA (z kroku 1.9) i dobrze wymieszać.</li>
	<li>Umieścić kolumnę oczyszczającą SNAP (dołączoną do zestawu do znakowania pośredniego) na probówce zbierającej i nanieść cDNA na kolumnę.</li>
	<li>Wirować przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzucić frakcję niezatrzymaną.</li>
	<li>Umieścić kolumnę SNAP na tej samej probówce zbierającej i dodać 500µl buforu do płukania (Wash Buffer).</li>
	<li>Wirować przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzucić frakcję niezatrzymaną.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 trzy razy, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania po 500µl.</li>
	<li>Wirować jeszcze raz przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzucić frakcję niezatrzymaną.</li>
	<li>Umieścić kolumnę SNAP na nowej probówce 1,5ml.</li>
	<li>Dodać 50µl ciepłej wody DEPC (50°C) do kolumny SNAP i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Eluować cDNA poprzez wirowanie przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.9, używając 100µl ciepłej wody DEPC i tej samej probówki 1,5ml do zbierania eluatu.</li>
	<li>Dodać 20µl 3M octanu sodu (pH 5.2) do eluatu z kroków 2.9 i 2.10.</li>
	<li>Dodać do probówki 3µl glikogenu (20mg/ml) i wymieszać.</li>
	<li>Dodać 500µl lodowatego 100% EtOH, dobrze wymieszać i inkubować probówkę przez 1 godzinę w temperaturze –80°C.</li>
	<li>Wirować probówkę przy 14 000g w temperaturze 4°C przez 20 minut. Ostrożnie usunąć nadnadpłyn.</li>
	<li>Dodać 500µl lodowatego 70% EtOH i wirować probówkę przy 14 000g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Ostrożnie usunąć nadnadpłyn.</li>
	<li>Suszyć próbkę na powietrzu przez 5 minut; upewnić się, że cały EtOH został usunięty.</li>
	<li>Podgrzać 2X bufor do sprzęgania (Coupling Buffer) w temperaturze 37°C przez 5 minut i resuspender próbkę cDNA w 5µl ciepłego 2X buforu do sprzęgania.</li>
	<li>Podgrzać cDNA w buforze do sprzęgania w temperaturze 50°C przez 10 minut i dobrze wymieszać na wortexie. Upewnić się, że osad cDNA został całkowicie resuspenderowany w 2X buforze do sprzęgania.</li>
</ol>
Część 3: Znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym
Podczas przygotowywania reakcji należy zadbać o zminimalizowanie ekspozycji roztworu barwnika na światło. Ponadto DMSO jest higroskopijny i pochłania wilgoć z powietrza, co powoduje reakcję z estrem NHS barwnika i znacząco obniża wydajność reakcji sprzęgania. DMSO dostarczony w zestawie należy przechowywać w bursztynowej fiolce z nakrętką w temperaturze –20°C, a przed otwarciem pozwolić fiolce ogrzać się do temperatury pokojowej, aby zapobiec kondensacji. Należy używać wyłącznie DMSO dołączonego do tego zestawu.
<ol>
	<li>Otwórz jedną paczkę barwnika Cy-3 lub Cy-5 i dodaj 75µl DMSO bezpośrednio do fiolki z barwnikiem.</li>
	<li>Dodaj 5µl roztworu DMSO/barwnika do probówki z kroku 2.18.</li>
	<li>Wymieszaj dokładnie i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodaj 20µl 3M octanu sodu (pH 5.2) do roztworu cDNA sprzężonego z barwnikiem.</li>
	<li>Dodaj 500µl buforu do nakładania (Loading Buffer) do roztworu cDNA. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.</li>
	<li>Umieść kolumnę SNAP na przezroczystej probówce zbierającej i nanieś roztwór cDNA/buforu.</li>
	<li>Wiruj przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzuć filtrat.</li>
	<li>Umieść kolumnę SNAP na tej samej probówce zbierającej; dodaj do kolumny 500µl buforu do płukania (Wash Buffer).</li>
	<li>Wiruj przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzuć filtrat.</li>
	<li>Powtórz kroki 3. 8-3.9 trzy razy, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania po 500µl.</li>
	<li>Wiruj jeszcze raz przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę; odrzuć filtrat.</li>
	<li>Umieść kolumnę SNAP na nowej, bursztynowej probówce zbierającej.</li>
	<li>Dodaj 65µl ciepłej wody z DEPC (50°C) do kolumny SNAP i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Wiruj przy 14 000g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i zbierz filtrat. Filtrat powinien zawierać 60µl oczyszczonego cDNA sprzężonego z barwnikiem.</li>
</ol>
Część 4: Ocena procedury znakowania.
<ol>
