Name: Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji sygnałów lokalizacji plazmodesmalnej w białkach roślinnych z wykorzystaniem Nicotiana benthamiana. Niezawodna technika umożliwia badanie transportu międzykomórkowego w roślinach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z braku miejsca, cytowaliśmy głównie artykuły przeglądowe i przepraszamy naszych kolegów, których oryginalne prace nie zostały zacytowane. Prace w laboratorium V.C. są wspierane przez granty z NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD i BSF dla V.C., a laboratorium SGL jest wspierane przez NIH oraz fundusze z Zakładów Patologii Roślin i Biologii Mikroorganizmów dla S.G.L.

1. Materiał roślinny
<ol>
	<li>Wybór gatunków roślin</li>
	<li>Należy użyć gatunku rośliny rodzimego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. takiego, który koduje to białko dla białek endogennych lub który stanowi naturalnego gospodarza dla patogenu dla białek wirusowych. Ponadto wybrane gatunki roślin muszą być podatne na wybraną metodę przejściowej transformacji genetycznej. 
	UWAGA: W badaniach rutynowo wykorzystuje się Nicotiana benthamiana, która stanowi dobrego gospodarza dla TMV i jest skutecznie przekształcana przez technikę transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium, tj. agroinfiltracji (patrz Krok 3). Rośliny N. benthamiana są również łatwe w uprawie i mają duże liście, które są łatwo zaszczepiane przez Agrobacterium i łatwo analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Wzrost roślin
	<ol>
		<li>Posadź nasiona N. benthamiana w wilgotnej glebie o dużej gęstości. Przechowuj je w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 20-25 °C pod 16 godzinami światła przy ~75 μmol fotonach m-2 s-1 i 8 godzinach ciemności. Gdy średnica eufilu osiągnie 0,5 cm, ostrożnie przenieś sadzonki do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tej samej komorze w tych samych warunkach.</li>
		<li>Utrzymuj rośliny do momentu, gdy osiągną fazę 4-8 liści w ciągu 4 tygodni, gdy największe liście mają średnicę 4-6 cm; w tym czasie można je wykorzystać do agroinfiltracji (patrz Krok 3). 
		UWAGA: Co ważne, nigdy nie używaj roślin, jeśli zaczęły kwitnąć, ponieważ na tym etapie rozwoju architektura liści często się zmienia24,25, co czasami prowadzi do niespójnych wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konstrukcja wektora wyrażenia
<ol>
	<li>Wybór systemu odciągania pokarmu
	<ol>
		<li>Należy wybrać system ekspresji, tj. wektory i metodę dostarczania wektorów, najlepiej dopasowany do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania u badanych gatunków roślin. 
		UWAGA: Czasami takie specyficzne kombinacje badanych gatunków białek/roślin mogą wymagać określonych wektorów i metody dostarczania wektorów w celu optymalnej ekspresji i funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak w przypadku większości roślin dwuliściennych należy wybrać plazmidy binarne jako wektory ekspresji i agroinfiltrację jako system dostarczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie fluorescencyjne białek
	<ol>
		<li>Oznacz fluorescencyjnie każde białko ulegające ekspresji w celu analizy jego dystrybucji subkomórkowej22, w tym lokalizację Pd. 
		UWAGA: Zastosuj białka autofluorescencyjne, takie jak CFP i DsRed2, jako znaczniki. Oznacz badane białko CFP i poddaj je koekspresji za pomocą wolnego DsRed2. CFP funkcjonuje zarówno jako znacznik, jak i jako cząsteczka ładunkowa niezwiązana z wirusem. Funkcje DsRed2 w celu kalibracji ogólnej wydajności ekspresji w stanach nieustalonych oraz, ponieważ jest autonomiczny dla komórki, w celu identyfikacji początkowo przekształconej komórki; Ta ostatnia funkcja jest ważna przy ocenie przemieszczania się między komórkami potencjalnie nieautonomicznych badanych białek. W celu koekspresji z markerem Pd PDCB1, który również jest autonomiczny komórkowo, oznacz badane białko CFP, a PDCB1 DsRed2.</li>
		<li>Z reguły połącz znacznik autofluorescencyjny z końcem karboksylowym wyrażonego białka. Jeśli jednak oznakowane badane białko o pełnej długości wykazuje upośledzone celowanie w Pd, przenieś znacznik do końca aminowego białka.</li>
		<li>Sklonuj sekwencje kodujące białek, które mają być badane, do odpowiedniego wektora ekspresji roślinnej. 
