Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja sygnału lokalizacji plazmodesmy w białkach docelowych. Metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące badania połączeń międzykomórkowych roślin poprzez identyfikację krytycznej myśli w sygnałach, które kierują białka do plazmodesmatów, co z kolei ułatwia transport dużych cząsteczek z komórki do komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura jest niezawodna i może być łatwo dostosowana do odkrywania sekwencji sygnałowych lokalizacji plazmodesmatów w większości białek docelowych plazmodesmatów.

Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sadzenie, filtracja i przygotowanie do etapów obserwacji konfokalnej są trudne do nauczenia się za pomocą typowej publikacji drukowanej. Posadź nasiona Nicotiana benthamiana w wilgotnej glebie i o dużej gęstości. Podczas uprawy trzymaj je w kontrolowanej komorze środowiskowej w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza i poniżej 16 godzin światła dziennie, które zawiera około 75 mikromoli fotonów na metr kwadratowy na sekundę.

Gdy średnica u. fil osiągnie pół centymetra, ostrożnie przenieś sadzonki do większych doniczek i kontynuuj ich wzrost w tej samej komorze w tych samych warunkach. Utrzymuj rośliny, aż osiągną fazę od czterech do ośmiu liści w ciągu czterech tygodni.

W tym momencie największe liście powinny mieć średnicę od czterech do sześciu centymetrów. Aby ułatwić identyfikację i analizę, wybierz system ekspresji i znakuj fluorescencyjnie każde białko eksprymowane zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Przygotować plazmid na bazie pPZP-RCS2 zgodnie z opisem i dodać jeden mikrogram do 100 mikrolitrowej hodowli kompetentnych komórek z Agrobacterium tumefaciens.

Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Następnie błyskawicznie zamroź komórki w ciekłym azocie na jedną minutę. Następnie podgrzej komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie dodaj jeden mililitr pożywki LB do właściwej mieszaniny komórek.

Po dodaniu pożywki LB umieść komórki z powrotem w temperaturze 28 stopni Celsjusza na dwie godziny. Następnie wiruj komórki z prędkością 3 000 razy G przez jedną minutę. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,2 mililitra pożywki LB i umieścić je na selektywnych płytkach agarowych LB z antybiotykiem.

Hoduj komórki na płytkach w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aż poszczególne kolonie będą widoczne. Następnie zbierz i ułóż kilka pojedynczych kolonii na świeżych płytkach agarowych LB i hoduj komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie weź niewielką ilość bakterii z każdej płytki do analizy i użyj Colony PCR, aby potwierdzić obecność określonych konstruktów binarnych, które są przedmiotem zainteresowania.

Dodaj każdą kolonię agrobacterium z interesującym konstruktem do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Następnie odwirować komórki 3,000 razy G. Ponownie zawiesić osad do OD600 0,5 w buforze do agroinfiltracji.

Inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie załadować inokulum do jednomililitrowej plastikowej strzykawki. Trzymając w pełni dojrzały liść N.Benthamiana palcem w rękawiczce na powierzchni przyosiowej, dociśnij dyszę strzykawki do dolnego naskórka liścia. Następnie powoli wprowadzaj agrobacterium do pożywki infiltracyjnej, wstrzykując pożywkę.

Utrzymuj infiltrowaną roślinę do czasu, gdy będzie można ją zaobserwować. Użyj ostrza, aby pokroić każdy liść na fragmenty między żyłami od 24 do 48 godzin po infiltracji. Umieść plastry liści na szkiełku przedmiotowym powierzchnią liścia aosiowego skierowaną do góry.

Następnie umieść kroplę wody na plasterku liścia i przykryj go szkłem nakrywkowym. Unieruchom szkło nakrywkowe małymi kawałkami taśmy z każdej strony. Przenieś szkiełko pod laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i użyj subiektywnej soczewki 10X, aby zidentyfikować komórki o najlepszym sygnale.

Następnie użyj obiektywu subiektywnego 63X, aby zarejestrować obrazy w celu uzyskania bardziej szczegółowych obserwacji. Ponadto należy użyć odpowiednich fluorescencyjnych do wzbudzenia ekspresji białek fluorescencyjnych. Zachowaj wszystkie ustawienia używane do pozyskiwania obrazów, aby zachować spójność między eksperymentami.

Średnio badaj od 100 do 120 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego. Zdiagnozuj lokalizację badanych białek za pomocą obrazów z mikroskopu konfokalnego. Obrazy te ilustrują charakterystyczne wzorce lokalizacji plazmodesmatów obwodowych zaobserwowane dla pełnowymiarowego białka ruchu TMV połączonego z cząsteczką ładunku CFP oraz dla zidentyfikowanego sygnału lokalizacji plazmodesmy połączonego z CFP, a także dla białka lokalizacyjnego plazmodesmy o koekspresji, PDCB1 połączonego z DsRed.

W warunkach kontrolnych plazmodesmata ukierunkowana na pełnowymiarowe białko ruchowe TMV połączone z CFP i sygnał lokalizacji w białku ruchu TMV połączonym z CFP, pojawia się, jak pokazano tutaj, z subkomórkową lokalizacją CFP i nukleocytoplazmatyczną lokalizacją markera DsRed2. Kiedy czwarty aminokwas, walina, jest zmutowany do alaniny, plazmodesmat celowany zarówno przez białko ruchowe TMV o pełnej długości, jak i zidentyfikowany sygnał lokalizacyjny w białku ruchu TMV zostaje utracony. Wskazuje to, że ta reszta jest ważna dla struktury lub funkcji sygnału lokalizacji plazmodesmatów.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 50 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby rośliny były w bardzo dobrym stanie, a rośliny są w odpowiedniej fazie liści. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć nie tylko, jak zidentyfikować sygnał białkowy lokalizacji plazmodesmatów, ale także wiedzieć, jak zidentyfikować inne pewne sygnały w białkach roślinnych.