	<li>Przeprowadź pomiar spektrofotometryczny w celu oceny każdego znakowania Cy-cDNA. Oblicz całkowitą liczbę pmol zsyntetyzowanego cDNA: [OD260 x vol. x 37ng/μl x 103ng/pg]/324.5 pg/pmol. Oblicz całkowitą liczbę pmol wbudowanego barwnika Cy-Dye dla każdej reakcji znakowania: pmol Cy3 = [OD550 X vol.]/0.15; pmol Cy5 = [OD650 X vol.]/0.25. Następnie oblicz stosunek pmol nukleotydów do pmol barwnika dla każdej reakcji. Optymalne reakcje generują &gt;6000pmol cDNA (na 60ul), &gt;200pmol Cy-Dye (na 60ul) oraz stosunek nukleotydów do barwnika &lt;30.</li>
</ol>
Część 5: Wstępne przemywanie szkiełek
<ol>
	<li>Matryca PtGen2 jest naniesiona na szkiełka Corning UltraGaps (powlekane amino-silanem), a cDNA są sieciowane promieniami UV. Plamki są wyraźnie widoczne ze względu na wysoką zawartość soli w buforze.</li>
	<li>Użyj rysika z diamentową końcówką, aby zaznaczyć na szkiełku górny i dolny obszar pola nadruku (opcjonalnie).</li>
	<li>Wlej około 250mL roztworu 0,2% SDS podgrzanego do 43°C do kuwety do mycia szkiełek mikroskopowych (3” x 4”).</li>
	<li>Umieść szkiełka przeznaczone do prehybrydyzacji w statywie i zanurz je 15-20 razy bardzo energicznie w roztworze SDS, aby usunąć z powierzchni szkiełek sole.</li>
	<li>Używając pęsety, ostrożnie wyjmij szkiełka ze statywu i umieść je w słoiku Coplina zawierającym bufor do prehybrydyzacji (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) podgrzany do 43°C. Inkubuj w temperaturze 43°C przez co najmniej jedną godzinę.</li>
</ol>
Część 6: Prehybrydyzacja
<ol>
	<li>Przygotować pięć kuwet do płukania szkiełek, każdą wypełniając wodą dH2O typu millipure, oraz jeden słoik Coplina wypełniony izopropanolem klasy molekularnej. Umieścić szkiełka w statywie i przetwarzać sekwencyjnie w pięciu kuwetach, zanurzając je po 20 razy w każdej.</li>
	<li>Wyjmować szkiełka po dwa z piątego płukania w wodzie, zanurzyć 5-6 razy w izopropanolu, a następnie bezzwłocznie umieścić w mikrocentryfużce do szkiełek (Chipmate benchtop, 2 miejsca) i wirować przez 1 minutę w celu osuszenia.</li>
	<li>Oczyścić szkiełka sprężonym powietrzem filtrowanym przez wkład filtra 0.22 μM i umieścić je kodem kreskowym do góry w komorze do hybrydyzacji Genomic Solutions.</li>
	<li>Oczyścić LifterSlips™ filtrowanym powietrzem i ułożyć je na szkiełkach białymi paskami do dołu. Używając żółtej końcówki do pipety, delikatnie wyrównać położenie lifter slip na szkiełku (Wstępne płukanie LifterSlips™ w 70% etanolu jest opcjonalne. Uznano, że nie jest ono konieczne).</li>
</ol>
Część 7: Hybrydyzacja
Należy przeprowadzić w ciemności lub przy słabym oświetleniu.
<ol>
	<li>Dla każdego preparatu przeznaczonego do hybrydyzacji oblicz ilość cDNA znakowanego Cy-5 i Cy-3, aby uzyskać 50-75pmol każdego celu. Połącz te ilości w jednej probówce i wysusz w deskryptorze próżniowym przy ustawieniu temperatury na 37-45°C. Unikaj całkowitego wysuszenia!</li>
	<li>Resuspenduj wysuszone sondy w 60mL buforu do hybrydyzacji (przygotowanego w dniu doświadczenia) i krótko wymieszaj w wortexie.</li>
	<li>Inkubuj resuspendowane cDNA przez 5 minut w kąpieli o temperaturze 95°C, a następnie wiruj w mikrowirówce przez 30 sekund.</li>
	<li>Nanieś całą objętość resuspendowanej sondy, powoli pipetując w miejscu styku preparatu z LifterSlip™ na dole (przy kodzie kreskowym). Preparat zostanie wypełniony dzięki działaniu kapilarnemu. (Niektórzy wolą nanieść sondę bezpośrednio na preparat, a następnie delikatnie nałożyć LifterSlip™; jest to metoda jednorazowa, ponieważ w przypadku powstania pęcherzyków powietrza nie można przesuwać LifterSlip™ po jego umieszczeniu, co może prowadzić do artefaktów w postaci rozmazanych plam)</li>
	<li>Wprowadź 20uL 100mM DTT do każdego otworu nawilżającego znajdującego się na końcach komory.</li>
	<li>Nałóż pokrywę na komorę i dokręć śruby mimośrodowe. Owiń komorę folią aluminiową i zanurz w kąpieli wodnej o temperaturze 48°C na 12-18 godzin przy delikatnym mieszaniu z prędkością 50-60 rpm.</li>
</ol>
Część 8: Płukanie po hybrydyzacji
Wszystkie etapy płukania należy przeprowadzać w ciemności lub przy słabym oświetleniu. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia preparatów na szkiełkach aż do ostatniego etapu.
<ol>