		UWAGA: Istnieje wiele różnych wektorów ekspresji roślin, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne. Używamy serii plazmidów pSAT 26 lub niektórych z ich pochodnych 27,28, które są odpowiednie do klonowania interesującej nas sekwencji bezpośrednio w ramce z sugerowanymi znacznikami autofluorescencyjnymi (patrz Krok 2.2.1) zarówno w orientacji amino-, jak i karboksylowo-końcowej.</li>
		<li>Przenieś każdą kasetę z wyrażeniami do wektora binarnego Agrobacterium. 
		UWAGA: Chociaż konstrukty oparte na pSAT nadają się do bezpośredniego dostarczania biolistycznego do tkanek roślinnych, agroinfiltracja, która jest zalecaną tutaj metodą transformacji (patrz Krok 3), wymaga, aby kaseta ekspresji znajdowała się między granicami T-DNA wektora binarnego29. 
		UWAGA: Wszystkie wektory pSAT są zaprojektowane tak, aby umożliwić taki transfer do wielogenowego wektora binarnego ekspresji pPZP-RCS2 26,30 poprzez jednoetapowe klonowanie przy użyciu rzadkich nukleaz tnących AscI, I-PpoI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI i PI-TliI26. Naukowcy, którzy preferują klonowanie rekombinatoryczne, np. przy użyciu heterologicznych miejsc lox31, mogą zastosować warianty wektorów pSAT 26,27.</li>
		<li>W celu uzyskania koekspresji przenieś obie kasety ekspresji, np. badane białko-CFP i DsRed2 lub badane białko-CFP i PDCB1-DsRed2 (patrz krok 2.1), do tego samego wektora binarnego pPZP-RCS2. 
		UWAGA: Alternatywnie, kultury Agrobacterium zawierające indywidualne konstrukty binarne mogą być mieszane ze sobą w celu infiltracji do N. benthamiana (patrz Krok 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Agroinfiltracja
<ol>
	<li>Dodać 1 μg plazmidu na bazie pPZP-RCS2 z kroku 2.2.5 do 100 μl hodowli kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105 lub GV3101 przygotowanych zgodnie z opisem32, inkubować na lodzie przez 30 minut, zamrażać w ciekłym azocie przez 1 minutę i inkubować w temperaturze 28 °C przez 15 minut.
	<ol>
		<li>Następnie dodać 1 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl) do właściwej mieszaniny komórek i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 godziny. Odwirować komórki w temperaturze 3 000 × g przez 1 minutę, ponownie zawiesić je w 0,2 ml LB i umieścić na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami (np. 100 mg/l spektynomycyny i 50 mg/l ryfampicyny dla wektorów opartych na pPZP-RSC226,30). Rosnąć w temperaturze 28 °C przez 48 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać i ułożyć na płytce z agarem świeże LB (patrz krok 3.1), hodować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin i pobrać niewielką ilość bakterii do analizy metodą colony PCR33, aby potwierdzić obecność określonych konstruktów binarnych.</li>
	<li>Hodować każdą kolonię Agrobacterium z interesującym konstruktem przez noc w temperaturze 28 °C w 5 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (patrz krok 3.1.1). Odwirować komórki w stężeniu 3 000 × g i ponownie zawiesić je do OD600 = 0,5 w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 μM acetosyringonu). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>W przypadku stosowania mieszaniny plazmidów binarnych, a nie pojedynczego plazmidu o ekspresji wielogenowej do koekspresji białek, przed infiltracją wymieszaj odpowiednie kultury komórkowe w stosunku 1:1 v/v. Następnie inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować inokulum do plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml i docisnąć dyszę strzykawki (bez igły) do dolnego (abaksjalnego) naskórka w pełni dojrzałych liści N. benthamiana. Przytrzymaj liść palcem w rękawiczce na powierzchni adaxial34,35.
