Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu Stemgent Human TF Lentivirus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-08T19:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich fibroblastów przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten umożliwia badanie procesu przeprogramowania i zastosowania w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Reprogramowanie
<ol>
<li>Wysiać komórki BJ z gęstością 1 x 105 komórek na studnię płytki 6-dołkowej. Hodować komórki w 2 ml pożywki wzrostowej (450 ml EMEM uzupełnionej o 50 ml FBS kwalifikowanego dla ES, 5 ml 10 mM nieessentialnych aminokwasów, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,9 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Tego samego dnia rozpocząć przygotowywanie płytek z warstwą wspomagającą MEF, dodając 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do płytki 6-dołkowej i inkubując przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Po inkubacji usunąć pożywkę z komórek BJ i dodać do każdej studni 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej o 6 μg/ml polybrene, 500 μl hOct4-lentiwirusa, 50 μl hSox2-lentiwirusa, 50 μl hNanog-lentiwirusa oraz 50 μl hLin28-lentiwirusa. Delikatnie zakołysać płytką, aby zapewnić równomierne pokrycie pożywką. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Tego samego dnia wyjąć 1 fiolkę komórek MEF CF-1 z ciekłego azotu i rozmrozić. Usunąć płyn ze studni pokrytych żelatyną (patrz krok 1.2) i dodać komórki wspomagające MEF z gęstością 0,2 x 105 komórek/studnię. Całkowita objętość na studnię powinna wynosić 2 ml komórek w pożywce wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnionej o 50 ml FBS i 5 ml nieessentialnych aminokwasów).</li>
<li>Następnego dnia odkleić komórki BJ za pomocą 0,05% trypsyny/EDTA i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i resuspender w pożywce wzrostowej. Usunąć pożywkę z płytki z warstwą wspomagającą MEF (patrz krok 1.4) i dodać 2 ml/studnię zawiesiny komórek BJ. Stężenie komórek powinno wynosić około 5 x 104 komórek/studnię. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>24 godziny po ponownym wysianiu wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli ludzkich komórek ES/iPS (400 ml DMEM/F12 uzupełnionej o 100 ml Knockout Serum Replacement, 5 ml 10 mM nieessentialnych aminokwasów, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,9 ml 55 mM β-merkaptoetanolu i 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego bFGF). Wymieniać pożywkę co 24 godziny przez 7 dni.</li>
<li>Po siedmiu dniach zmienić pożywkę na warunkową pożywkę MEF (patrz sekcja 2).</li>
</ol>
2. Przygotowanie medium uwarunkowanego przez MEF
<ol>
<li>Zasiej komórki zasilające MEF CF-1 w zagęszczeniu 2 x 105 komórek/dołek na płytce 6-dołkowej w 2 ml pożywki wzrostowej MEF. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
<li>Wymień pożywkę na pożywkę do hodowli ludzkich komórek ES/iPS. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
<li>Zbieraj supernatant co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 μm.</li>
<li>Uzupełnij supernatant o 50 ng/ml bFGF.</li>
</ol>
3. Selekcja i pasażowanie kolonii iPS
<ol>
<li>Wybierz kolonię o charakterystyce ES i wysiej ją ponownie w pożywce do hodowli ludzkich komórek ES/iPS uzupełnionej o 10 μM Stemolecule Y27632 na naczyniach hodowlanych uprzednio wysianych z komórkami feederowymi MEF linii CF-1. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny przez pierwsze siedem dni (bez dodawania Stemolecule Y27632). Po siedmiu dniach zmień pożywkę na kondycjonowaną pożywkę MEF (patrz sekcja 2 w celu przygotowania). Kontynuowano pasażowanie komórek, aż uzyskały one typową morfologię ludzkich komórek ES.</li>
</ol>
4. Badanie immunocytochemiczne markerów pluripotencji
<ol>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.</li>
