Name: Barwienie immunologiczne w partiach do wykrywania białek na dużą skalę w całym mózgu małpy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę barwienia immunologicznego w partiach do wykrywania białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Technika ta umożliwia analizę przestrzennych wzorców ekspresji białek w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Frankowi Ervinowi, Robercie Palmour oraz personelowi Behavioural Sciences Foundation Laboratories w St Kitts na Karaibach za nieustające wsparcie naszych badań nad naczelnymi. Praca ta była wspierana stypendium z Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) przyznanym SZ oraz grantami operacyjnymi z Canadian Institutes of Health Research (AC) i National Engineering and Research Council of Canada (MP).

Immunohistochemia jest jedną z najszerzej stosowanych technik charakteryzacji ekspresji białek w mózgach różnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Prowadzenie systematycznych procedur immunohistochemicznych w mózgach gryzoni i innych powszechnych modeli eksperymentalnych o podobnej wielkości mózgu jest stosunkowo łatwe. Jednakże, z naszej wiedzy nie istnieją publikacje, które stanowiłyby kompleksowy opis sposobu przeprowadzania takich procedur immunodetekcji w całym mózgu małpy. Poniżej znajduje się szczegółowy opis przygotowania całego mózgu małpy do wielkoskalowej detekcji immunohistochemicznej różnych białek docelowych. Praca ta powstała w wyniku współpracy sektora komercyjnego i akademickiego. W związku z tym szczegóły dotyczące zatapiania i krojenia tkanek pozostają wiedzą zastrzeżoną firmy NSA.
Część 1: Zabiegi u zwierząt i przygotowanie tkanek
W niniejszym protokole wykorzystano mózg dorosłej małpy z gatunku werwetka (Cercopithecus aethiops). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) dotyczącymi wykorzystania i opieki nad zwierzętami w badaniach biomedycznych1.
<ol>
<li>Zwierzę zostaje poddane głębokiej sedacji za pomocą hydrochlorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśpione przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddane perfuzji transkardialnej 0,1 M PBS aż do całkowitego upuśczenia krwi.</li>
<li>Następnie stosuje się 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 litr).</li>
<li>Wyjęty mózg umieszcza się w szeregowych roztworach sacharozy w buforze PBS (kolejno 10, 20 i 30%) zawierających 0,02% azotku sodu i przechowuje w temperaturze 4˚C, aż mózg opadnie na dno naczynia. Roztwór wymienia się co kilka dni, aż do momentu mrożenia i krojenia mózgu.</li>
<li>Mózg jest przesyłany do firmy NeuroScience Associates (NSA; Knoxville, TN) w celu zastosowania ich zastrzeżonej technologii zatapiania i mrożenia MultiBrain™.</li>
<li>W matrycy zatapiającej umieszcza się siedem (7) punktów orientacyjnych, aby możliwe było prawidłowe zorientowanie przekrojów (np. orientacja lewo-prawo) i ich ponowne wyrównanie po zakończeniu obróbki histologicznej.</li>
<li>Zamrożony blok jest fotografowany cyfrowo na powierzchni czoła przed pobraniem każdego seryjnego przekroju z bloku. Obrazy cyfrowe oraz przekroje z tego mózgu mogą być później wykorzystane odpowiednio do rekonstrukcji 3D map anatomicznych i histologicznych.</li>
<li>Z całego mózgu pobierane są seryjne, wolno pływające przekroje wieńcowe o grubości 50 µm na przekrój.</li>
</ol>
Część 2: Obróbka histologiczna
Przekroje wybierano w określonym odstępie przestrzennym (np. 500-µm) i na potrzeby naszych doświadczeń przetwarzano z zastosowaniem następujących przeciwciał: białka FMRP (fragile-X mental retardation protein; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc.; Baltimore, MD) oraz NeuN (Chemicon; Temecula, CA). FMRP jest białkiem cytoplazmatycznym, które występuje obficie w neuronach mózgów prawidłowych oraz osób będących nosicielami permutacji2. NeuN (Neuronal Nuclei) specyficznie rozpoznaje wiążące DNA białko NeuN specyficzne dla neuronów, które występuje w większości neuronów i jest rozmieszczone w jądrach neuronalnych, perykariach oraz w niektórych proksymalnych wypustkach neuronalnych3. SMI-32 jest przeciwciałem monoklonalnym, które rozpoznaje niefosforylowany epitop białek neurofilamentowych4.