	<ol>
		<li>Wprowadzić Agrobacterium do pożywki infiltracyjnej przez powolne wstrzyknięcie. Aby uzyskać istotność statystyczną, naciekaj kilka liści na każdej roślinie. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że najstarsze liście nie są używane, ponieważ nie dają one stałych poziomów ekspresji.</li>
		<li>Zaszczepić wszystkie liście in situ. Utrzymuj infiltrowaną roślinę do czasu obserwacji opisanej w kroku 1.2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Za pomocą ostrza pociąć każdy liść na fragmenty między żyłkami 24-48 godzin po infiltracji (w zależności od skuteczności przejściowej ekspresji określonego badanego białka); rozmiar każdego wycinka tkanki powinien być taki, aby wycinek był całkowicie pokryty szkłem nakrywkowym (22 mm x 40 mm) używanym do mikroskopii.</li>
	<li>Umieść plastry liści na szkiełku przedmiotowym powierzchnią liścia aosiowego skierowaną do góry, umieść kroplę wody na plasterku liścia i przykryj go szkłem nakrywkowym. Unieruchom szkło nakrywkowe małymi kawałkami taśmy z każdej strony.</li>
	<li>Obserwuj agroinfiltrowane tkanki pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym i zapisz uzyskane obrazy.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj soczewki obiektywowej 10x, aby zidentyfikować komórki z sygnałem, a następnie użyj soczewki obiektywu 63x, aby uzyskać bardziej szczegółowe obserwacje.</li>
		<li>Użyj długości fali 458 nm z lasera argonowo-jonowego do wzbudzenia CFP i 543 nm do wzbudzenia DsRed2. Zachowaj wszystkie ustawienia akwizycji obrazu, tj. intensywność lasera i ustawienia lampy fotopowielacza (PMT), między eksperymentami. Średnio zbadaj 100-120 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Identyfikacja PLS
<ol>
	<li>Zdiagnozuj lokalizację badanego białka za pomocą mikroskopu konfokalnego (punkt 4). Sprawdź, czy badane białko ma charakterystyczny peryferyjny wzór punktowy25,36,37,38,39,40,41 i kolokalizuje się ze znacznikiem Pd PDCB123. Wskazuje to, że badane białko najprawdopodobniej zawiera sekwencje PLS.</li>
	<li>Po potwierdzeniu aktywności PLS badanego białka, stopniowo podziel jego otwartą ramkę odczytu (ORF) (numer dostępu do banku genów BAF93925.1) na mniejsze fragmenty, autofluorescencyjnie (np. CFP) oznacz każdy z nich i przeanalizuj ich lokalizację subkomórkową zgodnie z opisem w Kroku 4. Początkowo zalecana jest wielkość 100 reszt aminokwasowych dla każdego podzielonego fragmentu.</li>
	<li>Następnie należy podzielić obcięte fragmenty, które mają aktywność PLS i sprawdzić ich lokalizację subkomórkową, jak opisano w kroku 4, aż zostanie zidentyfikowany najmniejszy fragment, który nadal lokalizuje się w Pd, tj. jest wystarczający do przetransportowania ładunku znacznika autofluorescencyjnego do Pd. Przypuszcza się, że ten fragment reprezentuje sekwencję PLS.</li>
	<li>Usuń przypuszczalny PLS z badanego białka o pełnej długości, tj. połącz pozostałą część badanego białka bez przypuszczalnego PLS ze znacznikiem autofluorescencyjnym i określ subkomórkową lokalizację powstałego zmutowanego białka, jak opisano w kroku 4. Jeśli to zmutowane białko, które nie ma przypuszczalnego PLS, nie zlokalizuje się w Pd, będzie to oznaczać, że zidentyfikowany PLS jest nie tylko wystarczający (patrz Krok 5.3), ale także niezbędny do transportu Pd badanego białka.</li>
	<li>Agroinfiltrować liście mieszaniną kultur Agrobacterium zawierających konstrukt wyrażenia dla PLS znakowanego CFP i wolnego DsRed2 (patrz krok 3.3). Obserwuj naciekaną tkankę za pomocą mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową 10x, używając tych samych ustawień, co w kroku 4.3.</li>
	<li>Oceń komórki, które zawierają zarówno sygnały CFP, jak i DsRed2 jako początkowo naciekające komórki, i oceń sąsiednie komórki, które zawierały tylko sygnał CFP, jako te, które wykazują ruch. 
