Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych za pomocą czterech czynników transkrypcyjnych, systemu transdukcji lentiwirusowej indukowanej doksycykliną

Cześć, nazywam się Brad Hamilton. Pracuję w dziale badań i rozwoju w STEM Gen. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych

Procedura ta może być stosowana zarówno do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak i do badania procesu przeprogramowywania. Więc zacznijmy. Zacznij od wysiewu mysich fibroblastów embrionalnych lub komórek metamfetaminy na 15-centymetrowym naczyniu pokrytym żelatyną o gęstości cztery razy 10 piątych komórek na szalkę.

Teraz dodaj 30 mililitrów pożywki wzrostowej metamfetaminy i inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż osiągną około 80% zlewania się. Po zakończeniu inkubacji zaaspiruj pożywkę i dodaj 30 mililitrów wzrostu. Pożywka uzupełniona skoncentrowanym lentiwirusem.

Delikatnie kołysz naczyniem, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie podłoża. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z pełną transdukcją wirusa. Przejdźmy do przeprogramowania indukowanego doksycykliną.

Aby rozpocząć przeprogramowywanie od 20 do 24 godzin po transdukcji, trypsyna jest transdukowana komórki i odwirowywać je w temperaturze 200 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej. Po zawieszeniu nasiona, transdukowane mes osiągają stężenie odpowiednie dla rozmiaru naczynia do hodowli komórkowej, którego używasz.

Tutaj używamy 2,5 razy 10 do piątych komórek na 10-centymetrową szalkę do eksperymentów z wydajnością przeprogramowania i izolacji kolonii IPS oraz dwa razy 10 do czwartej komórki na studzienkę w czterech płytkach dołkowych do eksperymentów immunochemicznych. Aby monitorować wydajność transdukcji, inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Na tym etapie komórki można zamrozić w ciekłym azocie w celu przyszłej analizy, jeśli zajdzie taka potrzeba.

Następnego dnia odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką wzrostową, która została uzupełniona doksycykliną do końcowego stężenia dwóch mikrogramów na mililitr. Dołączamy kontrolę ujemną zawierającą pożywkę bez doksycykliny. Na koniec inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Rozpoczęliśmy proces przeprogramowywania. Ogólnie. Kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych będą wystarczająco duże, aby można je było wyizolować po 16 do 22 dniach.

Zanim zademonstrujemy tę procedurę, musimy najpierw zweryfikować wydajność transdukcji za pomocą chemii w celu określenia wydajności transdukcji. Testy immunochemiczne przeprowadza się na komórkach ponownie posadzonych na płytkach czterodołkowych 48 godzin po indukcji doksycykliny. Wszystkie objętości wymienione w tym protokole należy dostosować do rozmiaru płytki do hodowli komórkowej, zaczynając od delikatnego umycia komórek.

Po użyciu PBS niezawierającego jonów magnezu lub wapnia, utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% aldehydu paraform w PBS przez 15 minut. W temperaturze pokojowej ponownie delikatnie umyj komórki dwa razy PBS. Następnie przetrzyj komórki, dodając 500 mikrolitrów lodowatego 0,2% Tween 20 w inkubacji PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po umyciu komórek jeszcze dwa razy. Dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Teraz dodaj 200 mikrolitrów pożądanego przeciwciała pierwszorzędowego.

Tutaj używamy markerów pluripotencji T, 4K, LF cztery, SOX dwa i cmic. Następnego dnia inkubuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwukrotnym delikatnym umyciu komórek PBS, inkubować je z 200 mikrolitrami przeciwciała wtórnego przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem.

Tutaj używamy odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z czwórkami fluorowymi do wizualizacji, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po inkubacji. Umyj komórki jeszcze dwa razy, a następnie dodaj DPI i ponownie inkubuj przez 10 minut, aby uwidocznić jądra. Na koniec, po ostatnim praniu, dodaj antifa aqua mount przed obrazowaniem komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby określić wydajność transdukcji.

Rozpocznij izolację i ekspansję pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po rozpoczęciu procesu przeprogramowywania należy codziennie monitorować kultury i wymieniać odpowiednią pożywkę co 48 godzin. Używamy pożywki uzupełnionej doksycykliną do hodowli komórek przez pierwsze 12 dni, a następnie usuwamy doksycyklinę z pożywki do tego.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub kolonie IPS ręcznie wybierane do ekspansji to doksycyklina. Niezależne komórki powinny być codziennie monitorowane pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces przeprogramowywania. Każdy eksperyment będzie inny, ale kolonie są na ogół wystarczająco duże, aby można je było izolować od 16 do 22 dni po indukcji DS na dzień przed rozpoczęciem procesu izolacji i przeprogramowania kolonii trypsyny.

