Name: Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę profilowania transkryptomu zarodków bydlęcych przy użyciu dwukolorowej mikromacierzy. Technika umożliwia analizę ekspresji genów z niską ilością RNA, dostarczając cennych informacji o jakości zarodków przed implantacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania wspierane przez Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

Część tego badania na zwierzętach została przeprowadzona w Jednostce Badań Metabolicznych Uniwersytetu Alberty w Edmonton w Kanadzie, ze wszystkimi procedurami eksperymentalnymi na zwierzętach zatwierdzonymi (Protokół # AUP00000131) przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Alberty, a zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami (1993).
1. Produkcja zarodków, izolacja całkowitego RNA i leczenie DNazą
<ol>
	<li>Aby zapoznać się z protokołami doświadczalnymi na zwierzętach i pobieraniem zarodków, zapoznaj się z naszymi poprzednimi publikacjami17, 18.</li>
	<li>Zebrać i zamrozić zarodki w podobnym stadium rozwoju od każdej krowy w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Ekstrakcja całkowitego RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA opartego na kolumnie, który umożliwia ekstrakcję RNA z próbek w skali pikograficznej (informacje o zestawie są dostępne w Liście materiałów). 
	UWAGA: Zalecany zestaw zawiera: Bufor kondycjonujący, Bufor ekstrakcyjny, 70% Etanol, Bufor do przemywania 1, Bufor do płukania 2, Bufor elucyjny, Kolumny oczyszczające RNA z probówkami zbiorczymi i probówkami do mikrowirówek.</li>
	<li>Dodać 10 μl buforu ekstrakcyjnego do probówki zawierającej zarodki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C. Probówkę wirówkową o pojemności 800 x g przez 2 minuty w celu zebrania ekstraktu komórkowego do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Odpipetować 250 μl buforu kondycjonującego na membranę filtracyjną kolumny oczyszczającej. Inkubować kolumnę oczyszczającą RNA z buforem kondycjonującym przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę oczyszczającą w probówce zbiorczej o stężeniu 16 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl 70% etanolu do mieszaniny buforu do ekstrakcji RNA i zarodków. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Odpipetować mieszaninę do wstępnie przygotowanej kolumny oczyszczającej.</li>
	<li>Aby związać RNA, należy odwirować kolumnę oczyszczającą przez 2 minuty przy 100 x g, a następnie natychmiast po niej odwirować przy 16 000 x g przez 30 sekund w celu usunięcia przepływu.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 1 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 1 minutę przy 8 000 x g. 
	UWAGA: Leczenie DNazą jest zalecane w przypadku wykonywania odwrotnej transkrypcji lub amplifikacji po izolacji RNA.</li>
	<li>Trawić genomowe DNA zaraz po kroku 1.8. 
	UWAGA: Zalecany zestaw DNazy jest dostępny na liście materiałów. Zalecany zestaw zawiera: roztwór podstawowy DNazy I i bufor.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę do inkubacji DNazy, mieszając 5 μl roztworu podstawowego DNazy I z 35 μl buforu. Wymieszaj, delikatnie odwracając.</li>
	<li>Odpipetować 40 μl mieszaniny inkubacyjnej DNazy bezpośrednio do membrany kolumny oczyszczającej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Odpipetować 40 μl buforu płuczącego 1 do membrany kolumny oczyszczającej, a następnie odwirować przy 8 000 x g przez 15 s.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl buforu płuczącego 2 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 1 minutę przy 8 000 x g.</li>
	<li>Odpipetować kolejne 100 μl buforu płuczącego 2 do kolumny oczyszczającej i odwirowywać przez 2 minuty przy 16 000 x g.</li>
	<li>Przenieść kolumnę oczyszczającą do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Odpipetować 11 μl buforu elucyjnego bezpośrednio na membranę kolumny oczyszczającej. Aby zapewnić maksymalne wchłanianie buforu elucyjnego do membrany, delikatnie przyłóż końcówkę pipety do powierzchni membrany podczas dozowania buforu elucyjnego.</li>
