Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Witam, nazywam się Brad Hamilton. Pracuję w dziale badań i rozwoju w STEM Gen. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z embrionalnych fibroblastów mysich.

Niniejszą procedurę można wykorzystać zarówno do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak i do badania procesu przeprogramowania. Przejdźmy zatem do działania. Należy rozpocząć od wysiania embrionalnych fibroblastów mysich (komórek MEF) na 15 cm płytkę pokrytą żelatyną z gęstością 4 × 10⁵ komórek na płytkę.

Następnie należy dodać 30 milliliters pożywki wzrostowej dla komórek meth i inkubować komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aż osiągną około 80% konfluencji. Po zakończeniu inkubacji należy odessać pożywkę i dodać 30 milliliters pożywki wzrostowej uzupełnionej o skoncentrowanego lentiwirusa.

Delikatnie poruszaj naczyniem, aby zapewnić równomierne rozłożenie medium. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, aby zakończyć transdukcję wirusową. Przejdźmy teraz do przeprogramowania indukowanego doksycykliną.

Aby rozpocząć przeprogramowanie, od 20 do 24 godzin po transdukcji należy poddać transdukowane komórki działaniu trypsyny, a następnie odwirować je z prędkością 200 G przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać medium znad osadu komórkowego i resuspender komórki w medium wzrostowym. Po resuspensji wysiać transdukowane komórki w odpowiednim stężeniu, dostosowanym do rozmiaru używanej szalki hodowlanej.

W doświadczeniach dotyczących wydajności reprogramowania oraz izolacji kolonii iPS stosujemy 2,5 × 10⁵ komórek na szalkę 10 cm, natomiast w eksperymentach immunochemicznych stosujemy 2 × 10⁴ komórek na dołek w płytkach 4-dołkowych. Aby monitorować wydajność transdukcji, inkubujemy komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Na tym etapie, w razie potrzeby, komórki można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz.

Następnego dnia odessać medium i zastąpić je świeżym medium wzrostowym uzupełnionym o doksycyklinę do stężenia końcowego 2 µg/mL. Należy uwzględnić kontrolę negatywną zawierającą medium bez doksycykliny. Na koniec inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Rozpoczęliśmy proces przeprogramowania. Zazwyczaj kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych osiągną wielkość umożliwiającą ich izolację po 16 do 22 dniach.

Zanim zaprezentujemy tę procedurę, musimy najpierw zweryfikować wydajność transdukcji, wykorzystując metody chemiczne do jej określenia. Badania immunochemiczne są przeprowadzane na komórkach przesianych do płytek czterodołkowych 48 godzin po indukcji doksycykliną. Wszystkie objętości wymienione w niniejszym protokole powinny zostać dostosowane do rozmiaru płytki hodowlanej; należy rozpocząć od delikatnego przemycia komórek.

Po przemyciu komórek w PBS nie zawierającym jonów magnezu ani wapnia, należy je utrwalić, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu w PBS na 15 minut. W temperaturze pokojowej należy ponownie delikatnie przemyć komórki dwukrotnie w PBS. Następnie należy przeprowadzić permeabilizację komórek, dodając 500 µL lodowatego 0,2% Tween 20 w PBS i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po ponownym dwukrotnym przemyciu komórek, należy dodać 200 µL buforu blokującego i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Następnie należy dodać 200 µL wybranego przeciwciała pierwszorzędowego.

W tym przypadku stosujemy markery pluripotencji T 4K LF four, SOX two oraz cmic. Komórki należy inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia, po delikatnym dwukrotnym przemyciu komórek roztworem PBS, inkubuje się je z 200 µL przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem.

W tym etapie stosujemy odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforami w celu wizualizacji, wykorzystując odwrócony mikroskop fluorescencyjny po inkubacji. Komórki należy przemyć jeszcze dwukrotnie, a następnie dodać DPI i inkubować ponownie przez 10 minut, aby zwizualizować jądra komórkowe. Na koniec, po ostatnim przemyciu, dodać medium montażowe Antifade w celu obrazowania komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby określić wydajność transdukcji.

Rozpocząć izolację i ekspansję pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po zainicjowaniu procesu reprogramowania należy codziennie monitorować hodowle i wymieniać odpowiednie pożywkę co 48 godzin. Przez pierwsze 12 dni do hodowli komórek stosujemy pożywkę uzupełnioną o doksycyklinę, a następnie usuwamy doksycyklinę z pożywki.

