Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych za pomocą czterech czynników transkrypcyjnych, systemu transdukcji lentiwirusowej indukowanej doksycykliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-13T20:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych przy użyciu systemu lentiwirusowego indukowanego doksycykliną. Protokół umożliwia kontrolowane przeprogramowanie komórek somatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Transdukcja wirusowa MEF-ów
 <ol>
<li>Dzień przed rozpoczęciem eksperymentu pokryć 15 cm szalkę do hodowli komórkowej 0,2% żelatyną filtrowaną sterylnie w ddH2O. Inkubować szalkę przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Odssać ciecz z pokrytej żelatyną szalki i zasiać komórki MEF (użyto komórek Nanog-GFP/rtTA MEF) w gęstości 4x105 komórek na szalkę. Inkubować komórki w 30 ml pożywki wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnionej o 50 ml FBS, 5 ml 100x nieistotnych aminokwasów, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez dwa dni w temperaturze 37°C i 5% CO2, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 80%.</li>
<li>Odssać pożywkę i dodać 30 ml pożywki wzrostowej MEF uzupełnionej o skoncentrowany lentiwirus (4 x 100 μl roztworu zapasu wirusa + 29,6 ml pożywki wzrostowej). Delikatnie kołysać szalką, aby zapewnić równomierne rozłożenie pożywki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
 2. Reprogramowanie indukowane doksycykliną
 <ol>
<li>Od 20 do 24 godzin po transdukcji poddać przetransdukowane komórki trypsynizacji, odwirować z prędkością 200 x g przez 5 minut i resuspendować w pożywce wzrostowej ES/iPS (450 ml Knockout DMEM uzupełnionej o 50 ml kwalifikowanego serum cielęcego do hodowli komórek ES, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,5 ml β-merkaptoetanolu oraz 25 μl LIF). Wysiać przetransdukowane MEF w stężeniu odpowiednim do rozmiaru naczynia hodowlanego (w eksperymentach dotyczących wydajności reprogramowania i izolacji kolonii zastosowano 2,5 x 105 komórek na szalkę 10 cm, a w eksperymentach ICC 2 x 104 komórek na dołek w płytkach 4-dołkowych). Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Uwaga: pozostałe przetransdukowane komórki można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz.</li>
<li>Odssać pożywkę i zastąpić ją świeżo przygotowaną pożywką ES/iPS uzupełnioną doksycykliną do stężenia końcowego 2 μg/ml (jako kontrolę negatywną zastosowano również pożywkę bez DOX). Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
 3. Analiza immunocytochemiczna wydajności transdukcji
48 godzin po indukcji doksycykliną należy określić wydajność transdukcji za pomocą immunohistochemii (ICC). Badanie ICC należy przeprowadzić na komórkach przesianych do płytek 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole powinny zostać dostosowane do rozmiaru płytki hodowlanej.