	<li>Inkubować kolumnę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować kolumnę przez 1 minutę przy 1,000 x g, aby rozprowadzić bufor elucyjny w kolumnie, a następnie wirować przez 1 minutę przy 16,000 x g, aby wymyć RNA.</li>
	<li>Użyj bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta, aby ocenić jakość i ilość RNA19.</li>
	<li>Próbkę RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Amplifikacja i etykietowanie RNA do analizy mikromacierzy
UWAGA: Po raz pierwszy użytkownik pracujący z procedurami amplifikacji i znakowania RNA powinien użyć pięciu ng impulsowego RNA wraz z rzeczywistymi próbkami aRNA do monitorowania pomiaru kontroli jakości amplifikacji i hybrydyzacji RNA. Mieszanka RNA z kolcem zawiera dziesięć zsyntetyzowanych in vitro, poliadenylowanych transkryptów w określonych proporcjach. Gdy procedura przebiega prawidłowo, oznakowane transkrypty specyficznie hybrydyzują tylko z komplementarnymi sondami kontrolnymi w tablicach, a dane mogą być skanowane w celu śledzenia zapewnienia kontroli jakości przy minimalnej samohybrydyzacji lub krzyżowej. Więcej szczegółowych opisów dotyczących intensywności kontroli wkłutych i procedury normalizacji po zeskanowaniu tablicy i analizie danych znajduje się w poprzednich publikacjach20, 21. Poniższa procedura jest podana dla rutynowych użytkowników mikromacierzy.
<ol>
	<li>Przygotować 100 pg wysokiej jakości próbkę RNA (wartość liczby integralności RIN co najmniej > 7,0) w całkowitej objętości 10 - 11 μl.</li>
	<li>Amplifikuj próbki RNA za pomocą zestawu do amplifikacji, który jest w stanie pracować z próbkami w skali pikograficznej (już od 100 pg). 
	UWAGA: Zalecane informacje o zestawie amplifikacyjny jest dostępny na liście materiałów i jest zgodny z instrukcjami producenta bez żadnych modyfikacji.</li>
	<li>Użyj oceny ilościowej opartej na fluorescencji, aby ocenić profil zakresu rozmiarów amplifikowanego aRNA.</li>
	<li>Użyć przyrządu spektrofotometrycznego (w oparciu o absorbancję przy 260 i 280 nm) do pomiaru stężenia amplifikowanego aRNA.</li>
	<li>Amplifikowany aRNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowy do etykietowania.</li>
	<li>Użyj 2 μg amplifikowanego RNA do znakowania fluorescencyjnego zgodnie z instrukcją obsługi zestawu do znakowania aRNA ULS. 
	UWAGA: Ponieważ barwnik cyjaniny 547 i cyjaniny 647 jest wrażliwy na fotodegradację, a barwnik cyjaniny 647 łatwo ulega degradacji przez ozon, procedura etykietowania odbywa się przy minimalnej ilości światła i w środowisku wolnym od ozonu.</li>
	<li>Włącz skrzynkę ozonową (Rysunek 1A), aż poziom ozonu wyniesie 0,001 ppm.</li>
	<li>Wykonaj konfigurację reakcji wewnątrz pojemnika ozonowego (rysunek 1B), dodając 2 μl cyjaniny 547 lub cyjaniny 647, 2 μl buforu do znakowania, a następnie dostosuj do końcowej objętości 20 μl wodą wolną od RNaz pod światłem awaryjnym. Dodaj filtr ciemniowy do źródła światła.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać i inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 85 °C przez 15 minut. Umieścić próbki na lodzie na co najmniej 1 minutę. Zawirować w dół, aby zebrać zawartość probówek przed przystąpieniem do zestawu do ekstrakcji RNA, z wyjątkiem etapów związanych z obróbką DNazy (od 1,9 do 1,11), w celu oczyszczenia amplifikowanego RNA znakowanego barwnikiem Cy.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru do pomiaru i określenia stężenia znakowanego amplifikowanego RNA i utrzymuj znakowane aRNA w maksymalnej temperaturze -80 °C przez 3 dni przed użyciem.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja i mycie mikromacierzy
UWAGA: Następujące ważne kroki są dostosowane do protokołu analizy ekspresji genów opartego na dwukolorowych mikromacierzach (wersja 6.5, maj 2010 r.).