	UWAGA: Ten krok bada zidentyfikowany PLS pod kątem jego potencjalnej zdolności do przemieszczania się między komórkami; dzieje się tak, ponieważ wiele białek, które celują w Pd (w tym większość wirusów roślinnych MP) również przemieszcza się przez Pd do sąsiednich komórek. Stężenie Agrobacterium stosowanego do infiltracji zależy odpowiednio od skuteczności ekspresji różnych struktur. Do agroinfiltracji należy upewnić się, że używasz rozcieńczenia hodowli komórkowej, które zapewnia (i) transformację pojedynczych komórek, pozostawiając sąsiednie komórki nieprzekształcone, (ii) osiąga podobną wydajność ekspresji. Na przykład nasze eksperymenty wykorzystują OD600 wynoszące 0,01 i 0,005 do ekspresji odpowiednio PLS znakowanych CFP i wolnego DsRed2.</li>
</ol>
6. Identyfikacja kluczowych pozostałości PLS za pomocą skanowania alaniny42
<ol>
	<li>Użyj standardowych protokołów PCR, aby amplifikować sekwencję kodującą PLS za pomocą pary starterów zaprojektowanych tak, aby zawierały pożądaną mutację, tj. Podstawienie docelowej reszty aminokwasowej alaniną, wokół centralnego obszaru każdego startera, jak opisano21. Wykonaj projekt podkładu i użyj zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce do mutagenezy ukierunkowanej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oczyść otrzymane produkty PCR przy użyciu dowolnego standardowego zestawu do oczyszczania DNA i strawij je w temperaturze 37 °C za pomocą DpnI w celu wyeliminowania rodzicielskiego (tj. niezmutowanego) metylowanego i hemimetylowanego DNA. Schładzaj to przez 5 minut w temperaturze pokojowej (nie na lodzie). Następnie przekształć mieszaninę bezpośrednio w komórki kompetentne E. coli43 i zidentyfikuj kolonie z pożądanymi zmutowanymi konstruktami, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Wprowadź zmutowane konstrukty do wektora binarnego zgodnie z opisem w kroku 2.2.4, przeprowadź agroinfiltrację zgodnie z opisem w kroku 3 i oceń celowanie w Pd zgodnie z opisem w krokach 4 i 5.1.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+a+signaling+hub+at+the+cellular+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).</li>
<li>Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+viruses+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata.</a> J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).</li>
<li>Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication via plasmodesmata.</a> New Phytol. 205, 970-972 (2015).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+spread+their+influence%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata spread their influence.</a> F1000Prime Rep. 7, 25(2015).</li>
<li>Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytosol+must+flow%3A+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).</li>
<li>Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata-mediated+intercellular+signaling+during+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development.</a> Front. Plant Sci. 5, 44(2014).</li>
<li>Sager, R., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25262225">Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses.</a> J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).</li>
<li>Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+targeting+signal+recognition%3A+a+key+control+point+in+nuclear+transport%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?</a> BioEssays. 22, 532-544 (2000).</li>
<li>Miyamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9334211">Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors.</a> J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).</li>
<li>Nair, R., Carter, P., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLSdb%3A+database+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NLSdb: database of nuclear localization signals.</a> Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).</li>
<li>Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+nuclear-pore+and+plasmodesmal+trafficking+of+information+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules.</a> Planta. 210, 177-187 (2000).</li>
<li>Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-to-cell+trafficking+assay+indicates+that+the+KNOX+homeodomain+is+necessary+and+sufficient+for+intercellular+protein+and+mRNA+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking.</a> Genes Dev. 19, 788-793 (2005).</li>
<li>Lucas, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+trafficking+of+KNOTTED1+homeodomain+protein+and+its+mRNA+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata.</a> Science. 270, 1980-1983 (1995).</li>
<li>Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+evolutionarily+conserved+amino+acid+residues+in+homeodomain+of+KNOX+proteins+for+intercellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking.</a> Plant Signal. Behav. 9, e28355(2014).</li>
<li>Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+molecular+analysis+of+Dof+transcription+factors+identified+a+conserved+motif+for+intercellular+protein+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking.</a> New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLOS Biol. 6, e7(2008).</li>
<li>Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27559035">Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal.</a> Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).</li>
<li>Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteine-histidine-rich+region+of+the+movement+protein+of+Cucumber+mosaic+virus+contributes+to+plasmodesmal+targeting%2C+zinc+binding+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis.</a> Virology. 349, 396-408 (2006).</li>
<li>Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+cell-to-cell+movement+requires+formation+of+cortical+punctate+structures+containing+Red+clover+necrotic+mosaic+virus+movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein.</a> Virology. 413, 205-215 (2011).</li>
<li>Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus%3A+pioneering+research+for+a+century%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century.</a> Plant Cell. 11, 301-308 (1999).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell+movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein.</a> mBio. 7, e02052-e02015 (2016).</li>