<ol>
<li>Przemyj delikatnie komórki raz za pomocą PBS (bez Mg2++ lub Ca2++).</li>
<li>Utrwal komórki, dodając 500 μl 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.</li>
<li>Przeprowadź permeabilizację komórek, dodając 500 μl schłodzonego do temperatury lodowej 0,2% Tween®-20 w PBS. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.</li>
<li>Zablokuj niespecyficzne wiązania, dodając 200 μl buforu blokującego, i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Inkubuj komórki z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyto przeciwciał przeciwko Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc).</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.</li>
<li>Inkubuj komórki z 200 μl przeciwciała wtórnego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem (użyto koniugatów: Donkey anti-Rabbit Rhodamine, Donkey anti-Goat AlexaFluor® 594, Donkey anti-Mouse Rhodamine oraz Donkey anti-Rabbit Rhodamine).</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.</li>
<li>Dodaj DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubuj przez 10 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki za pomocą PBS.</li>
<li>Przed obrazowaniem przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego dodaj medium antyblaknące Aqua-Mount.</li>
</ol>
4. Izolowanie i powiększanie kolonii komórek iPS
<ol>
<li>Po zainicjowaniu procesu przeprogramowania (opisanego w sekcji 2), monitoruj hodowle i wymieniaj medium co 48 godzin. Przez pierwsze dwanaście dni do hodowli komórek stosowaliśmy medium zawierające doksycyklinę, a następnie usunęliśmy doksycyklinę z medium, aby zapewnić, że kolonie iPS ręcznie wybrane do ekspansji będą niezależne od DOX.</li>
<li>Komórki należy monitorować codziennie pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces przeprogramowania; w przypadku użycia komórek takich jak Nanog-GFP/rtTA MEF, monitoruj morfologię i fluorescencję GFP w celu zidentyfikowania przeprogramowanych kolonii. Każdy eksperyment będzie przebiegać inaczej, ale kolonie są zazwyczaj wystarczająco duże do izolacji między 16. a 22. dniem. Kolonie zidentyfikowane w tym przedziale czasowym można następnie izolować ręcznie i trypsynizować w celu ekspansji i analizy.</li>
<li>Dzień przed izolacją i trypsynizacją przeprogramowanych kolonii, przygotuj płytkę 24-dołkową, wysiewając gamma-naświetlone MEF warstwy karmionki w gęstości 5 x 104 komórek na dołek. Inkubuj przez noc w 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Ręcznie wybierz każdą kolonię iPS i poddaj trypsynizacji, aby rozbić agregaty komórkowe. Przesiej komórki iPS w medium ES/iPS do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej uprzednio wysianej gamma-naświetlonymi MEF warstwami karmionki. Dołki powinny być wysiewane w gęstości 2 x 105 komórek/dołek. Inkubuj w 37°C i 5% CO2. Wymieniaj media co 24 godziny.</li>
<li>Codziennie monitoruj wzrost kolonii iPS oraz fluorescencję GFP. Hodowle inkubujemy przez 6 dni przed pasażowaniem.</li>
<li>Ustal, które dołki płytki 24-dołkowej wykazują jednorodną ekspresję GFP. Dołki z dobrą ekspresją GFP można trypsynizować i pasażować w stosunku 1:8 na płytki 4-dołkowe, które zostały uprzednio wysiane gamma-naświetlonymi MEF warstwami karmionki. Płytki te można wykorzystać do analizy markerów pluripotencji za pomocą ICC i barwienia AP.</li>
</ol>
5. Analiza immunocytochemiczna w kierunku pluripotencji
Badania ICC przeprowadzono na komórkach namnożonych na płytkach 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole należy dostosować do rozmiaru płytki do hodowli komórkowej.
<ol>
 <li>Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS (bez Mg2++ lub Ca2+).</li>
<li>Inkubuj przez 10 minut w 0,5 ml lodowatego 0,2 % Tween 20 w PBS na każdą studzinkę.</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 200 μl buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4°C z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego (użyliśmy SSEA-1, Nanog i Oct4).</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 200 μl przeciwciała drugorzędowego, chroniąc próbki przed światłem (użyliśmy koniugatu Donkey anti-Mouse Rhodamine oraz Donkey anti-Rabbit Rhodamine).</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Dodaj DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubuj przez 10 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.</li>
<li>Przemyj delikatnie komórki za pomocą PBS.</li>
<li>Przed obrazowaniem za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego dodaj środek antyblaknący Aqua-Mount.</li>
</ol>
6. Barwienie kolonii komórek iPS na fosfatazę alkaliczną (AP)
<ol>
<li>Kolonie iPS z sekcji 4 mogą być również analizowane pod kątem aktywności AP z wykorzystaniem dostępnych komercyjnie zestawów, zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
Część 7. Reprezentatywne wyniki
Zestaw lentiwirusów Stemgent DOX Inducible Mouse TF może być wykorzystany do przeprogramowania MEF w komórki iPS. Po transdukcji MEF ekspresja czynników transkrypcyjnych Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc może być wykryta w komórkach traktowanych doksycykliną (DOX+), natomiast w komórkach nietraktowanych (DOX-) ekspresja jest znikoma lub niewykrywalna (rycina 1). Zmiany morfologiczne będą postępować w czasie (w tym przykładzie 12 dni traktowania DOX), prowadząc do powstania większych kolonii bardziej przypominających komórki ES, z wyraźnymi krawędziami i wzrostem trójwymiarowym (rycina 2a). Po usunięciu DOX w niektórych koloniach przypominających komórki ES następuje zauważalny powrót do pierwotnej morfologii komórkowej, jednak wiele kolonii zachowuje morfologię iPS (rycina 2a). Kolonie iPS te, po wyizolowaniu i pasażowaniu, wykazują typową ekspresję markerów pluripotencji: fosfatazy alkalicznej (AP), Nanog, Oct4 i SSEA-1 (rycina 3). Typ komórek MEF użyty w tym doświadczeniu (komórki Nanog-GFP/rtTA MEF) wykazuje ekspresję GFP z endogennego locus Nanog po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji. Ekspresja GFP może zatem służyć jako wstępny wskaźnik udanego przeprogramowania (rycina 3).
