Profilowanie transkryptomu zarodków bydlęcych wyprodukowanych in vivo przed implantacją przy użyciu dwukolorowej platformy mikromacierzy

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury technicznej przy użyciu dwukolorowej, wykonanej na zamówienie matrycy bydlęcej przy użyciu niskiej ilości całkowitego RNA z siódmego dnia zarodków bydlęcych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące utraty zarodków u wysokowydajnych krów mlecznych oraz pytania dotyczące jakości zarodka w stosunku do ekspresji genów w rozwijającym się zarodku przed implantacją. Zaletą tej techniki jest to, że możemy badać ekspresję genów za pomocą pikogramu poziomu całkowitego RNA wyekstrahowanego z pojedynczych zarodków.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat czynnika wpływającego na przeżywalność zarodków przedimplantacyjnych bydła wyprodukowanych in vivo. Może to również przyczynić się do udoskonalenia technologii reprodukcyjnych, takich jak produkcja zarodków in vitro. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować zamrożone zarodki bydlęce w probówce mikrowirówkowej z zestawu do ekstrakcji RNA w skali pico opartej na kolumnie.

Dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy do probówki i inkubuj zarodki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez dwie minuty przy 800 razy G.Pipette 250 mikrolitrów buforu kondycjonującego do membrany filtracyjnej kolumny oczyszczającej i inkubować kolumnę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 16 000 razy G przez jedną minutę, aby zakończyć wstępne kondycjonowanie kolumny.

Dodaj 10 mikrolitrów 70% etanolu do mieszaniny buforu do lizy i zarodków i dobrze wymieszaj. Następnie załaduj mieszaninę na kolumnę oczyszczającą. Wirować kolumnę przez dwie minuty w temperaturze 100 razy G, a następnie w temperaturze 16 000 razy G przez 30 sekund.

Dodać 100 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania do kolumny i odwirować przy 8 000 razy G przez jedną minutę. Używając zestawu DNazy, wymieszaj pięć mikrolitrów roztworu podstawowego z 35 mikrolitrami buforu i wymieszaj, delikatnie odwracając zamkniętą probówkę. Następnie załaduj mieszaninę DNazy na membranę kolumny oczyszczającej i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Dodać 40 mikrolitrów pierwszego buforu do przemywania do kolumny i odwirować przy 8 000 razy G przez 15 sekund. Następnie dodaj 100 mikrolitrów drugiego buforu do płukania i odwiruj przez minutę. Dodać kolejną porcję drugiego buforu płuczącego do kolumny i wirować przez dwie minuty w temperaturze 16 000 razy G. Przenieść kolumnę oczyszczającą do innej probówki mikrowirówki i załadować 11 mikrolitrów buforu elucyjnego na membranę kolumny.

Inkubować kolumnę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę przez jedną minutę w temperaturze 1 000 razy G, a następnie przez kolejną minutę w temperaturze 16 000 razy G. Sprawdź jakość i ilość wymytego RNA, a następnie przechowuj próbkę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Za pomocą zestawu do amplifikacji amplifikuj 100 pikogramów wysokiej jakości RNA.

Oceń zakres wielkości amplifikowanego aRNA za pomocą oceny ilościowej opartej na fluorescencji. Następnie określ stężenie aRNA za pomocą spektrofotometrii. Przygotować dwa mikrogramy amplifikowanego aRNA do znakowania fluorescencyjnego za pomocą standardowego zestawu.

Ustaw skrzynkę ozonową w ciemni i poczekaj, aż poziom ozonu spadnie do 0,001 części na milion. Umieść filtr ciemniowy nad światłem. Następnie przenieś próbkę do pojemnika na ozonowanie i dodaj po dwa mikrolitry barwnika cyjaninowego i buforu do etykietowania.

Trzymając próbkę w bezpiecznym świetle, dodaj wodę wolną od RNaz, aby uzyskać całkowitą objętość 20 mikrolitrów. Delikatnie wymieszaj próbkę, a następnie inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez 15 minut. Schłodzić próbkę na lodzie przez jedną minutę, a następnie odwirować próbkę.

Oczyść znakowane i amplifikowane aRNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Za pomocą odpowiedniego typu spektrometru określ stężenie znakowanego, amplifikowanego aRNA. Przygotować drugą próbkę amplifikowanego aRNA znakowanego cyjaniną trzema barwnikami.

Przechowuj próbki aRNA w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech dni. Połącz 825 nanogramów aRNA znakowanego Cy3 i 5. Dodaj do tego bufor blokujący i bufor fragmentacji.

Inkubuj mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie schładzaj na lodzie przez minutę. Dodaj 55 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego i dobrze wymieszaj bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Odwirować mieszaninę w temperaturze 11 300 razy G przez jedną minutę.

Załaduj 100 mikrolitrów próbki na szkiełko matrycowe i uszczelnij szkiełko w komorze hybrydyzacji. Hybrydyzuj próbkę przez 17 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 10 obrotów na minutę. Przygotować roztwór stabilizujący i suszący warstwę ozonową.

Umyj matryce, zachowując środki ostrożności w celu zminimalizowania narażenia na działanie ozonu, a następnie zanurz je w roztworze stabilizującym i suszącym na 30 sekund. Upewnij się, że powierzchnia matrycy jest sucha i wolna od kurzu. Przechowuj tablice w ciemnym miejscu.

Włącz skaner mikromacierzy i poczekaj, aż będzie gotowy do skanowania. Następnie załaduj tablicę z kodem kreskowym po lewej stronie. Wykonaj analizę punktową i zapisz dane jako plik georadarowy.

W oprogramowaniu do analizy statystycznej normalizuj i analizuj dane. Oblicz dodatni próg wyboru miejsca i wyświetl wykres sygnałów hybrydowych i tła. Wykonaj normalizację lessu w tablicy, a następnie normalizację kwantylu między tablicami.

Wyeksportuj znormalizowane dane do pliku arkusza kalkulacyjnego. Użyj wszystkich pozytywnych sygnałów w repozytorium danych mikromacierzy, aby utworzyć listę identyfikatorów wybranych unikalnych genów. Prześlij listę ID do bazy danych klasyfikacji i analizy białek, wybierając bos byk jako organizm i wykonaj domyślny statystyczny test nadreprezentacji.

Po dwurundowej amplifikacji fragmenty są bardzo podobne pod względem wielkości i dobrej jakości. Udana amplifikacja tą metodą powinna dać co najmniej tysiąckrotny wzrost aRNA. Wysokiej jakości obraz mikromacierzy charakteryzuje się wysoką intensywnością plamki i niską intensywnością tła na obu kanałach.

Jeśli intensywność tła jest zbyt wysoka, rozdzielczość sygnału będzie słaba. Około 46% plam znajdowało się powyżej tła, z którego wyizolowano 6 765 unikalnych transkryptów RNA ulegających ekspresji w blastocyście. Statystyczny test nadreprezentacji wykazał, że 10 najważniejszych terminów ontologii genów reprezentowało aktywne procesy podziału komórkowego.

Opracowanie tej techniki umożliwiło naukowcom zajmującym się rozrodem zwierząt zbadanie ekspresji genów embrionalnych i ocenę, w jaki sposób różne czynniki wpływają na rozwijający się zarodek. Technika ta została również opracowana u innych ważnych gatunków, takich jak świnia. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak ilościowy PCR, do walidacji wyników mikromacierzy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować RNA z zarodków, a także jak amplifikować i znakować RNA w celu przeprowadzenia dwukolorowej analizy mikromacierzy.