Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja sygnału lokalizacji w plasmodesmatach w białkach docelowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące badania połączeń międzykomórkowych u roślin poprzez identyfikację krytycznych sygnałów kierujących białka do plasmodesmat, co z kolei ułatwia transport dużych cząsteczek z komórki do komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura jest niezawodna i może zostać łatwo zaadaptowana do odkrywania sekwencji sygnałów lokalizacji w plasmodesmatach w większości białek celowanych do plasmodesmat.

Demonstracja wideo tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy filtrowania roślin i przygotowania do obserwacji konfokalnych są trudne do opanowania na podstawie typowych publikacji drukowanych. Nasiona rośliny Nicotiana benthamiana wysiej w wilgotnej glebie, zachowując wysoką gęstość siewu. W czasie wzrostu utrzymuj je w kontrolowanej komorze środowiskowej w temperaturze od 20 do 25 °C, przy 16-godzinnym cyklu oświetlenia na dobę i natężeniu światła wynoszącym około 75 µmol fotonów/m²/s.

Gdy średnica u. fil osiągnie pół centymetra, ostrożnie przenieś siewki do większych doniczek i kontynuuj ich wzrost w tej samej komorze, w tych samych warunkach. Pielęgnuj rośliny, aż w ciągu czterech tygodni osiągną stadium od czterech do ośmiu liści.

Na tym etapie największe liście powinny mieć od czterech do sześciu centymetrów średnicy. W celu ułatwienia identyfikacji i analizy należy wybrać system ekspresji i oznakować fluorescencyjnie każde ekspresowane białko zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Przygotować plazmid oparty na pPZP-RCS2 zgodnie z opisem i dodać 1 µg do 100 µl kultury kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens.

Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Następnie zamroź gwałtownie komórki w ciekłym azocie przez jedną minutę. Dalej ogrzej komórki w temperaturze 28°C przez 15 minut, a następnie dodaj 1 ml pożywki LB do mieszaniny kompetentnych komórek.

Po dodaniu pożywki LB inkubować komórki ponownie w temperaturze 28 °C przez dwie godziny. Następnie odwirować komórki przy 3 000 ×g przez jedną minutę. Resuspender osad komórkowy w 0,2 ml pożywki LB i wysiać je na selektywne płytki LB agar z antybiotykiem.

Hodować komórki na płytkach w temperaturze 28 °C przez 48 godzin, aż do pojawienia się widocznych pojedynczych kolonii. Następnie wyizolować kilka pojedynczych kolonii i przenieść je na świeże płytki z agarem LB, a następnie inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 48 godzin. Następnie pobrać niewielką ilość bakterii z każdej płytki do analizy i przeprowadzić Colony PCR, aby potwierdzić obecność specyficznych, interesujących nas konstruktów binarnych.

Przenieś każdą kolonię agrobacterium z interesującym konstruktem do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej o odpowiednie antybiotyki. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 28 °C. Następnie odwiruj komórki przy 3 000 ×g. Resuspenduj osad w buforze do agroinfiltracji do uzyskania OD600 wynoszącej 0,5.

Inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wprowadzić inokulum do plastikowej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przytrzymując w pełni dojrzały liść N.Benthamiana palcem w rękawiczce od strony adaksjalnej, docisnąć końcówkę strzykawki do dolnego naskórka liścia. Następnie powoli wprowadzić agrobacterium w medium do infiltracji poprzez wstrzyknięcie medium.

Utrzymywać zainfiltrowaną roślinę do momentu obserwacji. Od 24 do 48 godzin po infiltracji użyć skalpela, aby pociąć każdy liść na fragmenty wzdłuż żyłek. Umieścić wycinki liści na szkiełku przedmiotowym stroną abaksjalną do góry.

Następnie nanieś kroplę wody na przekrój liścia i przykryj go szkiełkiem nakrywką. Unieruchom szkiełko nakrywkowe za pomocą małych kawałków taśmy po obu stronach. Przenieś preparat pod konfokalny mikroskop skaningowy i użyj obiektywu 10X, aby zidentyfikować komórki z najlepszym sygnałem.

Następnie użyj obiektywu 63X, aby zarejestrować obrazy dla bardziej szczegółowych obserwacji. Dodatkowo użyj odpowiednich fluorescencji, aby wzbudzić ekspresowane białka fluorescencyjne. Zachowaj wszystkie ustawienia stosowane podczas akwizycji obrazów, aby zapewnić spójność między eksperymentami.

Średnio należy zbadać od 100 do 120 komórek dla każdego warunku doświadczalnego. Lokalizację badanych białek należy określić na podstawie obrazów z mikroskopu konfokalnego. Obrazy te przedstawiają charakterystyczne, obwodowe, punktowe wzorce lokalizacji w plazmodesmatach, zaobserwowane dla pełnowymiarowego białka ruchu TMV połączonego z cząsteczką ładunku CFP, dla zidentyfikowanego sygnału lokalizacji w plazmodesmatach połączonego z CFP, a także dla współwyrażonego białka lokalizacji w plazmodesmatach, PDCB1 połączonego z DsRed.

W warunkach kontrolnych celowanie w plazmodesmaty pełnowymiarowego białka transportowego TMV połączonego z CFP oraz sygnału lokalizacji w białku transportowym TMV połączonym z CFP przebiega w sposób pokazany tutaj, z subkomórkową lokalizacją CFP i nukleocytoplazmatyczną lokalizacją markeru DsRed2. Gdy czwarty aminokwas, walina, zostanie zmutowany na alaninę, utracone zostaje celowanie w plazmodesmaty zarówno przez pełnowymiarowe białko transportowe TMV, jak i zidentyfikowany sygnał lokalizacji w białku transportowym TMV. Wskazuje to, że reszta ta jest istotna dla struktury lub funkcji sygnału lokalizacji w plazmodesmatach.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można ukończyć w ciągu 50 godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby rośliny były w bardzo dobrym stanie zdrowotnym i znajdowały się na odpowiednim etapie rozwoju liści. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę nie tylko na temat tego, jak identyfikować sygnał białka lokalizującego się w plazmodesmatach, ale także jak identyfikować inne określone sygnały w białkach roślinnych.