	<li>Przygotować jeden słoik Coplina wypełniony Roztworem płuczącym nr 1 w temperaturze 53°C oraz cztery kuwety do mycia szkiełek wypełnione 250mL każdego z następujących roztworów: 1) Roztwór płuczący nr 1 w temperaturze 53°C, 2) Roztwór płuczący nr 2 w temperaturze pokojowej, 3 i 4) dwie kuwety zawierające Roztwór płuczący nr 3 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć szkiełka z komór hybrydyzacyjnych i wkładać je po dwa do słoika Coplina. Pozostawić na 30 sekund, a następnie powoli wyjąć szkiełko, tak aby pasek podtrzymujący (lifter slip) pozostał w słoiku. Umieścić szkiełka w statywie i natychmiast zanurzyć w Roztworze płuczącym nr 1 (1X SSC, 0.2% SDS, wstępnie podgrzanym do 43°C). Powtarzać czynność do momentu usunięcia wszystkich pasków podtrzymujących i umieszczenia wszystkich szkiełek przeznaczonych do mycia w kuwecie z Roztworem płuczącym nr 1. Energicznie zanurzać i wyjmować statyw 10 razy.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w temperaturze 53°C w wytrząsarce powietrznej i inkubować przy wytrząsaniu z prędkością 50-100 rpm przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść statyw do Roztworu płuczącego nr 2 (0.1X SSC, 0.2% SDS), zanurzyć 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przy wolnym wytrząsaniu przez 10 minut.</li>
	<li>Zanurzyć statyw 15 razy w pierwszej kuwecie z Roztworem płuczącym nr 3 (0.1X SSC), aby usunąć pozostałości SDS przeniesione z Roztworu płuczącego nr 2. Umieścić statyw w drugiej kuwecie z Roztworem płuczącym nr 3, zanurzyć 10 razy, a następnie poddać wolnemu wytrząsaniu przez 10 minut.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w zakręcanych probówkach Falcon 50mL i wirować z prędkością 1,500 rpm w wirówce wyposażonej w rotor z koszyczkami wahadłowymi. Przenieść szkiełka do pojemnika chroniącego przed światłem (stosujemy inną probówkę Falcon owiniętą folią aluminiową) i usunąć powietrze z probówki za pomocą azotu, a następnie szczelnie zakręcić (ogranicza to utlenianie barwników Cy, zwłaszcza Cy-5 latem, gdy poziom ozonu jest najwyższy). Szkiełka można przechowywać przez kilka godzin przed skanowaniem w probówkach przedmuchanych azotem; jednak najlepsze wyniki sygnału uzyskuje się, gdy skanowanie jest przeprowadzane natychmiast po myciu.</li>
</ol>
Część 9: Gromadzenie danych i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Dane obrazowania skanowania są zbierane przy użyciu urządzenia PerkinElmer ScanArray. Stosujemy ustawienie skanowania 10 micron oraz balansujemy sygnały Cy3 i Cy5, korzystając z metody korekcji linii zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Pliki TIF są siatkowane, a surowe dane sygnałowe są zbierane i filtrowane za pomocą oprogramowania ImaGene wersja 7.5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA).</li>
	<li>Normalizacja danych i ocena w celu wyłonienia statystycznie istotnych gatunków o zróżnicowanej ekspresji są przeprowadzane przy użyciu narzędzi BRB Array tools wersja 3.7.</li>
	<li>Analiza wzorców w celu ułatwienia określenia genów o koordynowanej ekspresji jest wykonywana za pomocą oprogramowania Gene Expression Pattern Analysis Software (GEPAS) wersja 3.1.</li>
</ol>
<img alt="Analiza mikromacierzy DNA, dane o ekspresji genów, wyniki eksperymentu, detekcja fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/1182/1182fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1. Przykład macierzy PtGen2 przetworzonej zgodnie z tym protokołem.
<img alt="Analiza ekspresji genów za pomocą mikromacierzy; detekcja fluorescencji na schemacie siatki; dane bioinformatyczne." src="/files/ftp_upload/1182/1182fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2. Przykład macierzy PtGen2 przetworzonej zgodnie ze standardowymi protokołami hybrydyzacji i przemywania.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 to niedawno opracowana, niestandardowa mikromatryca cDNA, zaprojektowana przede wszystkim do użytku przez społeczność badawczą zajmującą się sosną nadmorską (loblolly pine). Dotychczasowe wstępne wyniki wykazały, że matryca ta jest cennym narzędziem w ocenie zdarzeń transkrypcyjnych występujących w odpowiedzi na stres związany z suszą, a także w monitorowaniu zmian zachodzących podczas rozwoju embrionalnego sosny nadmorskiej, Pinus pinaster 5,6 Niedawno wykazaliśmy również, że PtGen2 sprawdza s...