<ol>
	<li>Dodaj równą ilość 825 ng z każdego aRNA znakowanego cyjaniną 547 i cyjaniną 647 i wymieszaj z 25-krotną fragmentacją i 10-krotnym buforem blokującym.</li>
	<li>Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 60 °C przez 15 minut i schłodzić na lodzie przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj równą ilość 2x bufora hybrydyzacyjnego i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Odwirować z prędkością 13 000 obr./min, a następnie mieszanina jest gotowa do hybrydyzacji.</li>
	<li>Załadować 100 μl z mieszaniny na szkiełko matrycowe i uszczelnić szkiełko wewnątrz komory hybrydyzacji.</li>
	<li>Załadować zmontowaną komorę do pieca do hybrydyzacji na 17 godzin w temperaturze 65 °C, obracając z prędkością 10 obr./min w piecu.</li>
	<li>Umyć matryce zgodnie z protokołem z obróbką ochronną ozonem, zanurzając je w roztworze stabilizacyjnym i suszącym na 30 sekund.</li>
	<li>Wyjmij matryce z roztworu i upewnij się, że powierzchnia macierzy jest sucha i nie ma cząstek kurzu</li>
</ol>
4. Slajd skanowania mikromacierzy
<ol>
	<li>Trzymaj macierze w ciemnym miejscu i włączaj skaner, aż będzie gotowy do użycia (czas oczekiwania 15 minut).</li>
	<li>Załaduj kod kreskowy tablicy po lewej stronie do skanera i rozpocznij skanowanie. Wykonaj analizę punktową zgodnie z instrukcją obsługi oprogramowania i zapisz dane w formacie pliku (gpr).</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Kliknij "importuj surowe dane" i załaduj pliki gpr do FlexArray.</li>
	<li>W razie potrzeby wykonaj normalizację i analizę statystyczną, postępując zgodnie z instrukcją. Uwaga: Oblicz próg dla pozytywnej selekcji miejsca w tym badaniu, jak opisano wcześniej22.</li>
	<li>Wybierz rozwijaną instrukcję z przeglądarki wydruku FlexArray, aby wyświetlić wszystkie hybrydyzowane punkty i sygnały tła. Uwaga: Podobny obraz wzbogaconego w kontrole po hybrydyzacji do mikromacierzy można zobaczyć w poprzednim badaniu8.</li>
	<li>Wybierz normalizację lessową w tablicy, a następnie proces normalizacji kwantylu między tablicami z listy rozwijanej FlexArray.</li>
	<li>Wyeksportuj wszystkie znormalizowane dane z FlexArray do pliku Excel w celu dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
6. Analiza bioinformatyczna
Oryginalna adnotacja sekwencji sondy z mikromacierzy BESTv1 (bydlęcych transkryptów specyficznych dla zarodków) została opisana wcześniej8. W niniejszym badaniu uzyskano 20 403 unikalnych symboli genów (GS) (<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Supplement File1</a>) za pośrednictwem EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Wybrano listę 6 765 unikalnych genów (<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Supplement File2</a>), które odpowiadały wszystkim pozytywnym sygnałom po procesie normalizacji mikromacierzy (Krok 5.5) z profilu ekspresji genów zarodków bydła dnia 7. Próg sygnału dodatniego został obliczony na podstawie poprzedniej publikacji16 od intensywności sygnału wartości A.
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić analizę funkcjonalną za pomocą systemu klasyfikacji PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)23, 24, otwórz następujący link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).</li>
	<li>Prześlij listę 6 765 GS specyficznych dla zarodka, aby zidentyfikować określony proces biologiczny podczas rozwoju embrionalnego za pomocą statystycznego testu nadreprezentacji i użyj domyślnego ustawienia Bos taurus (wszystkie geny w bazie danych) jako listy referencyjnej25. 
