Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin

Witajcie, jestem Suma TI z laboratorium Grega Martina w Instytucie Badań nad Roślinami Voice Thompson. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę testu opartego na śmierci komórkowej w celu oceny odporności wyzwalanej przez PAM, czyli PTI. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zbadać udział konkretnego genu w procesie PTI.

Zacznijmy. Procedurę należy rozpocząć od hodowli roślin Nicotiana ANA do momentu, aż osiągną około siedmiu tygodni wieku. Cztery do pięciu dni przed rozpoczęciem.

Test odporności wyzwalanej przez PAM lub PTI. Przytnij rośliny, aby usunąć wszystkie pędy boczne i kwiaty. Staraj się usuwać pędy boczne krótko po ich pojawieniu się, aby rośliny były łatwiejsze w obsłudze.

Po przygotowaniu roślin należy przystąpić do hodowli bakterii. Procedura ta wykorzystuje bakterie niepatogenne w celu indukcji odporności roślin przed drugą inokulacją bakteriami wywołującymi chorobę; należy rozpocząć namnażanie wszystkich bakterii wykorzystywanych w analizie. Jednocześnie, dla każdego szczepu bakterii Pseudomonas, należy wykorzystać zamrożone stokki glicerolowe.

Nanieś niewielką ilość bakterii na środek płytki KBM zawierającej odpowiedni antybiotyk i inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez około 18 do 24 godzin. W przypadku agrobacterium użyj wcześniej przygotowanej świeżej płytki, aby rozpocząć hodowlę w cieczy w 2 mL LB. Hoduj przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem do następnego dnia.

Dodaj od 150 do 200 µL ciekłego medium KBM na płytki z bakteriami z rodzaju Pseudomonas. Rozprowadź bakterie po całej powierzchni płytki, używając sterylnego rozprowadzacza.

Włóż płytki z powrotem do inkubatora na kolejne 20 do 24 godzin. W przypadku agrobacterium rozpocznij hodowlę wtórną w około 5 do 10 mililitrach pożywki LB zawierającej 20 micromolar acetonu.

Kulturę hodować przez noc w temperaturze 30 °C przy ciągłym wstrząsaniu. Po przygotowaniu bakterii, na dzień przed przeprowadzeniem testu PTI, przystąpić do przygotowania roślin. Po przygotowaniu bakterii przenieść rośliny do pomieszczenia o temperaturze od 22 do 24 °C, z wilgotnością względną około 35 do 40% i stałym oświetleniem.

Następnie za pomocą grubego czarnego markera zaznacz koła na liściach. Wybierz dobrze rozwinięte liście, unikając liści starszych lub takich, które w dotyku są sztywne bądź grube. Unikaj zaznaczania dolnych części liścia.

Okręgi mają średnicę co najmniej 1,5 centymetra i na każdym liściu można zaznaczyć od dwóch do czterech okręgów. Okręgi powinny być rozmieszczone w odpowiednich odstępach i najlepiej nie powinny przecinać głównej żyłki. Przystąp do analizy PTI, zbierając bakterie wykorzystane do indukcji PTI.

Użyte gatunki Pseudomonas powinny utworzyć trawnik bakteryjny świadczący o dobrym wzroście. Należy zebrać je z płytki, zeskrobując sterylnym długim drewnianym patyczkiem, a następnie resuspender w około 20 do 25 mililitrów 10 milimolarnego roztworu chlorku magnezu do wirowania Agrobacterium.

Kulturę poddano wirowaniu w celu zebrania komórek, a następnie zawieszono je w około 20 do 25 mililitrów 10 milimolarnego chlorku magnezu z dodatkiem 10 milimolarnego MES o pH 5,6; powtórzono wirowanie i ponownie zawieszono komórki w około 20 do 25 mililitrów roztworu chlorku magnezu z MES. W ten sposób bakterie Pseudomonas i Agrobacterium indukujące proces zostały ponownie zawieszone.

Zmierz gęstość optyczną wszystkich trzech kultur przy długości fali 600 nanometrów. Dostosuj wartość OD poprzez rozcieńczenie komórek chlorkiem magnezu w przypadku pseudomonas oraz MES z dodatkiem chlorku magnezu w przypadku agrobacterium. Końcowe wymagane wartości OD znajdują się w dołączonym protokole pisemnym.

Całkowita objętość 25 mililitrów kultury bakteryjnej jest wystarczająca do inokulacji około 40 do 50 punktów. Następnie należy rozpocząć analizę, wprowadzając induktory PTI do wcześniej zaznaczonych okręgów na liściach, używając jednofunkcyjnej strzykawki o pojemności jednego mililitra bez igły. Należy zapisać kolejność infiltracji roślin oraz dokładną godzinę rozpoczęcia infiltracji po indukcji.

Przystąp do inokulacji wyzwaniem kilka godzin po inokulacji indukcyjnej. Zbierz szczepy bakteryjne wymagane do inokulacji wyzwaniem w sposób opisany wcześniej dla indukcyjnych szczepów pseudomonas. Ponownie zmierz OD i dostosuj stężenie kultur zgodnie z towarzyszącym protokołem GR.

Rozpocznij inokulację testową siedem godzin po infiltracji induktorem. Zastosuj następujące kombinacje induktora i czynnika testowego. Jako środek drugiego kręgu inokulacji wybierz punkt znajdujący się na obwodzie pierwszego kręgu inokulacyjnego.

Przeprowadź infiltrację wyzwalać w tej samej kolejności roślin, co w przypadku indukcji. Jeśli na liściu znajduje się kilka obszarów, należy upewnić się, że miejsca infiltracji nie nakładają się na siebie. Na koniec wysiej rozcieńczenia seryjne wszystkich kultur użytych w teście na płytkach KBM lub LB zawierających odpowiednie antybiotyki.

Dwa dni po inokulacji wyzwalającej można rozpocząć ocenę odpowiedzi PTI. Dwa dni po inokulacjach indukcyjnych i wyzwalających należy sprawdzić, czy pojawiła się śmierć komórek wywołana odpornością uruchomioną przez efektory (ETI) w miejscach zaszczepionych PST DC 3000. Śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji wskazuje na upośledzenie PTI i powinna być oceniona jako fenotyp pozytywny. Od czterech do pięciu dni po inokulacjach indukcyjnych i wyzwalających należy sprawdzić, czy w miejscach zaszczepionych mutantem DC 3000 hop Q1 lub PS back high pojawiła się śmierć komórek wywołana chorobą. Ponownie należy poszukać oznak upośledzenia PTI, które objawia się śmiercią komórek w wyniku choroby w obszarze nakładania się infiltracji. Należy kontynuować obserwację roślin, aż do momentu, gdy te, u których PTI nie zostało upośledzone, zaczną wykazywać śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji.

Rośliny z wyciszonym genem FLS two wykazują upośledzenie PTI dwa dni po inokulacji kombinacją PFDC. Śmierć komórek jest widoczna w obszarze nakładania się, co wskazuje na załamanie kontroli PTI. Rośliny kontrolne, w których nie wyciszono żadnego genu, również zostały poddane inokulacji kombinacją PFDC i przebadane dwa dni po przeprowadzeniu testu; śmierć komórek wywołana działaniem czynnika jest widoczna poza obszarem nakładania się, ale nie w jego wnętrzu, co wynika z prawidłowej odpowiedzi PTI.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić test śmierci komórkowej w celu oceny odporności wywołanej przez wzorce (PTI). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać rośliny w zalecanych warunkach środowiskowych. Wyższy poziom wilgotności negatywnie wpłynąłby na rośliny i spowodowałby szybszy przebieg testu.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.