<table><tbody><tr><td>Bufor przedhybrydyzacyjny</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA</td></tr><tr><td>Bufor do hybrydyzacji</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>30% formamid, 5X SSC, 5X roztwór Denhardta&amp;rsquo;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0,1% SDS</td></tr><tr><td>Roztwór płuczący nr 1</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>1X SSC, 0,2% SDS, podgrzać wstępnie do 43°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania nr 2</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC, 0,2% SDS</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania nr 3</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Inne</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Inne</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Należy użyć tej lub podobnej zatyczki umieszczonej w dnie każdej probówki stożkowej o pojemności 50 ml podczas wirowania</td></tr><tr><td>Naczynie Coplin</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia &amp;statyw </td><td>Inne</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Inne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>RNA z ogonem poli(A)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>Pośrednie znakowanie cDNA za pomocą SuperScriptTM </td><td>Zestaw do analiz</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Zestaw</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>System</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Cy-5</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Cy-3</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>Poślizgi podnośnika&amp;#8482;</td><td>Inne</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>HybChambers</td><td>Sprzęt</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

przetwarzanie macierzy cdna ptgen2 sosny łobasowej

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 to macierz cDNA o liczbie 26 496 cech, zawierająca amplifikowane EST sosny loblolly. Macierz ta została opracowana w naszym laboratorium do użytku badaczy analizujących ekspresję genów u sosny i innych gatunków drzew iglastych. PtGen2 powstała w wyniku naszych wysiłków w zakresie odkrywania genów u sosny loblolly i składa się z sekwencji zidentyfikowanych głównie w tkankach korzeniowych, ale także w igłach i łodygach.1,2 PtGen2 została przetestowana poprzez hybrydyzację różnych docelowych cDNA koniferów znakowanych barwnikami Cy, z wykorzystaniem zarówno amplifikowanych, jak i nieamplifikowanych metod znakowania pośredniego, a także przetestowana przy zastosowaniu szeregu warunków hybrydyzacji i przemywania. Niniejsze wideo koncentruje się na obchodzeniu i przetwarzaniu szkiełek przed i po prehybrydyzacji, a także po hybrydyzacji, z zastosowaniem niektórych modyfikacji procedur opracowanych wcześniej.3,4 W formie tekstowej dołączono również protokoły stosowane do generowania, znakowania i oczyszczania docelowych cDNA, a także informacje o oprogramowaniu wykorzystywanym do późniejszego przetwarzania danych. 
PtGen2 jest drukowany z zastosowaniem autorskiego buforu drukującego zawierającego wysokie stężenia soli, które mogą być trudne do całkowitego usunięcia. Przed prehybrydyzacją preparaty są najpierw płukane w ciepłym roztworze SDS. Po prehybrydyzacji preparaty są intensywnie płukane kilkukrotnie wodą w celu całkowitego usunięcia pozostałych soli. Następnie czyszczone i umieszczane na preparatach są LifterSlips™, a znakowane cDNA jest ostrożnie nakładane na mikroarray poprzez działanie kapilarne, co zapewnia równomierny rozkład próbki na preparacie i zmniejsza ryzyko powstania pęcherzyków powietrza. Hybrydyzacja celów z macierzą odbywa się w temperaturze 48°C w warunkach wysokiej wilgotności. Po hybrydyzacji przeprowadza się serię standardowych płukań w temperaturze 53°C oraz w temperaturze pokojowej przez wydłużony czas. Przetwarzanie preparatów PtGen2 przy użyciu tej techniki redukuje artefakty pochodzące z soli i SDS, które często pojawiają się, gdy macierz jest przetwarzana w sposób mniej rygorystyczny. Hybrydyzacja celów pochodzących z kilku różnych źródeł RNA iglaków przy zastosowaniu tego protokołu przetwarzania pozwoliła na uzyskanie mniejszej liczby artefaktów, zredukowanie tła oraz zapewnienie lepszej spójności pomiędzy różnymi eksperymentalnymi grupami macierzy.

Mikromacierze cDNA PtGen2 zostały opracowane do badań ekspresji genów u sosny loblolly, P. taeda, oraz innych gatunków iglastych. W niniejszym materiale przedstawiamy techniki przygotowania i obróbki przed oraz po hybrydyzacji, a także metody przemywania, które można zastosować w przypadku tej macierzy w celu uzyskania lepszej powtarzalności, ograniczenia artefaktów i zmniejszenia tła.

Przetwarzanie macierzy cDNA PtGen2 sosny łobasowej

PtGen2 to mikromierz cDNA o 26 496 cechach, zawierający amplifikowane sekwencje EST sosny długorosłej (loblolly pine). Mikromierz ten jest wytwarzany w naszym laboratorium do użytku przez badaczy...