Przygotować 24-dołkową płytkę, wysiewając ją napromieniowaną promieniami gamma warstwą zasilającą mets o gęstości pięć razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia ręcznie wybierz każdą kolonię IPS i spróbuj ją anyżować w celu dysocjacji agregatów komórkowych, ponownie odtwórz komórki IPS w pożywce dla embrionalnych komórek macierzystych myszy w poszczególnych dołkach poprzedniej płytki 24-dołkowej, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Wymiana nośnika co 24 godziny. Codziennie monitoruj kolonie IPS pod kątem wzrostu i fluorescencji GFP. Inkubowaliśmy nasze kultury przez sześć dni przed zapakowaniem na czterodołkowe płytki w celu analizy pluripotencji.

Określ, które studzienki z 24 płyt kołowych jednolicie wyrażają studzienki GFP, które mają dobrą ekspresję GFP, mogą być wyzwalane, inizowane i pasowane od jednego do ośmiu do czterech płyt studzienkowych, które zostały poprzedzone napromieniowanymi promieniami gamma warstwami zasilającymi mes. Płytki te można następnie wykorzystać do analizy ICC pod kątem pluripotencji, aby rozpocząć analizę pluripotencji. Delikatnie umyj komórki dwukrotnie PBS nie zawierającym jonów magnezu ani wapnia.

Dodaj 0,5 mililitra na studzienkę lodowatego 0,2% między 20 w PBS i inkubuj komórki przez 10 minut. Po trzech kolejnych płukaniach w bloku PBS, niespecyficzne wiązanie z 200 mikrolitrami buforu blokującego przez godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj 200 mikrolitrów pożądanego przeciwciała pierwszorzędowego.

Tutaj użyliśmy SSEA jeden nanog i OCT cztery, inkubując komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwukrotnym delikatnym umyciu komórek inkubuj je z 200 mikrolitrami przeciwciał wtórnych przez godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając je z dala od światła. Tutaj używamy odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z siłą fluoro do wizualizacji, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po kolejnych dwóch płukaniach, dodajemy DPI i inkubujemy komórki przez 10 minut.

Teraz, po ostatnim umyciu, dodaj antifa aqua mount przed obrazowaniem komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Kolonie IPS można również analizować pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów. Zestaw lentiwirusa TF indukowanego przez mysie TF może być używany do przeprogramowania mes do komórek IPS po transdukcji ekspresji czynników transkrypcyjnych MES.

T cztery, SOX dwa, KLF cztery i seic można wykryć w komórkach traktowanych doksycykliną, ale w komórkach nieleczonych można wykryć niewielką ekspresję lub jej brak. Zmiany morfologiczne będą postępować z czasem, aby wygenerować większe, bardziej podobne do komórek ES kolonie o zdefiniowanych krawędziach kolonii i trójwymiarowym wzroście. Po usunięciu docs następuje zauważalne odwrócenie morfologii komórkowej dla niektórych kolonii podobnych do komórek ES.

Jednak wiele kolonii zachowało morfologię IPS. Te kolonie IPS po wybraniu i przejściu wyświetlają. Typowa ekspresja markera pluripotencji fosfatazy alkalicznej, nano T four i SSEA one.

Typ komórek metamfetaminy użytych w tym eksperymencie wykazywał ekspresję GFP z endogennego locus nag. Po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji wyrażenie GFP może być zatem wykorzystane jako wstępny wskaźnik udanego przeprogramowania. Właśnie pokazaliśmy, jak wywołać przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych w celu indukcji pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą systemu przeciwwirusowego indukowanego przez doksycyklinę z czterema czynnikami transkrypcyjnymi.

Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że podczas projektowania eksperymentów przeprogramowywania należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych, aby zoptymalizować wydajność przeprogramowywania. Po pierwsze, możliwa jest modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do komórek docelowych na etapie pierwotnej infekcji w celu zwiększenia lub zmniejszenia wydajności transdukcji, wpływając w ten sposób na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu, przez jaki komórki są wystawione na działanie docs, może wpłynąć na liczbę generowanych kolonii IPS.

Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może wpływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki, które aktywnie rosną i dzielą się, są bardziej podatne na przeprogramowanie. Wreszcie, podczas modyfikowania protokołu dla różnych liczb komórek lub różnych rozmiarów naczyń do hodowli tkankowych, zaleca się, aby docelowa liczba komórek była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni szalki hodowlanej. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.