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub kolonie iPS pobierane ręcznie w celu ekspansji są indukowane doksycykliną. Należy codziennie monitorować poszczególne komórki pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces reprogramowania. Każdy eksperyment może przebiegać inaczej, jednak kolonie są zazwyczaj wystarczająco duże do izolacji od 16 do 22 dnia po indukcji DS; proces izolacji i trypsynizacji reprogramowanych kolonii należy rozpocząć następnego dnia.

Przygotować płytkę 24-dołkową, wysiewając na nią warstwę wspierającą (feeder layer) z komórek MEF napromieniowanych gamma z gęstością 5×10⁴ komórek na dołek. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnego dnia ręcznie wyizolować każdą kolonię iPS, a następnie poddać ją trypsynizacji w celu rozbicia agregatów komórkowych. Przesiać komórki iPS do poszczególnych dołków przygotowanej wcześniej płytki 24-dołkowej, stosując pożywkę dla embrionalnych komórek macierzystych myszy. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Wymieniać medium co 24 godziny. Codziennie monitorować wzrost kolonii iPSC oraz fluorescencję GFP. Kultury inkubowano przez sześć dni przed przeniesieniem na płytki czterodołkowe w celu analizy pluripotencji.

Należy określić, które studzienki 24-dołkowej płytki kołowej wykazują jednorodną ekspresję GFP. Studzienki o dobrej ekspresji GFP mogą zostać wybrane, zunifikowane i przeniesione (pasaż od 1 do 8) do płytek 4-dołkowych, które uprzednio przygotowano z warstw komórek karmicieli mysich naświetlonych promieniami gamma. Płytki te mogą być następnie wykorzystane do analizy ICC w celu oceny pluripotencji, aby rozpocząć analizę pluripotencyjności. Komórki należy delikatnie przemyć dwukrotnie PBS niezawierającym jonów magnezu ani wapnia.

Do każdej studzienki dodać 0,5 ml lodowatego roztworu 0,2%between 20 w PBS i inkubować komórki przez 10 minut. Po trzech kolejnych przemyciach w PBS zablokować nieswoiste wiązanie, dodając 200 µl buforu blokującego i inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 200 µl wybranego przeciwciała pierwszorzędowego.

W tym etapie zastosowano SSEA-1, Nanog i OCT4; komórki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po dwukrotnym delikatnym przemyciu komórek, inkubowano je z 200 µL przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Do wizualizacji wykorzystano odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforem, używając odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego; po kolejnych dwóch przemyciach dodano DPI i inkubowano komórki przez 10 minut.

Po końcowym przemyciu należy dodać medium montażowe antifa aqua przed obrazowaniem komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Kolonie iPS można również analizować pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej, korzystając z dostępnych komercyjnie zestawów. Zestaw indukowalnych lentiwirusów TF mysich od stem gent docs może być wykorzystany do reprogramowania ME S w komórki iPS po transdukcji ME S i ekspresji czynników transkrypcyjnych.

T four, SOX two, KLF four oraz seic można wykryć w komórkach traktowanych doksycykliną, natomiast w komórkach nietraktowanych ekspresja jest niewielka lub nieobecna. Zmiany morfologiczne będą postępować w czasie, prowadząc do powstania większych kolonii bardziej przypominających komórki ES, o wyraźnych krawędziach i trójwymiarowym wzroście. Po usunięciu docs w niektórych koloniach przypominających komórki ES następuje zauważalny powrót do pierwotnej morfologii komórkowej.

Wiele kolonii zachowało jednak morfologię iPS. Kolonie iPS te, po wyizolowaniu i pasażowaniu, wykazują typową ekspresję markerów pluripotencji: fosfatazy zasadowej, Nanog, Oct4 oraz SSEA-1.

Typ komórek meth użytych w tym eksperymencie wykazuje ekspresję GFP z endogennego locus nag. W związku z tym, po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji, ekspresja GFP może służyć jako wstępny wskaźnik pomyślnego przeprogramowania. Przedstawiliśmy właśnie sposób indukcji przeprogramowania embrionalnych fibroblastów mysich w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu doksycyklinowo-indukowalnego systemu antywiralnego opartego na czterech czynnikach transkrypcyjnych.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że przy projektowaniu eksperymentów z przeprogramowaniem należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności tego procesu. Po pierwsze, podczas etapu pierwotnej infekcji można zmodyfikować stosunek aktywnego wirusa do komórek docelowych, aby zwiększyć lub zmniejszyć wydajność transdukcji, co wpływa na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu ekspozycji komórek na czynniki może wpłynąć na liczbę generowanych kolonii iPS.

Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może wpływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki aktywnie rosnące i dzielące się są bardziej podatne na ten proces. Na koniec, przy modyfikacji protokołu dla różnej liczby komórek lub naczyń hodowlanych o innej wielkości, zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.