Niniejszy materiał wideo został przygotowany przez badaczy z Warnell School of Forestry and Natural Resources na Uniwersytecie Georgii. Celem tego filmu szkoleniowego jest szczegółowe omówienie sposobu przetwarzania naszych macierzy cDNA drugiej generacji LOB lolly pine pt, ze szczególnym uwzględnieniem płukania i obchodzenia się z macierzą, zarówno przed, jak i po hybrydyzacji. Co do zasady, nasze protokoły opierają się na metodach opracowanych w Institute for Genomic Research (TIGR) oraz Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility (VMSR), gdzie drukowane są nasze macierze.Stwierdziliśmy, że w przypadku PT Gen two wymagana jest bardziej rygorystyczna obróbka, aby zapewnić najwyższy stopień spójności w zakresie jednorodności jakości sygnału i niskiego tła. Pierwszym krokiem jest wstępne przemywanie. Przeprowadzamy ten etap, ponieważ nasz bufor do nanoszenia kropek zawiera bardzo wysoką zawartość soli, a wstępne przemywanie jest niezbędne do jej usunięcia.Preparaty umieszcza się w kasecie do szkiełek przedmiotowych i energicznie zanurza od 15 do 20 razy w 0,2% roztworze SDS, który został uprzednio podgrzany do 43°C. Po przemyciu szkiełek w roztworze SDS, zostają one ostrożnie przeniesione pęsetą do naczynia Copelanda zawierającego bufor do prehybrydyzacji. Bufor ten zawiera 5X SSC, 0,1% SDS oraz 1% BSA i jest również podgrzany do 43°C.Słoik Copelanda pokrywa się parfum i umieszcza w inkubatorze w temperaturze 43°C na jedną godzinę. Po wstępnej hybrydyzacji preparaty przenosi się do kasety na szkiełka przedmiotowe i płucze sukcesywnie w pięciu zmianach wody dejonizowanej, zanurzając je od 15 do 20 razy w każdej zmianie. Na koniec preparaty umieszcza się w izopropanolu i zanurza pięć lub sześć razy, a następnie wirowuje do suchości w wirówce chip M mate.Po wirowaniu slajdy są przedmuchiwane sprężonym powietrzem przepuszczonym przez filtr o wielkości 0,2 mikrona. Następnie na slajdy nakłada się szkiełka przykrywki, które również zostały oczyszczone sprężonym powietrzem, a za pomocą końcówki małej pipety ustawia się szkiełko przykrywki w odpowiedniej pozycji na slajdzie.Po umieszczeniu pasków dystansujących, ale przed dodaniem buforu do hybrydyzacji, dodajemy 20 µL 100 mM dihi, trzy atol do otworów nawilżających znajdujących się na końcach komory. Teraz jesteśmy gotowi do dodania docelowych cDNA, które zostały resuspendowane w buforze do hybrydyzacji. Końcówkę pipety umieszcza się na krawędzi paska dystansującego oraz płytki, a następnie powoli nanosi roztwór.Stwierdziliśmy, że wykorzystanie efektu kapilarnego do napełniania matryc zapewnia największą powtarzalność i znacznie ogranicza powstawanie niepożądanych pęcherzyków powietrza. Po dodaniu materiału docelowego do matrycy, komorę hybrydyzacyjną składa się i przykrywa folią aluminiową. Następnie komorę hybrydyzacyjną umieszcza się w wstrząsającej łaźni wodnej w celu inkubacji nocnej, zazwyczaj przez 14 do 16 godzin.Kąpiel wodną ustawiono na 48 °C, a wytrząsarkę na 50 rpm. Należy również zauważyć, że od momentu dodania roztworu do hybrydyzacji, aż po wszystkie etapy przemywania po hybrydyzacji, procedury są przeprowadzane przy słabym