Przetwarzanie mikromacierzy cDNA sosny Loblolly PtGen2

Ten film został wyprodukowany przez naukowców z University of Georgia's Warnell School of Forestry and Natural Resources. Celem tego filmu szkoleniowego jest szczegółowe omówienie sposobu przetwarzania naszej mikromacierzy LOB lolly pine pt, gen two CDNA, ze szczególnym uwzględnieniem mycia i obsługi macierzy, zarówno przed, jak i po hybrydyzacji. Ogólnie rzecz biorąc, nasze protokoły są zgodne z tymi opracowanymi w Instytucie Badań Genomicznych Tiger i Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, gdzie drukowane są nasze macierze.

Odkryliśmy, że wymagane jest bardziej rygorystyczne przetwarzanie PT Gen Two, aby zapewnić jak największą spójność w odniesieniu do jednolitości jakości sygnału i niskiego tła. Pierwszym krokiem jest pranie wstępne. Robimy to, ponieważ nasz bufor do plam zawiera bardzo wysoką zawartość soli, a to mycie wstępne jest konieczne, aby usunąć tę sól.

Szkiełka są umieszczane w nośniku szkiełka mikroskopowego i energicznie zanurzane od 15 do 20 razy w 0,2% roztworze SDS, który został wstępnie podgrzany do 43 stopni. Po umyciu szkiełek w roztworze SDS, ostrożnie wyjmuje się je kleszczami do słoika Copeland zawierającego bufor przed hybrydyzacją. Ten bufor zawiera pięć XSSC 0,1% SDS i 1% BSA, a także jest podgrzewany w temperaturze 43 stopni.

Słoik Copeland przykrywa się perfumami i umieszcza w inkubatorze o temperaturze 43 stopni na godzinę. Po wstępnej hybrydyzacji szkiełka są przenoszone do nośnika szkiełka mikroskopowego i przetwarzane kolejno przez pięć zmian wody dejonizowanej, zanurzając się od 15 do 20 razy przy każdej zmianie. Na koniec szkiełka są umieszczane w izopropanolu i zanurzane pięć lub sześć razy przed odwirowaniem do sucha w wirówce typu chip M mate.

Po odwirowaniu szkiełka są przedmuchiwane sprężonym powietrzem przepuszczanym przez filtr 0,2 mikrona. Szkiełka są następnie nakładane na ślizgi podnośnika, które również zostały oczyszczone sprężonym powietrzem, a my używamy małej końcówki pipety, aby ustawić ślizg podnośnika we właściwej pozycji. Na slajdzie.

Po ustawieniu podnośnika poślizgnie, ale przed dodaniem buforu hybrydyzacyjnego, dodajemy 20 mikrolitrów 100 milimolowych dihi, trzech atolu do studzienek wilgotnościowych znajdujących się na końcach komory. Teraz jesteśmy gotowi do dodania docelowych CDNA, które zostały ponownie zawieszone w buforze hybrydyzacji. Końcówkę pipety umieszcza się na krawędzi ślizgu podnośnika i suwaka, a roztwór jest powoli pipetowany.

Odkryliśmy, że wykorzystanie efektu kapilarnego do ładowania macierzy zapewnia największą spójność i znacznie zmniejsza wprowadzanie niechcianych pęcherzyków. Po dodaniu materiału docelowego do macierzy, komora hybrydyzacji jest montowana i przykrywana folią aluminiową. Komorę hybrydyzacyjną umieszcza się następnie w wytrząsającej łaźni wodnej na noc inkubacji, zwykle od 14 do 16 godzin.

Łaźnia wodna jest ustawiona na 48 stopni, a shaker na 50 obr./min. Ważne jest również, aby pamiętać, że od momentu dodania roztworu hybrydyzacyjnego przez wszystkie płukania po hybrydyzacji, procedury są przeprowadzane w słabym świetle, aby zapobiec fotoutlenianiu. Następnego dnia szkiełka wyjmuje się z komory hybrydyzacyjnej i umieszcza w słoiku Copeland zawierającym roztwór myjący numer jeden, który został wstępnie podgrzany do 53 stopni.

Szkiełka pozostawia się w słoiku Copeland przez około minutę, aż podnośnik zsunie się, po czym szkiełka delikatnie wyjmuje się kleszczami i umieszcza w pojemniku na szkiełka mikroskopowe, aby kontynuować mycie. Szkiełka są następnie energicznie zanurzane około 15 do 20 razy w drugim pojemniku, zawierającym również roztwór myjący numer jeden w temperaturze 53 stopni. Pojemnik jest następnie pokryty perfumami i umieszczony w wytrząsarce powietrznej inkubatora ustawionej na 53 stopnie i sto obrotów na minutę.

Po 10-minutowej inkubacji i roztworze do mycia, numer jeden, szkiełka zanurza się energicznie 15 do 20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym numer dwa, który ma temperaturę pokojową pojemnika. Materiał ten przykrywa się folią para, a następnie ponownie umieszcza na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 10 minut inkubacji. Na koniec szkiełka wyjmuje się z roztworu myjącego numer dwa i energicznie zanurza się 15 do 20 razy w pojemniku z roztworem płuczącym numer trzy.

Szkiełka są następnie wyjmowane do drugiego pojemnika z roztworem myjącym numer trzy, pokrytego perfilem i ponownie umieszczane na wytrząsarce na 10 minut. Po ostatnim umyciu odwirowujemy szkiełka do całkowitego wyschnięcia. Aby to zrobić, umieszczamy 15-milimetrową nasadkę Falcona w stożkowej tubie o grubości 50 mil i umieszczamy tablicę z kodem kreskowym stroną do dołu w stożkowej tubie.

Rury są następnie wirowane w kołyszącej się głowicy kubełkowej z prędkością 1500 obr./min w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu szkiełka wyjmuje się do drugiego zestawu stożkowych probówek o grubości 50 mil, które zostały pokryte folią aluminiową. Probówki są następnie przepłukiwane gazowym azotem, który jest filtrowany przez filtr i nasadkę 0,22 mikrona do transportu lub przechowywania do czasu skanowania.

Dane skanowania zbieramy na tablicy skanów PerkinElmer 5 000. Obraz macierzy jest umieszczany w siatce, a surowe dane skanowania są przetwarzane, a wstępna analiza danych jest wykonywana za pomocą pakietu oprogramowania do obrazowania Bio Discovery. Następnie dane o intensywności sygnału punktowego są normalizowane, ponieważ analiza statystyczna jest wykonywana za pomocą narzędzi BRB Array, solidnego i bezpłatnego pakietu statystycznego mikromacierzy, który można pobrać z National Cancer Institute.

Inne analizy statystyczne i poszukiwania wzorców ekspresji genów są wykonywane za pomocą pakietu Jeep PPA do pomiaru i analizy ekspresji genów. Kolejny darmowy pakiet analityczny oparty na przeglądarce internetowej. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu na temat przetwarzania mikromacierzy lob lolly pine PT Gen two.

Następujące osoby były odpowiedzialne za treść i produkcję tego filmu szkoleniowego.