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Schemat fluorescencyjnej mikroskopii komórkowej; ekspresja genów z/bez Dox; Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Analiza immunocytochemiczna (ICC) 48 godzin po indukcji DOX. Panel po lewej stronie (-DOX) stanowi reprezentatywną kontrolę negatywną dla ekspresji czterech czynników transdukcji bez indukcji DOX. Poprawną ekspresję czynników transkrypcyjnych potwierdzono za pomocą odpowiednich przeciwciał (zaznaczonych na czerwono), z barwieniem DAPI w celu wizualizacji jądra komórkowego.
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Porównanie kultur komórkowych w różnych etapach, obrazy z mikroskopii z analizą fluorescencji GFP, schemat." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Konwersja morfologiczna MEF Nanog-GFP/rtTA do stanu komórek iPS. A) Obrazowanie w kontraście fazowym (100x) komórek wykazujących zagęszczenie i konwersję MEF w kolonie iPS w czasie od dnia 3 (D3+Dox) do dnia 22 (D22). DOX wycofano w dniu 12. Panel górny lewy: obraz kontrolny ujemny (20x) z płytki –DOX. B) Obrazy w kontraście fazowym i fluorescencji GFP (200x) wyróżnionej kolonii iPS w 18. dniu po indukcji DOX. C) Obrazy w kontraście fazowym i fluorescencji GFP (200x) dodatkowej kolonii iPS w 18. dniu po indukcji DOX.
<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Analiza różnicowania komórek; mikroskopia immunofluorescencyjna; wyniki barwienia GFP, Rodaminą i DAPI." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Analiza kolonii iPS. (A) Mikroskopia w kontraście fazowym i barwienie AP kolonii iPS (200x). (B) Analiza markerów pluripotencji: panel lewy przedstawia nałożenie obrazu w kontraście fazowym na ekspresję reportera reprogramowania GFP. Ekspresja GFP odzwierciedla endogenny poziom ekspresji Nanog. Panel środkowy przedstawia barwienie ICC dla markerów pluripotencji. Panel prawy przedstawia barwienie DAPI w celu wizualizacji jąder (100x).

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+mouse+liver+and+stomach+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells.</a> Science. 321, 699-702 (2008).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Lerou, P. H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of embryonic stem cells.</a> Blood Rev. 19, 321-331 (2005).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
</ol>

Autor, Brad Hamilton, jest zatrudniony przez firmę Stemgent, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

Wyniki te wykazują, że zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set może być wykorzystany do wydajnego generowania kolonii iPS poprzez indukcję ektopowej ekspresji przetransdukowanych czynników transkrypcyjnych w embrionalnych fibroblastach mysich. Podczas projektowania eksperymentów z przeprogramowaniem należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności tego procesu. Po pierwsze, podczas etapu pierwotnej infekcji można zmodyfikować stosunek aktywnego wirusa do komórki docelowej (tj. M.O.I.), aby zwiększyć lub zmniejszyć wydajność transdukcji, co wpływa na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu ekspozycji komórek na DOX może wpłynąć na wydajność generowania kolonii komórek iPS. Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może oddziaływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki aktywnie rosnące i dzielące się są bardziej podatne na ten proces. Na koniec, przy modyfikowaniu protokołu dla różnej liczby komórek lub naczyń hodowlanych o różnej wielkości, zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego.

