Test odporności (PTI) wywołanej przez wzorzec molekularny związany z patogenem (PAMP) u roślin

Cześć, jestem Suma TI i pracuję w laboratorium Grega Martina w Voice Thompson Institute for Plant Research. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę testu opartego na śmierci komórki pod kątem odporności wywołanej PAM lub PTI. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby szukać udziału genu w PTI.

Więc zacznijmy. Rozpocznij procedurę od uprawy Nicotiana ANA do około siódmego tygodnia życia. Cztery do pięciu dni przed rozpoczęciem.

Test odporności wyzwalany przez PAM lub test PTI. Przytnij rośliny, aby usunąć wszystkie gałęzie pachowe i kwiaty. Spróbuj usunąć gałęzie pachowe wkrótce po ich pojawieniu się, aby rośliny były łatwiejsze w zarządzaniu.

Po przygotowaniu roślin przystąp do hodowli bakterii. Procedura ta wykorzystuje bakterie niepatogenne do indukcji odporności roślin przed drugą inokulacją bakteriami prowokacyjnymi, inicjuje wzrost wszystkich bakterii użytych w teście. W tym samym czasie należy użyć mrożonych łodyg glicerolu bakterii Pseudomonas dla każdej łodygi bakterii Pseudomonas.

Rozprowadź niewielką ilość bakterii na środku płytki KBM zawierającej odpowiedni antybiotyk i inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 18 do 24 godzin. W przypadku agrobacterium użyj wcześniej przygotowanego świeżego talerza, aby rozpocząć płynną kulturę w dwóch mililitrach funtów. Rośnie przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem następnego dnia.

Dodaj 150 do 200 mikrolitrów płynnego KBM do płytek bakterii Pseudomonas. Rozprowadź bakterie na całej płytce. Za pomocą sterylnego gretera.

Umieść płytki z powrotem w inkubatorze na kolejne 20 do 24 godzin. Cztery agrobacterium. Rozpocznij hodowlę wtórną w około pięciu do 10 mililitrach LB zawierających 20 mikromolowych acetonów.

Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Po przygotowaniu bakterii przystąp do przygotowania roślin do testu na dzień przed przeprowadzeniem testu PTI. Po przygotowaniu bakterii przenieś rośliny do pomieszczenia o temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza o wilgotności względnej około 35 do 40% i stałym świetle.

Następnie użyj grubego czarnego markera, aby zaznaczyć kółka na liściach. Wybierz dobrze rozwinięte liście i unikaj starszych liści lub liści, które są twarde lub grube w dotyku. Unikaj oznaczania dolnych części liścia.

Koła mają co najmniej 1,5 centymetra średnicy, a na liść można oznaczyć od dwóch do czterech kółek. Okręgi powinny być dobrze rozmieszczone i najlepiej, aby nie przecinały dużej żyły. Rozpocznij test PTI od zebrania bakterii użytych do indukcji PTI.

Użyte gatunki Pseudomonas powinny były uformować bakteryjny trawnik wskazujący na dobry wzrost. Zbierz je z talerza, zeskrobując sterylnym długim drewnianym patyczkiem i ponownie zawieś w około 20 do 25 mililitrach 10 milimolowców. Roztwór chlorku magnezu do wirówki agrobacterium.

Hodowla w celu zebrania komórek i resusu zawiesi się w około 20 do 25 mililitrach 10-milimolowego chlorku magnezu plus 10 milimolowców. MES pH 5,6, powtórzyć wirowanie i ponownie resus Zawiesić około 20 do 25 mililitrów chlorku magnezu plus roztwór MES. Teraz, gdy indukujące bakterie Pseudomonas i Agrobacterium są ponownie zawieszone.

Zmierz gęstość optyczną wszystkich trzech kultur na długości fali 600 nanometrów. Dostosuj SZW, rozcieńczając komórki chlorkiem magnezu w przypadku pseudomonas i MES z chlorkiem magnezu w przypadku agrobacterium. Ostateczne wymagane wartości OD znajdują się w dołączonym pisemnym protokole.

Całkowita objętość 25 mililitrów kultury bakteryjnej wystarcza do zaszczepienia około 40 do 50 miejsc. Teraz rozpocznij test od infiltracji induktorów PTI do wstępnie zaznaczonych kółek na liściach za pomocą jednomililitrowej strzykawki bez igły. Zapisz kolejność, w jakiej rośliny były infiltrowane i dokładny czas, w którym infiltracja została rozpoczęta po indukcji.

Przejdź do szczepienia prowokacyjnego kilka godzin po inokulacji indukcyjnej. Zebrać szczepy bakteryjne wymagane do inokulacji prowokacyjnej, jak to wcześniej wykazano dla indukujących szczepów Pseudomonas. Ponownie zmierz OD i dostosuj stężenie kultur zgodnie z dołączonym protokołem GR.

Rozpocznij szczepienie prowokacyjne siedem godzin po infiltracji induktora. Użyj następujących kombinacji pretendentów induktora. Wybierz punkt na obrzeżach pierwszego okręgu inokulacji jako środek drugiego okręgu inokulacji.

Przeprowadzić infiltrację prowokacyjną w tej samej kolejności roślin, co indukcja. Jeśli na liściu jest wiele plam, upewnij się, że nacieki nie zachodzą na siebie. Na koniec należy seryjnie rozcieńczyć płytką wszystkie kultury użyte w teście na płytkach KBM lub LB zawierających odpowiednie antybiotyki.

Dwa dni po inokulacji prowokacyjnej można rozpocząć ocenę odpowiedzi PTI, dwa dni po indukcji i inokulacji prowokacyjnej, szukać pojawienia się śmierci komórki z powodu odporności wywołanej efektorem lub ETI w miejscach, które były prowokowane PST Śmierć komórki DC 3000 w nakładającym się obszarze nacieku wskazuje na rozpad PTI i powinna być oceniana jako fenotyp dodatni cztery do pięciu dni po indukcji i prowokacji szczepienia szukają pojawienia się śmierci komórki z powodu choroby w miejscach, które zostały zakwestionowane mutantem DC 3000 hop Q1 lub PS z powrotem na haju. Poszukaj rozpadu PTI, który jest wskazywany przez śmierć komórki z powodu choroby w nakładającym się obszarze naciekania. Kontynuuj obserwację roślin, aż te, które nie są zagrożone PTI, zaczną wykazywać śmierć komórek w nakładającym się obszarze infiltracji.

Rośliny wyciszone dla FLS 2 są zagrożone dla PTI dwa dni po zaszczepieniu kombinacją PFDC. Śmierć komórki jest widoczna w nakładającym się obszarze, co wskazuje na rozpad roślin kontrolnych PTI, które nie zostały wyciszone dla żadnego genu. Zostali również zaszczepieni kombinacją PFDC i przebadani dwa dni po przeprowadzeniu testu, śmierć komórek z powodu prowokacji jest widoczna na zewnątrz, ale nie wewnątrz nakładającego się obszaru ze względu na normalną odpowiedź PTI.

Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać test oparty na śmierci komórki pod kątem odporności wywołanej przez pant lub PTI podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby trzymać rośliny w zalecanych przez nas warunkach środowiskowych. Wyższy poziom wilgotności negatywnie wpłynąłby na rośliny i sprawiłby, że test przebiegałby szybciej.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.