<li>Ueki, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21746703">To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants.</a> Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> Plant Cell. 21, 581-594 (2009).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: structure, function and biogenesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15821977">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Chakrabarty, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17601162">pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).</li>
<li>Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+system+for+multiple+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A versatile vector system for multiple gene expression in plants.</a> Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Walhout, A. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11075367">GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1023/A:1007484917759">Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).</li>
<li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+intact+bacteria+%28colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of intact bacteria (colony PCR).</a> Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).</li>
<li>Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945296045414">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. , 101-108 (1997).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
<li>Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microtubules+in+intercellular+transport+of+plant+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA.</a> Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+epidermal+plasmodesmata+is+restricted+to+the+leading+edge+of+expanding+infection+sites+of+tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV).</a> Plant J. 12, 781-789 (1997).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Kotlizky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dysfunctional+movement+protein+of+Tobacco+mosaic+virus+interferes+with+targeting+of+wild-type+movement+protein+to+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).</li>
<li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).</li>
<li>Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alanine+scanning+mutagenesis+of+a+plant+virus+movement+protein+identifies+three+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains.</a> Plant Cell. 5, 973-982 (1993).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07352680490452807">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lee, M. W., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+assay+by+agroinfiltration+of+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transient expression assay by agroinfiltration of leaves.</a> Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+virus-induced+gene+silencing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).</li>
<li>Tian, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescent+tagging+of+full-length+Arabidopsis+gene+products+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta.</a> Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).</li>
<li>Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pollen-specific+pectin+methylesterase+involved+in+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth.</a> Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).</li>
<li>Hunter, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+nuclear+localization+signals+mediate+nuclear+localization+of+the+GATA+transcription+factor+AreA%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA.</a> Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Protokół ten składa się z czterech podstawowych elementów: koncepcji identyfikacji sekwencji, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do ukierunkowania na Pd, systematycznego podziału białka będącego przedmiotem zainteresowania na fragmenty, które są stopniowo skracane pod względem długości, łączenia badanych fragmentów z białkiem autofluorescencyjnym, które służy zarówno jako znacznik, jak i jako ładunek makrocząsteczkowy, oraz testu funkcjonalnego do celowania w Pd w żywych tkankach roślinnych po przejściowej...

Plasmodesmaty (Pd) funkcjonują jako kanały do transportu międzykomórkowego kluczowych regulatorów rozwoju i morfogenezy roślin, począwszy od czynników transkrypcyjnych, a skończywszy na mRNA i małych cząsteczkach RNA. Co więcej, ta makromolekularna zdolność transportowa Pd jest wykorzystywana przez większość wirusów roślinnych do ich międzykomórkowego rozprzestrzeniania się podczas infekcji; aby przemieszczać się przez Pd, wirusy roślinne wyewoluowały wyspecjalizowane białka, zwane białkami ruchu (MP), które są specjalnie ukierunkowane na Pd1,2,3,4,5,6,7. Molekularne szlaki transportu Pd najprawdopodobniej są ściśle powiązane z określonymi sekwencjami, które kierują transportowane białka do tych szlaków. W związku z tym identyfikacja tych sygnałów lokalizacyjnych Pd (PLS) może być diagnostyką odpowiadającego im szlaku transportu Pd. Jest to analogia do transportu Pd8, na przykład do różnych ścieżek importu jądrowego, które mogą być specyficzne dla różnych sekwencji sygnału lokalizacji jądrowej (NLS)9,10. Koncepcyjnie zarówno NLS, jak i PLS reprezentują nierozszczepialne subkomórkowe sekwencje celowania, które są niezbędne i wystarczające do celowania. Jednak w przeciwieństwie do NLSs11, informacje o sekwencji PLS są poważnie ograniczone. W szczególności opisano tylko cztery sekwencje białek zaangażowane w celowanie w Pd, z których wszystkie pochodzą z endogennych białek roślinnych. Pierwsza z nich jest reprezentowana przez domenę homeoboxa KN112 – czynnik transkrypcyjny, który przemieszcza się z wewnętrznych warstw komórkowych do naskórka liścia rośliny13 – i jego homologi KNOX14. Drugi również pochodzi od czynnika transkrypcyjnego, Dof, który zawiera przypuszczalny PLS opisany jako motyw transportu międzykomórkowego (IT)15. Trzecia sekwencja pochodzi z białka błonowego typu 1 rezydującego w plazmodesmacie PDLP1 i jest reprezentowana przez domenę transbłonową16. Wreszcie, czwarta sekwencja celująca w Pd została niedawno zgłoszona dla białek zakotwiczonych w glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) i jest reprezentowana przez sygnał modyfikacji glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI)17.