<table><tbody><tr><td>Zestaw skoncentrowanego lentiwirusa TF mysiego indukowanego DOX</td><td>Stemgent</td><td>00-0003</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Wykorzystując określony zestaw czynników transkrypcyjnych oraz warunki hodowli komórkowej, Yamanaka i współpracownicy wykazali, że dostarczenie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4 za pośrednictwem retrowirusów jest w stanie indukować pluripotencję w fibroblastach mysich.1 W późniejszych doniesieniach wykazano użyteczność indukowalnego doksycykliną (DOX) systemu dostarczania lentiwirusowego w celu generowania pierwotnych i wtórnych komórek iPS z różnych innych typów dorosłych somatycznych komórek mysich.2,3
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są podobne do embrionalnych komórek macierzystych (ES) pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do indukowania tworzenia potworniaków. Oba typy komórek mogą służyć jako pluripotencjalny materiał wyjściowy do generowania zróżnicowanych komórek lub tkanek w medycynie regeneracyjnej.4-6 Komórki iPS mają również wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, nie budząc przy tym dylematów etycznych związanych z niszczeniem embrionów.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przy użyciu zestawu lentiwirusowych wektorów Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. Wykazujemy również, że zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set umożliwia ekspresję każdego z czterech czynników transkrypcyjnych po transdukcji do komórek MEF, indukując tym samym stan pluripotencjalnych komórek macierzystych wykazujących markery pluripotencji charakterystyczne dla komórek ES.

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Wykorzystując zdefiniowany zestaw czynników transkrypcyjnych oraz określone warunki hodowli komórkowej, Yamanaka i współpracownicy wykazali, że dostarczanie za pośrednictwem retrowirusów i...

Witam, nazywam się Brad Hamilton. Pracuję w dziale badań i rozwoju w STEM Gen. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z embrionalnych fibroblastów mysich.Niniejszą procedurę można wykorzystać zarówno do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak i do badania procesu przeprogramowania. Przejdźmy zatem do działania. Należy rozpocząć od wysiania embrionalnych fibroblastów mysich (komórek MEF) na 15 cm płytkę pokrytą żelatyną z gęstością 4 × 10⁵ komórek na płytkę.Następnie należy dodać 30 milliliters pożywki wzrostowej dla komórek meth i inkubować komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aż osiągną około 80% konfluencji. Po zakończeniu inkubacji należy odessać pożywkę i dodać 30 milliliters pożywki wzrostowej uzupełnionej o skoncentrowanego lentiwirusa.Delikatnie poruszaj naczyniem, aby zapewnić równomierne rozłożenie medium. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby zakończyć transdukcję wirusową. Przejdźmy teraz do przeprogramowania indukowanego doksycykliną.Aby rozpocząć przeprogramowanie, od 20 do 24 godzin po transdukcji należy poddać transdukowane komórki działaniu trypsyny, a następnie odwirować je z prędkością 200 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać medium znad osadu komórkowego i resuspender komórki w medium wzrostowym. Po resuspensji wysiać transdukowane komórki w odpowiednim stężeniu, dostosowanym do rozmiaru używanej szalki hodowlanej.W doświadczeniach dotyczących wydajności reprogramowania oraz izolacji kolonii iPS stosujemy 2,5 × 10⁵ komórek na szalkę 10 cm, natomiast w eksperymentach immunochemicznych stosujemy 2 × 10⁴ komórek na dołek w płytkach 4-dołkowych. Aby monitorować wydajność transdukcji, inkubujemy komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Na tym etapie, w razie potrzeby, komórki można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz.Następnego dnia odessać medium i zastąpić je świeżym medium wzrostowym uzupełnionym o doksycyklinę do stężenia końcowego 2 µg/mL. Należy uwzględnić kontrolę negatywną zawierającą medium bez doksycykliny. Na koniec inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Rozpoczęliśmy