oświetleniu, aby zapobiec fotoutlenianiu. Następnego dnia preparaty są wyjmowane z komory do hybrydyzacji i umieszczane w słoiku Copelanda zawierającym pierwszy roztwór do przemywania, który został uprzednio podgrzany do 53 °C.Przełazki pozostawia się w naczyniu Copelanda przez około minutę, aż do momentu oddzielenia się pasków podtrzymujących, po czym ostrożnie wyjmuje się je pęsetą i umieszcza w kasecie do szkiełek przedmiotowych, aby przystąpić do płukania. Następnie przełazki zanurza się energicznie około 15 do 20 razy w drugim naczyniu, również zawierającym roztwór płuczący numer jeden w temperaturze 53 stopni. Naczynie przykrywa się parafilitą i umieszcza w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 53 stopnie i 100 RPM.Po 10-minutowej inkubacji i zastosowaniu roztworu płuczącego nr 1, preparaty na szkiełkach są energicznie zanurzane 15–20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym nr 2, który znajduje się w temperaturze pokojowej. Pojemnik ten zostaje przykryty folią Parafilm i ponownie umieszczony na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 10-minutową inkubację. Na koniec szkiełka są wyjmowane z roztworu płuczącego nr 2 i energicznie zanurzane 15–20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym nr 3.Następnie slajdy przenosi się do drugiego pojemnika z roztworem piorącym numer trzy przykrytego Parafilmem i ponownie umieszcza się na wytrząsarce na 10 minut. Po końcowym płukaniu odwirujemy slajdy do całkowitego osuszenia. W tym celu wkładamy nakrętkę od probówki Falcon 15 ml do probówki stożkowej 50 ml, a następnie umieszczamy matryce w probówce stożkowej stroną z kodem kreskowym do dołu.Następnie probówki wiruje się w rotorze z koszyczkami przy 1500 RPM w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu preparaty przenosi się do drugiego zestawu probówek stożkowych o pojemności 50 ml, które zostały owinięte folią aluminiową. Następnie probówki przepłukuje się azotem, który został przefiltrowany przez filtr 0,22 micron, a następnie zamyka je do transportu lub przechowywania do czasu skanowania.Dane z elektronicznego skanowania zbieramy przy użyciu skanera PerkinElmer scan array 5, 000. Obraz macierzy zostaje podzielony na siatkę, a surowe dane skanowania są przetwarzane i poddawane wstępnej analizie za pomocą pakietu oprogramowania obrazowego firmy Bio Discovery. Następnie dane dotyczące intensywności sygnału w punktach są normalizowane, a analizy statystyczne są wykonywane przy użyciu BRB array tools — wszechstronnego i bezpłatnie dostępnego pakietu statystycznego do analizy mikromacierzy, który można pobrać z Narodowego Instytutu Nowotworów (National Cancer Institute).Pozostałe analizy statystyczne oraz poszukiwania wzorców ekspresji genów są przeprowadzane za pomocą zestawu narzędzi do analizy i poszukiwania wzorców ekspresji genów Jeep PPAs, który jest kolejnym ogólnodostępnym pakietem analitycznym opartym na przeglądarce internetowej. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu dotyczącego sposobu przetwarzania danych z mikromacierzy loblolly pine PT Gen two.Za treść i produkcję tego filmu szkoleniowego odpowiadały następujące osoby.