	UWAGA: Pozwala to na identyfikację procesów związanych z rozwojem na podstawie terminów GO, które są statystycznie nadmiernie lub niedostatecznie wyrażone za pomocą testu dwumianowego.</li>
	<li>Ustaw próg wartości P na < 0,05 jako domyślny program. Dane można pobrać i wyeksportować do pliku Excel w celu dalszego wyboru16.</li>
</ol>

<ol><li>Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+in+dairy+cows%3A+bridging+the+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Fertility in dairy cows: bridging the gaps.</a> Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).</li>
<li>Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+survival+in+dairy+cows+managed+under+pastoral+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions.</a> Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).</li>
<li>Wrenzycki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+culture+system+and+protein+supplementation+on+mRNA+expression+in+pre-implantation+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos.</a> Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).</li>
<li>Menezo, Y. J., Herubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+bovine+models+for+human+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse and bovine models for human IVF.</a> Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
<li>Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+the+cancer+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of the cancer transcriptome.</a> Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).</li>
<li>Robert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+resources+to+obtain+a+comprehensive+survey+of+the+bovine+embryo+transcriptome+through+deep+sequencing+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays.</a> Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).</li>
<li>Nygaard, V., Hovig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+available+for+profiling+small+samples%3A+a+review+of+sample+amplification+technology+when+combined+with+microarray+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling.</a> Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).</li>
<li>Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isothermal%2C+linear+nucleic+acid+amplification+systems+for+highly+multiplexed+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications.</a> Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).</li>
<li>Phillips, J., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+RNA+Amplification%3A+A+linear+amplification+method+for+analyzing+the+mRNA+population+from+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells.</a> Methods. 10 (3), 283-288 (1996).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+aRNA+production+during+T7+amplification+to+prevent+the+loss+of+sample+representation+during+microarray+hybridization+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 65(2009).</li>
<li>Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Linkage+System%3A+versatile+nucleic+acid+labeling+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Re.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique.</a> Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).</li>
<li>Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+a+stable+methodological+basis+for+comparing+transcript+abundance+of+developing+embryos+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays.</a> Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).</li>
<li>Tsoi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+porcine+%28Sus+scofa%29+embryo-specific+microarray%3A+array+annotation+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation.</a> BMC Genomics. 13, 370(2012).</li>
<li>Salehi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/rd/rdv26n1ab208">Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid.</a> Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).</li>
<li>Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diets+enriched+in+unsaturated+fatty+acids+enhance+early+embryonic+development+in+lactating+Holstein+cows%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows.</a> Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).</li>
<li>Agilent 2100 Bioanalyzer User's Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf</a> (2016).</li>
<li>Kerr, K. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17915030">Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray.</a> BMC Bioinformatics. 8, 371(2007).</li>
<li>Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wholly+defined+Agilent+microarray+spike-in+dataset%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset.</a> Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).</li>
<li>Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+and+known+oocyte-specific+genes+using+complementary+DNA+subtraction+and+microarray+analysis+in+three+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species.</a> Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).</li>
<li>Thomas, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER%3A+a+library+of+protein+families+and+subfamilies+indexed+by+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function.</a> Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PANTHER+database+of+protein+families%2C+subfamilies%2C+functions+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways.</a> Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).</li>
<li>Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+function+analysis+with+the+PANTHER+classification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system.</a> Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).</li>
<li>Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+transcript+abundance+in+bovine+fertilized+and+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos.</a> Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).</li>
<li>Gilbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+products+fluctuation+during+bovine+pre-hatching+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).</li>
<li>Vallee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+bovine+embryo+transcript+profiles+during+early+in+vivo+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development.</a> Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).</li>
<li>Dafforn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+mRNA+amplification+from+as+little+as+5+ng+total+RNA+for+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis.</a> Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).</li>
<li>Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A. Nuclear Reprogramming. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaujean%2C+N+%22Studying+Bovine+Early+Embryo+Transcriptome+by+Microarray%22">Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray</a>. Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. , Humana Press, Springer. NY. Chapter 15 (2015).</li>
<li>Patterson, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+one-color+and+two-color+platforms+within+the+MicroArray+Quality+Control+%28MAQC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project.</a> Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwszym problemem związanym z przeprowadzeniem analizy mikromacierzy przy użyciu zarodków bydlęcych dnia 7 jest nieuzyskanie wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do badania ekspresji genów. Tradycyjna metoda ekstrakcji RNA fenolu/chloroformu i wytrącania etanolu nie jest zalecana w przypadku zarodków dnia 7, co skutkuje niską wydajnością i możliwymi resztkami fenolu hamującymi reakcję amplifikacji RNA. Zamiast tego lepsza jest standardowa metoda oparta na kolumnach, aby wyizolować całkowity RNA, a następnie eluow...