<li>Utrwalić komórki, dodając 500 μl utrwalacza, inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.</li>
<li>Zablokować niespecyficzne wiązanie, dodając 500 μl buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Inkubować komórki z 250 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyto TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog oraz Lin28 w rozcieńczeniach 1:100).</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.</li>
<li>Inkubować komórki z 250 μl przeciwciała wtórnego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem (użyto koniugatu Goat anti-Mouse IgM Cy3, Goat anti-Mouse IgG Cy3, Goat anti-Rat IgM Cy3 oraz Goat anti-Rabbit Cy3 w rozcieńczeniach 1:300).</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzy razy PBS.</li>
<li>Do ostatniego płukania dodać DAPI (stężenie końcowe 1 μg/ml) i inkubować przez 5 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.</li>
<li>Przeanalizować komórki pod powiększeniem.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
1. Wyniki morfologii:
Komórki fibroblastów napletka ludzkiego (BJ) poddano kotransdukcji czynnikami Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Zmiany morfologiczne zaobserwowano już w 4. dniu po transdukcji, a skupiska komórek stały się bardziej zwarte w 17. dniu (Rysunek 1). Kolonie pobrano ręcznie w 25. dniu i hodowano na warstwie wspierającej z komórek MEF szczepu CF-1. Aby ułatwić tworzenie kolonii iPS po reprogramowaniu, podczas każdego pasażowania w trakcie wstępnego wysiewania na noc stosowano inhibitor ROCK Y27632 firmy Stemolecule. Kolonie iPS o dobrej morfologii zaobserwowano po trzech kolejnych rundach pobierania i pasażowania kolonii.
2. Ekspresja markerów pluripotencji:
Aby dalej scharakteryzować wyizolowane kolonie komórek iPS, sprawdzono obecność typowych markerów pluripotencji ekspresywnych w komórkach ES. Kolonie wykazywały silną aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) (Rysunek 2). Ponadto w koloniach komórek iPS przeprowadzono immunocytochemię (ICC) z wykorzystaniem panelu przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, w tym markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3, a także markerów jądrowych Oct4, Sox2 i Nanog. Wyizolowane kolonie iPS były pozytywne pod kątem wszystkich markerów (Rysunek 3). Wyniki ICC wykazują, że komórki iPS prezentowały odpowiedni wzorzec ekspresji markerów pluripotencji, co dowodzi, że komórki te ściśle przypominają niezróżnicowane ludzkie komórki ES.
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="Różnicowanie komórek macierzystych; obraz mikroskopowy; obserwacja struktury komórkowej; badania biologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Zmiany morfologiczne transdukowanych komórek BJ. Obrazy w jasnym polu typowej kolonii komórek iPS utworzonej (A) 4 dni i (B) 17 dni po transdukcji.
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="Wzrost kolonii komórek macierzystych, obraz z mikroskopu, hodowla tkankowa, badanie proliferacji komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Aktywność AP przeprogramowanych komórek BJ. Trzy różne kolonie barwione zestawem Stemgent Alkaline Phosphatase Staining Kit.
<img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="Wyniki analizy immunofluorescencyjnej; analizowane markery komórek macierzystych Tra-1-80, Sox2, SSEA z użyciem DAPI." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3: Ludzkie komórki iPS wykazują wysoką ekspresję następujących markerów specyficznych dla komórek ES: markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markerów jądrowych Oct 4, Nanog i Sox2.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Rho%2FROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Stemgent, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszej pracy.