<ol>
<li>Przy odstępie 500 µm na jedno przeciwciało wykorzystuje się około 140 przekrojów.</li>
<li>Wszystkie inkubacje, przemycia i etapy barwienia są przeprowadzane przy łagodnym mieszaniu z wykorzystaniem specjalistycznych naczyń i koszyków do barwienia (HistoTools; Knoxville, TN).</li>
<li>Przekroje są najpierw inkubowane przez 60 min w roztworze zawierającym 0,1 M PBS/0,3% Triton X-100 (TX)/5% normal horse serum (NHS), aby zredukować niespecyficzne wiązanie cząsteczek przeciwciał i wynikające z tego barwienie tła.</li>
<li>Przekroje przeznaczone do immunobarwienia FMRP poddawane są dodatkowemu etapowi odsłaniania antygenów przy użyciu Antigen Unmasking Solution (Vector Labs; Burlingame, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Następnie przekroje są inkubowane przez noc, w osobnych dniach, w odpowiednich roztworach przeciwciał zawierających 0,1 M PBS/0,3% TX/3% NHS (przy rozcieńczeniu 1/5 000 dla przeciwciał FMRP i SMI-32 oraz 1/2 000 dla przeciwciał NeuN).</li>
<li>Następnego dnia przekroje są płukane trzykrotnie przez 10 min w roztworze do płukania (0,1 M PBS/0,3% TX), a następnie inkubowane przez 2 h w temperaturze pokojowej z biotynilowanym wtórnym przeciwciałem antymysim pochodzącym z konia (Vector Labs; rozcieńczenie 1/1 000 w 0,1 M PBS/0,3% TX/3% NHS).</li>
<li>Po kolejnej serii trzech 10-minutowych płukań przekroje są umieszczane na 1 h w temperaturze pokojowej w roztworze kompleksu awidyna-biotyna sprzężonej z peroksydazą chrzanową (Vector Labs).</li>
<li>Na koniec, po kolejnej serii płukań, przekroje są poddawane przez 10 min reakcji z diaminobenzydyną wzmocnioną niklem (Ni-DAB), co powoduje powstanie ciemnoniebieskiego barwnika w neuronach immunoreaktywnych.</li>
<li>Po zakończeniu procedury histologicznej przekroje są montowane na szkiełkach przedmiotowych powlekanych żelatyną.</li>
<li>Wszystkie przekroje są suszone na powietrzu przez noc i zakrywane szkiełkami cover-slip zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
</ol>
Część 3: Reprezentatywne wyniki:
Metoda ta pozwala na uzyskanie pełnego profilu ekspresji białka docelowego w całym mózgu małpy. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne przekroje czołowe, które obrazują ekspresję FMRP, NeuN oraz SMI32 w tym samym mózgu małpy.
<img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="Ustawienie mikroskopowe z użyciem szalki Petriego, porównujące przejrzyste dno z siatką do analizy próbek w eksperymentach laboratoryjnych." data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 1: Pojemnik do barwienia (A) oraz koszyczek (B) stosowane do wielkoskalowego przetwarzania partii wolnopływających skrawków w celu immunodetekcji.
<img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="Przekroje poprzeczne mózgu; schemat histologiczny; badanie anatomii porównawczej; analiza strukturalna." data-altupdatedat="1787630408000">
Rycina 2: Reprezentatywne przekroje wieńcowe mózgu małpy werwet barwione przeciwciałami przeciwko FMRP (A), NeuN (B) i SMI32 (C).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej procedurze istnieją dwa krytyczne kroki, które umożliwiają detekcję białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Pierwszym jest protokół zatapiania i krojenia, który pozostaje wiedzą zastrzeżoną NSA. Drugim jest zastosowanie szalek i koszyczków do barwienia dostarczonych przez HistoTools. To drugie rozwiązanie pozwala na łatwą i szybką obsługę wielu (~40) skrawków jednocześnie. Zapewnia ono również możliwość jednolitego traktowania wszystkich przekrojów mózgu, co gwarantuje naukowo poprawną obróbkę histologiczn...