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetwarzanie mikroarray cDNA sosny Loblolly PtGen2

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Wiele tkanek roślinnych, w tym łyko i drewno sosny taeda (Pinus taeda L.), zawiera wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Niniejsza prezentacja omawia techniki zbioru tkanek hodowanych w warunkach polowych oraz izolacji RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomowych.

Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Ten manuskrypt opisuje użycie najnowocześniejszej technologii dostarczanej przez mikromacierze DNA. Mikromacierze zapewniają przegląd zmian transkryptomicznych u bakterii powstałych w określonych warunkach. Ponadto podkreślamy łatwość, z jaką można analizować duże ilości danych za pomocą wygodnych, opracowanych przez nas pakietów oprogramowania.

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Technologia mikromacierzy umożliwia ilościowe pomiary i profilowanie ekspresji genów transkryptów na poziomie całego genomu. W związku z tym protokół ten zapewnia zoptymalizowaną procedurę techniczną w dwukolorowej, niestandardowej matrycy bydlęcej przy użyciu zarodków bydlęcych dnia 7, aby wykazać wykonalność użycia niewielkiej ilości całkowitego RNA.

Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Poznaj techniki przetwarzania mikromacierzy cDNA PtGen2 sosny loblolly, w tym mycie przed i po hybrydyzacji. Ta metoda zapewnia spójność sygnału i redukcję tła w analizie ekspresji genów iglastych.

Przetwarzanie macierzy cDNA PtGen2 sosny łobasowej

Przeglądaj więcej filmów