Wyniki te wykazują, że zestaw lentiwirusowy Stemgent Human TF może być wykorzystany do wydajnego generowania kolonii iPS poprzez indukcję ektopowej ekspresji przetransdukowanych czynników transkrypcyjnych w ludzkich fibroblastach. Projektując eksperymenty z przeprogramowaniem, należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności procesu. Po pierwsze, w pierwszym kroku transdukcji może być konieczna modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do komórek docelowych (multiplicity of infection M.O.I.), aby osiągnąć optymalną wydajność transdukcji. Po drugie, warunki wzrostu komórek docelowych mogą wpływać na przeprogramowanie. Komórki zdrowe i proliferujące są bardziej podatne na przeprogramowanie. Po trzecie, przy modyfikowaniu protokołu dla różnych liczb komórek zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego. Wreszcie, w celu zapewnienia sukcesu przeprogramowania należy rozważyć zastosowanie inhibitorów ROCK, takich jak Y27632, ponieważ niedawne badania wykazały ich przydatność w zwiększaniu przeżywalności kolonii hES.4,5

<table><tbody><tr><td>Zestaw lentiwirusów TF dla ludzi</td><td>Stemgent</td><td>00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TRA-1-81</td><td>Stemgent</td><td>09-0012</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TRA-1-60</td><td>Stemgent</td><td>09-0009</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA-4</td><td>Stemgent</td><td>09-0003</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA-3</td><td>Stemgent</td><td>09-0014</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów tf firmy stemgent

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

W 2006 roku Yamanaka i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że dostarczenie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4 za pomocą retrowirusów pozwala na indukcję stanu pluripotencji w fibroblastach myszy.1 Ta sama grupa badawcza zgłosiła również sukces w przeprogramowaniu ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) przy użyciu ludzkich wersji tych samych czynników transkrypcyjnych dostarczonych przez wektory retrowirusowe.2 Ponadto James Thomson et al. donieśli, że koekspresja innego zestawu czynników (Oct4, Sox2, Nanog i Lin28) za pośrednictwem lentiwirusów pozwala na przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w komórki iPS.3
Komórki iPS są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do różnicowania się we wszystkie typy tkanek organizmu. Ludzkie komórki iPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, unikając jednocześnie dylematów etycznych związanych z niszczeniem embrionów. Generowanie specyficznych dla pacjenta komórek iPS pozwala ominąć istotną przeszkodę w spersonalizowanych terapiach medycyny regeneracyjnej, eliminując możliwość odrzucenia immunologicznego nieautologicznych przeszczepionych komórek.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów z wykorzystaniem zestawu Stemgent Human TF Lentivirus Set. Wykazujemy również, że komórki przeprogramowane za pomocą tego zestawu zaczynają wykazywać morfologię iPS cztery dni po transdukcji. Przy użyciu Stemolecule Y27632 dokonaliśmy selekcji komórek iPS i zaobserwowaliśmy prawidłową morfologię po trzech kolejnych rundach wyławiania kolonii i pasażowania. Wykazujemy ponadto, że po przeprogramowaniu komórki wykazywały ekspresję markera pluripotencji AP, markerów powierzchniowych TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 i SSEA-3 oraz markerów jądrowych Oct4, Sox2 i Nanog.

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

W 2006 roku Yamanaka i współpracownicy po raz pierwszy wykazali, że dostarczenie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4 za pośrednictwem retrowirusów jest w stanie indukować...

Witajcie, nazywam się Brad Hamilton. Jestem naukowcem w dziale badawczno-rozwojowym w STEM Gen. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę reprogramowania ludzkich fibroblastów przy użyciu czynników reprogramujących dostarczanych za pomocą lentiwirusów.Niniejszą procedurę można wykorzystać zarówno do generowania komórek IPS, jak i do badania procesu przeprogramowania. Komórki IPS są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do różnicowania się we wszystkie typy tkanek organizmu. Ludzkie komórki IPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, nie wiążąc się z dylematem etycznym dotyczącym niszczenia zarodka w celu ich pozyskania.Generowanie specyficznych dla pacjenta komórek iPS pozwala ominąć istotną przeszkodę w spersonalizowanych terapiach medycyny regeneracyjnej, eliminując ryzyko odrzucenia immunologicznego nieautologicznych przeszczepionych