Wczesna utrata zarodków u wysokowydajnych krów mlecznych jest jednym z głównych wyzwań w przemyśle mleczarskim1,2. Bydło stało się interesującym modelem do badania rozwoju zarodków przedimplantacyjnych ze względu na podobny proces rozwojowy3,4. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby lepiej zrozumieć geny zaangażowane we wczesny rozwój embrionalny bydła.
Po dwudziestu latach od pierwszej technologii mikromacierzy opracowanej w 1995 roku5, rozwój bardziej wyrafinowanej technologii produkcji sond zmniejszył błędy drukowania i zmienność układów matrycowych w obrębie i pomiędzy różnymi platformami mikromacierzy6. Ulepszona technologia mikromacierzy zaowocowała szerokim zastosowaniem tej technologii w badaniach klinicznych7, a ostatnio we wczesnej ocenie jakości zarodków8.
Duża ilość materiału wymaganego do technologii mikromacierzy jest głównym powodem, dla którego technologia mikromacierzy początkowo nie weszła do wielu dziedzin badań, takich jak wczesny rozwój embrionalny. Ostatnio metody amplifikacji RNA zostały ulepszone w celu liniowej amplifikacji RNA do poziomu mikrogramów z sub-nanogramowego materiału wyjściowego RNA9. Na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów do amplifikacji RNA; jednak bardziej popularne, dobrze opracowane zestawy są związane z metodami Ribo-Single Primer Isothermal Amplification10 i T7 promotor driven11. Najpopularniejsza amplifikacja antysensownego RNA wykorzystuje transkrypcję in vitro ze starterem oligo dT łączącym się z promotorem T7 na końcu 5' 12. Technologia ta pozwala na zachowanie większości reprezentatywnych transkryptów antysensownych po liniowym wzmocnieniu dla hybrydyzacji tablic13. Metoda ta została dostosowana do amplifikacji poziomu pikogramu całkowitego RNA wyekstrahowanego z bydlęcego zarodka8.
Universal Linkage System (ULS) to metoda znakowania, która bezpośrednio łączy DNA lub amplifikowane RNA z barwnikiem fluorescencyjnym połączonym platyną, cyjaniną 547 lub cyjaniną 647, tworząc wiązanie koordynacyjne na pozycji N7 guaniny14. Metoda ta została zaadaptowana w badaniach nad embrionami w celu wygenerowania bardziej stabilnego amplifikowanego aRNA bez modyfikacji w porównaniu z aRNA modyfikowanym aminoallilem generowanym metodą enzymatyczną15. Zarówno metody znakowania pojedynczym barwnikiem, jak i dwoma barwnikami zostały dostosowane za pomocą Universal Linkage System w mikromacierzy. Duże badanie porównawcze mikromacierzy wykazało, że istnieje dobra korelacja jakości danych między platformami tablic jedno- i dwukolorowych6.
Ostatnio, zarówno metody amplifikacji antysensownego RNA sterowane promotorem T7, jak i znakowania ULS zostały opracowane, aby zapewnić bardziej niezawodny protokół do generowania wystarczającej ilości wysokiej jakości znakowanych materiałów aRNA do hybrydyzacji mikromacierzy8,16. W związku z tym badanie to dostarcza protokołu demonstrującego niektóre z ważnych etapów od ekstrakcji RNA do analizy danych związanych z dwukolorową mikromacierzą na przykładzie zarodków bydlęcych dnia 7.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy bez RNaz (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Arcturus RiboAmp HS PLUS</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Instrumenty do bioanalizowania</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ekranowa RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania fluorescencyjnego ULS</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe mikromacierze ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Bufor myjący do ekspresji genów Agilent</td> 1 <td>Część Agilent Technologies</td><td>#5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania ekspresji genów Agilent 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Część #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor hybrydyzacyjny Hi-RPM</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Część #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Bufor fragmentów</td><td>Agilent Technologies</td><td>Część #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x Środek blokujący GE</td><td>Agilent Technologies</td><td>Część #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór stabilizacyjny i suszący</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Część #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice uszczelek obsługiwane przez Agilent SureHyb techonolgy</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Zestaw 20 prowadnic uszczelek, 4 mikroukłady/suwak</td></tr><tr><td>Dwukolorowy zestaw kolców RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>Skaner matrycowy GenePix 4000B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik bez ozonu</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200</td><td></td></tr><tr><td>plik GAL</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Wczesna utrata zarodków jest dużym czynnikiem przyczyniającym się do niepłodności u bydła. Co więcej, bydło staje się interesującym modelem do badania rozwoju zarodków przedimplantacyjnych u ludzi ze względu na podobny proces rozwojowy. Chociaż wiadomo, że czynniki genetyczne wpływają na wczesny rozwój embrionalny, odkrycie takich czynników było poważnym wyzwaniem. Technologia mikromacierzy umożliwia pomiar ilościowy i profilowanie ekspresji genów poziomów transkryptów w całym genomie. Jedną z głównych decyzji, które należy podjąć podczas planowania eksperymentu z mikromacierzą, jest to, czy zastosować podejście jedno- czy dwukolorowe. Dwukolorowa konstrukcja zwiększa replikację techniczną, minimalizuje zmienność, poprawia czułość i dokładność, a także umożliwia projektowanie pętli, definiując wspólne próbki referencyjne. Chociaż mikromacierz jest potężnym narzędziem biologicznym, istnieją potencjalne pułapki, które mogą osłabić jej moc. Dlatego w tym dokumencie technicznym demonstrujemy zoptymalizowany protokół ekstrakcji RNA, amplifikacji, znakowania, hybrydyzacji znakowanego amplifikowanego RNA do macierzy, skanowania macierzy i analizy danych przy użyciu strategii analizy dwukolorowej.

Reprezentatywny wynik dla całkowitego RNA oraz amplifikowanego aRNA z byczych embrionów w 7. dniu przedstawiono na Rysunku 3 i podsumowano w Tabeli 1.
Integralność i profil RNA można ocenić po ekstrakcji RNA. Ocena jakości RNA może zostać przeprowadzona za pomocą bioanalizatora (Rycina 3A) i tylko te próbki, których wartość RIN jest wyższa niż 7,0, kwalifikują się do wykorzystan...

Technologia mikromacierzy umożliwia ilościowe pomiary i profilowanie ekspresji genów transkryptów na poziomie całego genomu. W związku z tym protokół ten zapewnia zoptymalizowaną procedurę techniczną w dwukolorowej, niestandardowej matrycy bydlęcej przy użyciu zarodków bydlęcych dnia 7, aby wykazać wykonalność użycia niewielkiej ilości całkowitego RNA.

Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury technicznej przy użyciu dwukolorowej, wykonanej na zamówienie matrycy bydlęcej przy użyciu niskiej ilości całkowitego RNA z siódmego dnia zarodków bydlęcych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące utraty zarodków u wysokowydajnych krów mlecznych oraz pytania dotyczące jakości zarodka w stosunku do ekspresji genów w rozwijającym się zarodku przed implantacją. Zaletą tej techniki jest to, że możemy badać ekspresję genów za pomocą pikogramu poziomu całkowitego RNA wyekstrahowanego z pojedynczych zarodków.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat czynnika wpływającego na przeżywalność zarodków przedimplantacyjnych bydła wyprodukowanych in vivo. Może to również przyczynić się do udoskonalenia technologii reprodukcyjnych, takich jak produkcja zarodków in vitro. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować zamrożone zarodki bydlęce w probówce mikrowirówkowej z zestawu do ekstrakcji RNA w skali pico opartej na kolumnie.Dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy do probówki i inkubuj zarodki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty przy 800 ra

transcriptome-profiling-vivo-produced-bovine-pre-implantation-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół opisuje test reporterowy do badania regulacji translacji mRNA w pojedynczych oocytach podczas dojrzewania in vitro.

Definiowanie programu translacji mRNA matki podczas dojrzewania in vitro przy użyciu testu reporterowego pojedynczego oocytu

Poznaj metodę profilowania transkryptomu zarodków bydlęcych przy użyciu dwukolorowej mikromacierzy. Technika umożliwia analizę ekspresji genów z niską ilością RNA, dostarczając cennych informacji o jakości zarodków przed implantacją.

Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Przeglądaj więcej filmów