proces przeprogramowania. Zazwyczaj kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych osiągną wielkość umożliwiającą ich izolację po 16 do 22 dniach.Zanim zaprezentujemy tę procedurę, musimy najpierw zweryfikować wydajność transdukcji, wykorzystując metody chemiczne do jej określenia. Badania immunochemiczne są przeprowadzane na komórkach przesianych do płytek czterodołkowych 48 godzin po indukcji doksycykliną. Wszystkie objętości wymienione w niniejszym protokole powinny zostać dostosowane do rozmiaru płytki hodowlanej; należy rozpocząć od delikatnego przemycia komórek.Po przemyciu komórek w PBS nie zawierającym jonów magnezu ani wapnia, należy je utrwalić, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu w PBS na 15 minut. W temperaturze pokojowej należy ponownie delikatnie przemyć komórki dwukrotnie w PBS. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację komórek, dodając 500 µL lodowatego 0,2% Tween 20 w PBS i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po ponownym dwukrotnym przemyciu komórek, należy dodać 200 µL buforu blokującego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Następnie należy dodać 200 µL wybranego przeciwciała pierwszorzędowego.W tym przypadku stosujemy markery pluripotencji T 4K LF four, SOX two oraz cmic. Komórki należy inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia, po delikatnym dwukrotnym przemyciu komórek roztworem PBS, inkubuje się je z 200 µL przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem.W tym etapie stosujemy odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforami w celu wizualizacji, wykorzystując odwrócony mikroskop fluorescencyjny po inkubacji. Komórki należy przemyć jeszcze dwukrotnie, a następnie dodać DPI i inkubować ponownie przez 10 minut, aby zwizualizować jądra komórkowe. Na koniec, po ostatnim przemyciu, dodać medium montażowe Antifade w celu obrazowania komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby określić wydajność transdukcji.Rozpocząć izolację i ekspansję pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po zainicjowaniu procesu reprogramowania należy codziennie monitorować hodowle i wymieniać odpowiednie pożywkę co 48 godzin. Przez pierwsze 12 dni do hodowli komórek stosujemy pożywkę uzupełnioną o doksycyklinę, a następnie usuwamy doksycyklinę z pożywki.Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub kolonie iPS pobierane ręcznie w celu ekspansji są indukowane doksycykliną. Należy codziennie monitorować poszczególne komórki pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces reprogramowania. Każdy eksperyment może przebiegać inaczej, jednak kolonie są zazwyczaj wystarczająco duże do izolacji od 16 do 22 dnia po indukcji DS; proces izolacji i trypsynizacji reprogramowanych kolonii należy rozpocząć następnego dnia.Przygotować płytkę 24-dołkową, wysiewając na nią warstwę wspierającą (feeder layer) z komórek MEF napromieniowanych gamma z gęstością 5×10⁴ komórek na dołek. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnego dnia ręcznie wyizolować każdą kolonię iPS, a następnie poddać ją trypsynizacji w celu rozbicia agregatów komórkowych. Przesiać komórki iPS do poszczególnych dołków przygotowanej wcześniej płytki 24-dołkowej, stosując pożywkę dla embrionalnych komórek macierzystych myszy. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2.Wymieniać medium co 24 godziny. Codziennie monitorować wzrost kolonii iPSC oraz fluorescencję GFP. Kultury inkubowano przez sześć dni przed przeniesieniem na płytki czterodołkowe w celu analizy pluripotencji.Należy określić, które studzienki 24-dołkowej płytki kołowej wykazują jednorodną ekspresję GFP. Studzienki o dobrej ekspresji GFP mogą zostać wybrane, zunifikowane i przeniesione (pasaż od 1 do 8) do płytek 4-dołkowych, które uprzednio przygotowano z warstw komórek karmicieli mysich naświetlonych promieniami gamma. Płytki te mogą być następnie wykorzystane do analizy ICC w celu oceny pluripotencji, aby rozpocząć analizę pluripotencyjności. Komórki należy delikatnie przemyć