Ciekawe, że do niedawna nie zgłoszono żadnych PLS dla wirusowych MP. Wcześniejsze badania wykazały obecność przypuszczalnych sekwencji PLS w wirusach roślinnych MPS18,19, ale w wirusowym MP nie zidentyfikowano prawdziwej sekwencji aminokwasów, tj. minimalnej sekwencji aminokwasów, zarówno koniecznej, jak i wystarczającej do celowania w Pd niepowiązanej cząsteczki ładunku (np. CFP). Jednak jedno z tych białek, MP wirusa mozaiki tytoniu (TMV), było pierwszym, dla którego wykazano lokalizację i transport Pd20.
Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy eksperymentalną strategię identyfikacji TMV MP PLS. Strategia ta opierała się na trzech koncepcjach. (i) Zdefiniowaliśmy PLS jako minimalną sekwencję aminokwasów, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do kierowania białka do Pd21. (ii) Ponieważ TMV MP najpierw atakuje Pd, a następnie translokuje się przez te kanały22, naszym celem było rozdzielenie tych dwóch działań i zidentyfikowanie działającego w dobrej wierze PLS, który działa tylko do namierzania Pd, a nie do późniejszego transportu. (iii) Przeanalizowaliśmy zidentyfikowany PLS pod kątem reszt aminokwasowych ważnych dla jego aktywności ukierunkowanej na Pd, zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie. Korzystając z tego podejścia, nakreśliliśmy sekwencję 50-aminokwasowych reszt na końcu aminowym TMV MP, która działa jak bona fide PLS. Dokonano tego poprzez wyprodukowanie serii fragmentów TMV MP, które nasyciły całą długość białka, oznaczając ich końce karboksylowe CFP i przejściowo eksprymując je w tkankach roślinnych. Lokalizację Pd każdego z badanych fragmentów określono poprzez ich koekspresję z białkiem markerowym Pd, PDCB1 (Pd callose binding protein 1)23. Najmniejszy fragment, który nadal znajdował się w Pd, ale nie przechodził przez Pd, został uznany za reprezentujący PLS. Na koniec PLS został zeskanowany alaniną w celu określenia kluczowych reszt aminokwasowych wymaganych do jego struktury i/lub funkcji.
Podczas gdy tutaj ilustrujemy to podejście, opisując identyfikację TMV MP PLS, może ono być wykorzystane do odkrycia PLS w innych białkach ukierunkowanych na Pd, czy to kodowanych przez patogeny roślinne, czy przez same rośliny; dzieje się tak dlatego, że nasza metoda nie wykorzystuje żadnych unikalnych cech wirusowych MP w odniesieniu do ich zdolności do kierowania na Pd.

