Barwienie immunologiczne w partiach do wykrywania białek na dużą skalę w całym mózgu małpy

Procedura ta rozpoczyna się po otrzymaniu perfundowanego, uzewnętrznionego i chronionego kriogenicznie mózgu o zawartości 4% PFA, który został wysłany do współpracowników neuronauki w celu osadzenia za pomocą punktów orientacyjnych wyrównania osadzonych w otaczającej matrycy. Mózg można podzielić na płaszczyznę koronalną, aby wytworzyć seryjne sekcje o pożądanej grubości, które będą reprezentować cały przedni tylny zakres mózgu za pomocą specjalistycznych koszy i pojemników. Przetwarzanie immunologiczne wsadowe można przeprowadzić w celu określenia przestrzennego wzorca ekspresji białka w całym mózgu.

Cześć, nazywam się dr Shaheen Zur i pracuję w Laboratorium Neuronauk Wizualnych w Szkole Optometrii na Uniwersytecie w Montrealu. Cześć, nazywam się dr Mark Burke, również pracuję w Laboratorium Neuronauk Wizualnych w Szkole Optometrii na Uniwersytecie w Montrealu. Cześć, nazywam się Dr.Mo Petto, jestem dyrektorem Laboratorium Neuronauki Wizualnej w Szkole Optometrii Uniwersytetu w Montrealu.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę barwienia immunologicznego w celu wykrywania białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania wzorców ekspresji białek docelowych w całym mózgu oraz do porównania i kontrastowania ekspresji tych białek w tym samym mózgu. Więc zacznijmy.

Przed przetwarzaniem histologicznym należy uzyskać mózg naczelnych, który został zachowany poprzez perfuzję ogólnoustrojową i po utrwaleniu oraz zabezpieczony kriogenicznie za pomocą stopniowanych roztworów sacharozy. Na tym etapie mózg jest wysyłany do współpracowników neurobiologicznych w celu osadzenia i swobodnego podziału na sekcje przy użyciu ich zastrzeżonej technologii. Po powrocie można zauważyć, że w matrycy osadzania umieszczono siedem punktów orientacyjnych wyrównania, dzięki czemu sekcje mogą być prawidłowo zorientowane i ponownie wyrównane po zakończeniu przetwarzania histologicznego.

Podczas wykonywania przekrojów wykonywane są obrazy cyfrowe, które można później wykorzystać do rekonstrukcji 3D map anatomicznych. Neurobiolog kojarzy procesy naszej tkanki, aby uzyskać seryjne swobodnie pływające odcinki koronalne o grubości 50 mikrometrów na całym mózgu. Po zakończeniu możemy rozpocząć obróbkę histologiczną skrawków.

Kiedy rozpoczynamy przetwarzanie histologiczne, zazwyczaj mamy do wykonania około 140 sekcji na przeciwciało lub barwnik. Tutaj zademonstrujemy technikę z mniejszą próbką odcinków traktowanych przeciwciałem SMI 32, które jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko niefosforylowanym białkom neurofilamentowym. W trakcie całego zabiegu stosowane są specjalistyczne naczynia i kosze do barwienia, co pozwala na jednoczesną i wydajną obróbkę dużej liczby swobodnie pływających sekcji.

Gwarantuje to, że powstała plama jest spójna we wszystkich sekcjach. Pierwszym krokiem jest inkubacja skrawków w roztworze na bazie PBS zawierającym TRITTON X 100 i normalną surowicę końską przez 60 minut. Zmniejszy to niespecyficzne wiązanie cząsteczek przeciwciała, które powoduje barwienie tła.

Następnie sekcje są inkubowane przez noc. W roztworze przeciwciała SMI 32 na bazie PBS, uzupełnionym trittonem X 100 i normalną surowicą końską następnego dnia, skrawki przemywa się przez trzy 10-minutowe okresy w roztworze myjącym, a następnie inkubuje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. W biotynylowanym roztworze przeciwciał drugorzędowych Muse na bazie PBS zawierającym Triton X 100 i normalną surowicę końską.

Po serii trzech dodatkowych 10-minutowych płukań, skrawki umieszcza się w roztworze kompleksu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z biotyną avadon na godzinę w temperaturze pokojowej. Wreszcie, po kolejnym cyklu płukania, skrawki umieszcza się w reakcji D aminobenzyny na 10 minut, która wytwarza brązową plamę w neuronach immunoreaktywnych. Reakcja jest następnie zatrzymywana przez wyjęcie kosza do barwienia i zanurzenie skrawków w PBS.

Po dwóch, trzech, pięciominutowych płukaniach w sekcjach PBS są gotowe do indywidualnego montażu na szkiełkach podstawowych, aby rozpocząć proces montażu przy użyciu dużej szalki Petriego i bardzo miękkich pędzli malarskich. Sekcje są wyjmowane z pojemnika buforowego PBS i indywidualnie montowane na szkiełkach szklanych pokrytych żelatyną. Próbki pozostawia się następnie do wyschnięcia na powietrzu przez noc w dygestorium następnego dnia.

Sekcje są płukane przez zanurzenie ich w wodzie dejonizowanej w celu zmycia wszelkich kryształków soli, które mogą pozostać po procesie montażu. Szkiełka są następnie odwadniane w stopniach z etanolu, czyszczone ksylenem, a pokrywa nasunięta za pomocą każdego medium montażowego. Na tym etapie szkiełka należy przechowywać przez około tydzień do 10 dni w pozycji poziomej, aby umożliwić stwardnienie medium montażowego.

Następnie preparaty można przechowywać w pudełku na preparaty lub poddawać obrazowaniu za pomocą mikroskopii. Metoda ta pozwala uzyskać pełny profil ekspresji białka docelowego w całym mózgu małpy. Tutaj pokazujemy reprezentatywne przekroje koronalne, które zapewniają migawkę ekspresji FMRP, new n i SMI 32.

W tym samym mózgu małpy. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić grupowe barwienie immunologiczne dla docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania w całym mózgu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie sekcje są poddawane łagodnemu mieszaniu podczas inkubacji w różnych roztworach i że przez cały czas pozostają całkowicie zanurzone.

Ponadto nie spiesz się z montażem szkła i usuń jak najwięcej zmarszczek i fałd, nie uszkadzając integralności tkanki. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.