komórek. Zacznijmy zatem. W kilku momentach tego protokołu należy wymienić medium hodowlane rozwijających się iPSC, czyli indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, na medium warunkowane.Przygotowanie tego medium trwa sześć dni. Należy zatem zacząć co najmniej tydzień przed planowanym rozpoczęciem eksperymentu. Aby zacząć, wysiej w każdej studzience sześciostudzienkowej.Płytka wielodołkowa zawierająca 2 × 10⁵ jtk komórek zasilających meth w 2 mL pożywki wzrostowej meth; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli komórek ludzkich E-S-I-P-S.Pożywkę inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Zbierać supernatant i wymieniać na świeżą pożywkę co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltrować supernatant przez filtr o rozmiarze porów 0,22 µm.Uzupełnij zebrany nadsącz, dodając 15 ng/ml BFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów). Otrzymasz około 16 ml pożywki warunkowanej przez komórki Meth; przechowuj nadsącz zebrany każdego dnia oddzielnie w temperaturze 4°C. Pożywka warunkowana przez komórki Meth może być przechowywana od jednego do dwóch tygodni w temperaturze 4°C lub przez kilka miesięcy w temperaturze -20°C.Po upewnieniu się, że medium warunkowane metylatorem będzie gotowe w odpowiednim momencie, omówmy przygotowanie komórek. Pierwszym zadaniem w generowaniu iPSC jest wykorzystanie lentiwirusów do transdukcji ludzkich fibroblastów z napletka, czyli komórek BJ, czterema czynnikami transkrypcyjnymi charakterystycznymi dla komórek macierzystych. Aby przygotować się do transdukcji, należy wysiać komórki BJ z gęstością 1 × 10⁵ komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i poddać je hodowli.Komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w tym samym dniu. Przygotowanie płytek z komórkami karmicielkami rozpoczęto od dodania dwóch mililitrów 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do płytki 6-dołkowej i inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Żelatyna pokrywa dołki i służy jako macierz dla komórek.Komórki BJ są teraz gotowe do transdukcji lentiwirusowej w celu przygotowania wirusa do transdukcji. Do dwóch mililitrów świeżej pożywki dodać sześć mikrogramów na mililitr polybrene oraz cztery lentiwirusy, z których każdy koduje jeden z ludzkich czynników transkrypcyjnych: T4, SO2, nanog oraz lin 28, w taki sposób, aby każdy z nich był w tej samej wielokrotności infekcji (MOI).Wszystkie te lentiwirusy wchodzą w skład zestawu lentiwirusów z czynnikami reprogramującymi człowieka. Aby przeprowadzić transdukcję, należy po prostu zastąpić pożywkę do hodowli komórek BJ pożywką zawierającą wirusy. Delikatnie zakołysać płytkę, aby pożywka równomiernie pokryła jej dno.Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide tego samego dnia. Wyjąć jedną fiolkę komórek feeder cf one meth z ciekłego azotu i rozmrozić. Usunąć roztwór żelatyny z płytek z komórkami feeder meth, które są teraz każda pokryta żelatyną.Dodaj 0,2 × 10⁵ komórek do 2 ml medium wzrostowego BJ. Inkubuj medium przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia odłącz komórki BJ za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i odwiruj przy 200 ×g przez 5 minut.Po wirowaniu odessać supernatant i resuspender komórki w pożywce wzrostowej. Usunąć pożywkę z płytki z komórkami karmidłowymi METH i dodać do każdej studni dwa mililitry zawiesiny komórek BJ. Stężenie komórek BJ powinno wynosić około 5 × 10⁴ komórek na studnię.Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂. 24 godziny po wysianiu komórek BJ na płytkę z warstwą karmąca (feeder plate) wymienić medium na human E-S-I-P-S (medium do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych). Kontynuować wymianę medium co 24 godziny przez siedem dni.Siódmego dnia należy zastąpić pożywkę do hodowli komórek ES dwoma mililitrami pożywki kondycjonowanej przez komórki meth. Komórki karmicielskie meth dostarczały rozpuszczalnych czynników niezbędnych do wzrostu komórek IPS. Obecnie należy jednak dodać więcej tych czynników, aby utrzymać hodowlę w dobrym stanie.Pożywka warunkująca Meth zawiera wszystkie rozpuszczalne czynniki wydzielane przez komórki feeder Meth inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Patrząc przez okular mikroskopu, wybierz kolonię komórek. Rozpoznawana po niewielkim, zwartym, kopulastym wyglądzie w świeżej płytce 24-dołkowej, którą 24 godziny wcześniej obsiano komórkami feeder ccf one meth; wyizoluj wybraną kolonię w hodowli ludzkich E-S-I-P-S.Pożywka uzupełniona o 10 µM cząsteczki macierzystej Y 2 7 6 3 2, która jest inhibitorem zależnej kinazy. Przez pierwsze siedem dni wymieniać