<table><tbody><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Każdy CLSM o podobnych możliwościach jest odpowiedni</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen do obrazowania mikroskopem konfokalnym</td><td>Wersja Zeiss</td><td>2009</td><td>Oprogramowanie powinno być kompatybilne z używanym przez CLSM</td></tr><tr><td>zestawem do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Quickchange II&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki bez igieł</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) to połączenia między komórkami, które funkcjonują jako bramy, przez które małe i duże cząsteczki są transportowane między komórkami roślinnymi. Podczas gdy zakłada się, że transport Pd małych cząsteczek, takich jak jony i woda, zachodzi pasywnie, transport makrocząsteczek biologicznych z komórki do komórki, takich białek, najprawdopodobniej zachodzi poprzez aktywny mechanizm, który obejmuje specyficzne sygnały celowania w transportowaną cząsteczkę. Niedobór zidentyfikowanych sygnałów lokalizacji plazmodesmatów (Pd) (PLS) poważnie ograniczył zrozumienie szlaków sortowania białek zaangażowanych w transport i komunikację makromolekularną między komórkami roślinnymi. Spośród bogactwa roślinnych białek endogennych i wirusowych, o których wiadomo, że przemieszczają się przez PD, do tej pory zgłoszono tylko trzy PLS, wszystkie z nich pochodzą z endogennych białek roślinnych. Dlatego ważne jest, aby opracować wiarygodną i systematyczną strategię eksperymentalną w celu zidentyfikowania funkcjonalnej sekwencji PLS, która jest zarówno niezbędna, jak i wystarczająca do celowania w Pd, bezpośrednio w żywych komórkach roślinnych. W tym miejscu opisujemy jedną z takich strategii, wykorzystując jako paradygmat białko ruchu między komórkami (MP) wirusa mozaiki tytoniu (TMV). Eksperymenty te, które zidentyfikowały i scharakteryzowały pierwszego roślinnego wirusa PLS, mogą być przystosowane do odkrycia sekwencji PLS w większości białek ukierunkowanych na PD.

Reprezentatywne dane, które wiernie ilustrują wyniki oczekiwane po zastosowaniu opisanych protokołów i identyfikują PLS białka MP wirusa TMV, zostały zaadaptowane z pracy Yuan et al.21. Rysunek 1A przedstawia zestawienie głównych konstruktów wykazujących ekspresję pełnej długości TMV MP (1-268), TMV MP PLS (obejmującego pierwsze 50 reszt aminokwasowych białka, 1-50) oraz jego pochodnych z mutacjami w ramach skanowania alaniną V4A, połączon...

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja sygnału lokalizacji w plasmodesmatach w białkach docelowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące badania połączeń międzykomórkowych u roślin poprzez identyfikację krytycznych sygnałów kierujących białka do plasmodesmat, co z kolei ułatwia transport dużych cząsteczek z komórki do komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura jest niezawodna i może zostać łatwo zaadaptowana do odkrywania sekwencji sygnałów lokalizacji w plasmodesmatach w większości białek celowanych do plasmodesmat.Demonstracja wideo tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy filtrowania roślin i przygotowania do obserwacji konfokalnych są trudne do opanowania na podstawie typowych publikacji drukowanych. Nasiona rośliny Nicotiana benthamiana wysiej w wilgotnej glebie, zachowując wysoką gęstość siewu. W czasie wzrostu utrzymuj je w kontrolowanej komorze środowiskowej w temperaturze od 20 do 25 °C, przy 16-godzinnym cyklu oświetlenia na dobę i natężeniu światła wynoszącym około 75 µmol fotonów/m²/s.Gdy średnica u. fil osiągnie pół centymetra, ostrożnie przenieś siewki do większych doniczek i kontynuuj ich wzrost w tej samej komorze, w tych samych warunkach. Pielęgnuj rośliny, aż w ciągu czterech tygodni osiągną stadium od czterech do ośmiu liści.Na tym etapie największe liście powinny mieć od czterech do sześciu centymetrów średnicy. W celu ułatwienia identyfikacji i analizy należy wybrać system ekspresji i oznakować fluorescencyjnie każde ekspresowane białko zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Przygotować plazmid oparty na pPZP-RCS2 zgodnie z opisem i dodać 1 µg do 100 µl kultury kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens.Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Następnie zamroź gwałtownie komórki w ciekłym azocie przez jedną minutę. Dalej ogrzej komórki w temperaturze 28°C przez 15 minut, a następnie dodaj 1 ml pożywki LB do mieszaniny kompetentnych komórek.Po dodaniu pożywki LB inkubować komórki ponownie w temperaturze 28 °C przez dwie godziny. Następnie odwirować komórki przy 3 000 ×g przez jedną minutę. Resuspender osad komórkowy w 0,2 ml pożywki LB i wysiać je na selektywne płytki LB agar z antybiotykiem.Hodować komórki na płytkach w temperaturze 28 °C przez 48 godzin, aż do pojawienia się widocznych pojedynczych kolonii. Następnie wyizolować kilka pojedynczych kolonii i przenieść je na świeże płytki z agarem LB, a następnie inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 48 godzin. Następnie pobrać niewielką ilość bakterii z każdej płytki do analizy i przeprowadzić Colony PCR, aby potwierdzić obecność specyficznych, interesujących nas konstruktów binarnych.Przenieś każdą kolonię agrobacterium z interesującym konstruktem do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej o odpowiednie antybiotyki. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 28 °C. Następnie odwiruj komórki przy 3 000 ×g. Resuspenduj osad w buforze do agroinfiltracji do uzyskania OD600 wynoszącej 0,5.Inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wprowadzić inokulum do plastikowej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przytrzymując w pełni dojrzały liść N.Benthamiana palcem w rękawiczce od strony adaksjalnej, docisnąć końcówkę strzykawki do dolnego naskórka liścia. Następnie powoli wprowadzić agrobacterium w medium do infiltracji poprzez wstrzyknięcie medium.Utrzymywać zainfiltrowaną roślinę do momentu obserwacji. Od 24 do 48 godzin po infiltracji użyć skalpela, aby pociąć każdy liść na fragmenty wzdłuż żyłek. Umieścić wycinki liści na szkiełku przedmiotowym stroną abaksjalną do góry.Następnie nanieś kroplę wody na przekrój liścia i przykryj go szkiełkiem nakrywką. Unieruchom szkiełko nakrywkowe za pomocą małych kawałków taśmy po obu stronach. Przenieś preparat pod konfokalny mikroskop skaningowy i użyj obiektywu 10X, aby zidentyfikować komórki z najlepszym sygnałem.Następnie użyj obiektywu 63X, aby zarejestrować obrazy dla bardziej szczegółowych obserwacji. Dodatkowo użyj odpowiednich fluorescencji, aby wzbudzić ekspresowane białka fluorescencyjne. Zachowaj wszystkie ustawienia stosowane podczas akwizycji obrazów, aby zapewnić spójność między eksperymentami.Średnio należy zbadać od 100 do 120 komórek dla każdego warunku doświadczalnego. Lokalizację badanych białek należy określić na podstawie obrazów z mikroskopu konfokalnego. Obrazy te przedstawiają charakterystyczne, obwodowe, punktowe wzorce lokalizacji w plazmodesmatach, zaobserwowane dla pełnowymiarowego białka ruchu TMV połączonego z cząsteczką ładunku CFP, dla zidentyfikowanego sygnału lokalizacji w plazmodesmatach połączonego z CFP, a także dla współwyrażonego białka lokalizacji w plazmodesmatach, PDCB1 połączonego z DsRed.W warunkach kontrolnych celowanie w plazmodesmaty pełnowymiarowego białka transportowego TMV połączonego z CFP oraz sygnału lokalizacji w białku transportowym TMV połączonym z CFP przebiega w sposób pokazany tutaj, z subkomórkową lokalizacją CFP i nukleocytoplazmatyczną lokalizacją markeru DsRed2. Gdy czwarty aminokwas, walina, zostanie zmutowany na alaninę, utracone zostaje celowanie w plazmodesmaty zarówno przez pełnowymiarowe białko transportowe TMV, jak i zidentyfikowany sygnał lokalizacji w białku transportowym TMV. Wskazuje to, że reszta ta jest istotna dla struktury lub funkcji sygnału lokalizacji w plazmodesmatach.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można ukończyć w ciągu 50 godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby rośliny były w bardzo dobrym stanie zdrowotnym i znajdowały się na odpowiednim etapie rozwoju liści. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę nie tylko na temat tego, jak identyfikować sygnał białka lokalizującego się w plazmodesmatach, ale także jak identyfikować inne określone sygnały w białkach roślinnych.

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Poznaj metodę identyfikacji sygnałów lokalizacji plazmodesmalnej w białkach roślinnych z wykorzystaniem Nicotiana benthamiana. Niezawodna technika umożliwia badanie transportu międzykomórkowego w roślinach.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Przeglądaj więcej filmów