<table><tbody><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-FMRP</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>Wymaga odmaskowania antygenu w utrwalonej tkance.</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-NeuN</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>N/D</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-neurofilament H</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>N/D</td></tr><tr><td>roztwór do odmaskowywania antygenów</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>N/D</td></tr><tr><td>normalne surowica konia</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>biotynylowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u konia</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>zestaw VECTASTAIN ABC (standardowy)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1,5 mg</td></tr><tr><td>kuweta do barwienia pływających skrawków</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>koszyk transportowy do barwienia</td><td>HistoTools</td><td>10012</td><td>duży&lt;br/&gt;(pasuje do kuwety 12 x 65 mm)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>N/D</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>N/D</td></tr></tbody></table>

seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemia (IHC) jest jedną z najszerzej stosowanych technik laboratoryjnych służących do wykrywania białek docelowychin situPytania dotyczące wzorca ekspresji białka docelowego w całym mózgu są stosunkowo łatwe do rozstrzygnięcia przy użyciu IHC w przypadku małych mózgów, takich jak mózgi gryzoni. Jednak udzielenie odpowiedzi na te same pytania w przypadku mózgów dużych i silnie sfałdowanych, takich jak mózgi naczelnych, wiąże się z szeregiem wyzwań. Przedstawiamy tutaj systematyczne podejście do immunodetekcji białek docelowych w mózgu dorosłej małpy. Metoda ta opiera się na metodologii zatapiania i krojenia tkanek opracowanej przez NeuroScience Associates (NSA), a także na narzędziach stworzonych specjalnie do barwienia seryjnego sekcji swobodnie pływających. Pozwala to na uzyskanie jednolitego barwienia zestawu sekcji, które w określonym odstępie reprezentują cały mózg. Tak zabarwione sekcje mogą być następnie poddane szerokiej gamie procedur analitycznych w celu pomiaru poziomów białek oraz określenia populacji neuronów wykazujących ekspresję danego białka.

Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Immunohistochemia (IHC) jest jedną z najszerzej stosowanych technik laboratoryjnych służących do detekcji docelowych białek in situ. Pytania dotyczące...

Niniejsza procedura rozpoczyna się po otrzymaniu mózgu poddanego perfuzji 4% PFA, wyjętego z czaszki i krioprotektowanego, który został przekazany do zespołu neuronauki w celu zatopienia w bloku z wykorzystaniem punktów orientacyjnych wyrównania osadzonych w otaczającej macierzy. Mózg może być przecinany w płaszczyźnie czołowej w celu uzyskania serii przekrojów o pożądanej grubości, które będą reprezentować cały wymiar przednio-tylny mózgu, z wykorzystaniem specjalistycznych koszyczków i pojemników. Można przeprowadzić seryjne przetwarzanie immunochemiczne w celu określenia wzorca przestrzennej ekspresji białka w całym mózgu.Witajcie, jestem dr Shaheen Zur z Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Witajcie, jestem dr Mark Burke, również z Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzień dobry, jestem dr Mo Petto, dyrektor Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę seryjnego barwienia immunochemicznego w celu detekcji białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać wzorce ekspresji

batch-immunostaining-for-large-scale-protein-detection-whole-monkey

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstępne immunobarwienie dla dużej skali wykrywania białek w całym mózgu małpy

Bankowanie mózgu i systematyczne pobieranie próbek materiału biologicznego stanowią podstawę do bezstronnej stereologii i pozwalają na maksymalne wykorzystanie danych uzyskanych z każdego preparatu.

Bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: Eid, L. &amp; Parent, M. Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż człowiek do wstępnego osadzenia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2017). Ten film pokazuje przygotowanie utrwalonej w aldehydach tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzka przy użyciu wstępnie osadzonej immunohistochemii do mikroskopii elektronowej. Przedstawiono w nim etapy znakowania immunologicznego określonego białka neuronalnego, po których następuje reakcja peroksydazy, która...

Przeprowadzanie immunohistochemii na tkance mózgowej naczelnych innych niż człowiek

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Poznaj metodę barwienia immunologicznego w partiach do wykrywania białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Technika ta umożliwia analizę przestrzennych wzorców ekspresji białek w badaniach neurobiologicznych.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Przeglądaj więcej filmów