dwukrotnie PBS niezawierającym jonów magnezu ani wapnia.Do każdej studzienki dodać 0,5 ml lodowatego roztworu 0,2%between 20 w PBS i inkubować komórki przez 10 minut. Po trzech kolejnych przemyciach w PBS zablokować nieswoiste wiązanie, dodając 200 µl buforu blokującego i inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 200 µl wybranego przeciwciała pierwszorzędowego.W tym etapie zastosowano SSEA-1, Nanog i OCT4; komórki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po dwukrotnym delikatnym przemyciu komórek, inkubowano je z 200 µL przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Do wizualizacji wykorzystano odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforem, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego; po kolejnych dwóch przemyciach dodano DPI i inkubowano komórki przez 10 minut.Po końcowym przemyciu należy dodać medium montażowe antifa aqua przed obrazowaniem komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Kolonie iPS można również analizować pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej, korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów. Zestaw indukowalnych lentiwirusów TF mysich od stem gent docs może być wykorzystany do reprogramowania ME S w komórki iPS po transdukcji ME S i ekspresji czynników transkrypcyjnych.T four, SOX two, KLF four oraz seic można wykryć w komórkach traktowanych doksycykliną, natomiast w komórkach nietraktowanych ekspresja jest niewielka lub nieobecna. Zmiany morfologiczne będą postępować w czasie, prowadząc do powstania większych kolonii bardziej przypominających komórki ES, o wyraźnych krawędziach i trójwymiarowym wzroście. Po usunięciu docs w niektórych koloniach przypominających komórki ES następuje zauważalny powrót do pierwotnej morfologii komórkowej.Wiele kolonii zachowało jednak morfologię iPS. Kolonie iPS te, po wyizolowaniu i pasażowaniu, wykazują typową ekspresję markerów pluripotencji: fosfatazy zasadowej, Nanog, Oct4 oraz SSEA-1.Typ komórek meth użytych w tym eksperymencie wykazuje ekspresję GFP z endogennego locus nag. W związku z tym, po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji, ekspresja GFP może służyć jako wstępny wskaźnik pomyślnego przeprogramowania. Przedstawiliśmy właśnie sposób indukcji przeprogramowania embrionalnych fibroblastów mysich w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu doksycyklinowo-indukowalnego systemu antywiralnego opartego na czterech czynnikach transkrypcyjnych.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że przy projektowaniu eksperymentów z przeprogramowaniem należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności tego procesu. Po pierwsze, podczas etapu pierwotnej infekcji można zmodyfikować stosunek aktywnego wirusa do komórek docelowych, aby zwiększyć lub zmniejszyć wydajność transdukcji, co wpływa na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu ekspozycji komórek na czynniki może wpłynąć na liczbę generowanych kolonii iPS.Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może wpływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki aktywnie rosnące i dzielące się są bardziej podatne na ten proces. Na koniec, przy modyfikacji protokołu dla różnej liczby komórek lub naczyń hodowlanych o innej wielkości, zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-reprogramming-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie komórek macierzystych o potencji pluripotencyjnej poprzez reprogramowanie fibroblastów zarodkowych myszy za pomocą czterech czynników transkrypcyjnych, systemu transdukcji lentiwirusowej indukowanej doksycykliną

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mysich fibroblastów embrionalnych przy użyciu systemu lentiwirusowego indukowanego doksycykliną. Protokół umożliwia kontrolowane przeprogramowanie komórek somatycznych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych za pomocą czterech czynników transkrypcyjnych, systemu transdukcji lentiwirusowej indukowanej doksycykliną (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Przeglądaj więcej filmów