pożywkę hodowlaną co 24 godziny, nie dodając cząsteczki macierzystej Y 2 7 6 3 2.Po siedmiu dniach należy zmienić pożywkę na pożywkę z dodatkiem metylu. Kontynuuj pasażowanie komórek w tej pożywce, aż wykażą one typową morfologię ludzkich komórek ES. Poszukuj małych, zwartych kolonii w kształcie kopułek o ostrych krawędziach.Kolonie powinny być jednorodne i charakteryzować się wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy. Na tym etapie uzyskano kolonie o morfologii komórek ES, ale czy wykazują one również ekspresję genów charakterystycznych dla komórek ES? Aby to sprawdzić, należy przeprowadzić barwienie kolonii na markery pluripotencji, takie jak TRA 180, TRA 1 60, SSEA 4, SSEA 3, T 4, sox 2, nanog oraz SSEA 1. W celu rozpoczęcia procedury należy delikatnie przemyć komórki trzykrotnie przy użyciu PBS.Następnie utrwal komórki, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu lub innego utrwalacza, i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach przemyj komórki trzykrotnie buforem PBS, aby usunąć nadmiar utrwalacza. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 500 µL buforu blokującego na każdą studzinkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po etapie blokowania dodaj do każdej studzinki 250 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym w stosunku 1:100.Następnie komórki inkubuje się z przeciwciałem pierwotnym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia komórki przemywa się trzykrotnie roztworem PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwotne. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z 250 µL przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu 1:300 w buforze blokującym, chroniąc próbki przed światłem, aby uniknąć fotobielenia po inkubacji z przeciwciałem wtórnym.Przemyj komórki trzykrotnie PBS-em aż do trzeciego płukania. Dodaj DPI w stężeniu 1 µg/mL w celu zabarwienia jąder komórkowych. Na koniec przeanalizuj ekspresję genów w swoich komórkach IPS.Wyniki morfologiczne pod mikroskopem ludzkich fibroblastów skóry, które zostały współprzetransdukowane czynnikami Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Zmiany morfologiczne zaobserwowano już w czwartym dniu po transdukcji, a skupiska komórek stały się bardziej zwarte w 17. dniu. Ekspresja markerów pluripotencji. Aby dalej scharakteryzować wyizolowane kolonie iPS, zbadano obecność wspólnych markerów pluripotencji eksprymowanych w komórkach ES. Kolonie wykazały silną aktywność fosfatazy alkalicznej.Dodatkowo, w koloniach komórek IPS przeprowadzono analizę immunochemiczną lub ICC z zastosowaniem panelu przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, obejmującego markery powierzchniowe TA 180 1 TRA one 60 SSEA four i SS EEA three, a także markery jądrowe: T four, SOX two i Nanog. Izolowane kolonie IPS były dodatnie w odniesieniu do wszystkich markerów. Wyniki ICC wykazują, że komórki IPS prezentowały odpowiedni wzorzec ekspresji markerów pluripotencji, co dowodzi, że komórki IPS te ściśle przypominają niezdiferencjowane ludzkie komórki E es.Właśnie pokazaliśmy, jak generować komórki iPS poprzez reprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą genów macierzystych. Zestaw lentiwirusowy czynników reprogramujących człowieka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uwzględnienie kilku czynników.Po pierwsze, stosunek aktywnego wirusa do komórek docelowych może wymagać modyfikacji podczas głównego etapu transdukcji w celu osiągnięcia optymalnej wydajności transdukcji. Po drugie, wpływ mogą mieć warunki hodowli komórek docelowych. Zdrowe i proliferujące komórki są bardziej podatne na przeprogramowanie.Po trzecie, przy modyfikowaniu protokołu dla różnych liczb komórek zaleca się, aby docelowa liczba komórek była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni płytki hodowlanej. Na koniec, w celu zapewnienia pomyślnego przeprogramowania, należy rozważyć zastosowanie inhibitorów ROCK, takich jak Y 2 7 6 3 2, ponieważ niedawne badania wykazały ich skuteczność w zwiększaniu przeżywalności kolonii ludzkich iPS. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-reprogramming-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie ludzkich fibroblastów z zestawem lentiwirusów Stemgent Human TF

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich fibroblastów przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Protokół ten umożliwia badanie procesu przeprogramowania i zastosowania w medycynie regeneracyjnej.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu Stemgent Human TF Lentivirus (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Przeglądaj więcej filmów