Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Niniejsza procedura rozpoczyna się po otrzymaniu mózgu poddanego perfuzji 4% PFA, wyjętego z czaszki i krioprotektowanego, który został przekazany do zespołu neuronauki w celu zatopienia w bloku z wykorzystaniem punktów orientacyjnych wyrównania osadzonych w otaczającej macierzy. Mózg może być przecinany w płaszczyźnie czołowej w celu uzyskania serii przekrojów o pożądanej grubości, które będą reprezentować cały wymiar przednio-tylny mózgu, z wykorzystaniem specjalistycznych koszyczków i pojemników. Można przeprowadzić seryjne przetwarzanie immunochemiczne w celu określenia wzorca przestrzennej ekspresji białka w całym mózgu.

Witajcie, jestem dr Shaheen Zur z Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Witajcie, jestem dr Mark Burke, również z Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzień dobry, jestem dr Mo Petto, dyrektor Laboratorium Neuronauk Wizualnych na Wydziale Optometrii Uniwersytetu w Montrealu.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę seryjnego barwienia immunochemicznego w celu detekcji białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać wzorce ekspresji docelowych białek w całym mózgu oraz porównywać i przeciwstawiać ekspresję tych białek w obrębie tego samego mózgu. Zacznijmy zatem.

Przed rozpoczęciem obróbki histologicznej należy pozyskać mózg naczelnego, który został utrwalony poprzez perfuzję systemową i fiksację następczą oraz krioprotektowany przy użyciu stopniowanych roztworów sacharozy. Na tym etapie mózg jest przesyłany do neuroscience associates w celu zatopienia w medium i wykonania serii przekrojów metodą free sectioning z wykorzystaniem ich autorskiej technologii. Po otrzymaniu materiału powrotnego można zauważyć, że w matrycy zatopienia umieszczono siedem punktów orientacyjnych, dzięki którym przekroje mogą zostać prawidłowo zorientowane i ponownie wyrównane po zakończeniu obróbki histologicznej.

Podczas wykonywania sekcjonowania pobierane są obrazy cyfrowe, które mogą zostać później wykorzystane do rekonstrukcji 3D map anatomicznych. Specjalista z zakresu neuronauki przetwarza naszą tkankę, aby uzyskać seryjne, wolno pływające przekroje koronalne o grubości 50 µm obejmujące cały mózg. Po zakończeniu tego etapu możemy rozpocząć przetwarzanie histologiczne przekrojów.

Podczas rozpoczynania procesu histologicznego zazwyczaj mamy do przygotowania około 140 skrawków na jedno przeciwciało lub barwienie. W niniejszej procedurze zaprezentrujemy tę technikę na mniejszej próbce skrawków potraktowanych przeciwciałem SMI 32, które jest przeciwciałem monoklonalnym przeciwko niefosforylowanym białkom neurofilamentów. W całym toku postępowania stosowane są specjalistyczne naczynia i koszyki do barwienia, co pozwala na jednoczesne i efektywne przetwarzanie dużej liczby swobodnie pływających skrawków.

Zapewnia to spójność barwienia we wszystkich przekrojach. Pierwszym krokiem jest inkubacja przekrojów w roztworze na bazie PBS zawierającym TRITTON X 100 oraz normalne surowicę konia przez 60 minut. Pozwoli to ograniczyć niespecyficzne wiązanie cząsteczek przeciwciał, które prowadzi do powstania tła barwienia.

Następnie preparaty inkubuje się przez noc. Następnego dnia przekroje przemywa się trzykrotnie przez 10 minut w roztworze piorącym, a następnie inkubuje przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w roztworze przeciwciała SMI 32 na bazie PBS, uzupełnionym o Triton X 100 i normalną surowicę konia. Następnie inkubuje się je w roztworze biotynilowanego przeciwciała wtórnego Muse na bazie PBS, zawierającym Triton X 100 i normalną surowicę konia.

Po wykonaniu trzech dodatkowych 10-minutowych przemyć, przekroje umieszcza się na jedną godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze kompleksu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z biotyną Avadon. Na koniec, po kolejnej serii przemyć, przekroje poddaje się 10-minutowej reakcji z 3,3'-diaminobenzydyną, co powoduje powstanie brązowego barwnika w neuronach immunoreaktywnych. Reakcję zatrzymuje się poprzez wyjęcie koszyka z próbkami i zanurzenie przekrojów w PBS.

Po dwóch lub trzech pięciominutowych płukaniach w PBS przekroje są gotowe do indywidualnego montowania na szkiełkach przedmiotowych. Proces montowania przeprowadza się przy użyciu dużej szalki Petriego i bardzo miękkich pędzli malarskich. Przekroje wyjmuje z pojemnika z buforem PBS i montuje pojedynczo na szkiełkach przedmiotowych powleczonych żelatyną. Następnie próbki pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu przez noc w dygestorium.

Przekroje płucze się, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, aby usunąć kryształki soli, które mogły pozostać po procesie montowania. Następnie preparaty odwadnia się w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, oczyszcza w ksylenie i zakrywa szkiełkami przy użyciu medium montującego Permount. Na tym etapie preparaty należy przechowywać przez około tydzień do 10 dni w pozycji poziomej, aby pozwolić medium montującemu stwardnieć.

Następnie preparaty można przechowywać w kasecie do szkiełek lub poddać obrazowaniu za pomocą mikroskopii. Metoda ta pozwala na uzyskanie pełnego profilu ekspresji interesującego białka docelowego w całym mózgu małpy. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne przekroje wieńcowe, które obrazują ekspresję FMRP, neuN oraz SMI 32.

W tym samym mózgu małpy. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić seryjne barwienie immunohistochemiczne dla białka docelowego w całym mózgu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie przekroje były poddawane łagodnemu mieszaniu podczas inkubacji w poszczególnych roztworach oraz aby przez cały czas pozostawały całkowicie zanurzone.

Ponadto, podczas montowania preparatów na szkiełkach, należy poświęcić odpowiednią ilość czasu, aby usunąć jak najwięcej zmarszczek i zagięć, nie naruszając przy tym struktury tkanki. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.