Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu Stemgent Human TF Lentivirus

Cześć, nazywam się Brad Hamilton. Jestem naukowcem w dziale badań i rozwoju w STEM Gen. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę przeprogramowania ludzkich fibroblastów za pomocą lentiwirusowych czynników przeprogramowujących.

Procedura ta może być wykorzystana zarówno do generowania komórek IPS, jak i badania procesu przeprogramowywania. Komórki IPS są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji i zdolności do różnicowania oraz do wszystkich typów tkanek ciała. Ludzkie komórki IPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES bez dylematu etycznego polegającego na zniszczeniu zarodka w celu uzyskania komórek.

Generowanie specyficznych dla pacjenta komórek IPS pozwala ominąć ważną przeszkodę na drodze do spersonalizowanych terapii medycyny regeneracyjnej, eliminując możliwość odrzucenia immunologicznego przeszczepionych komórek nieautologicznych. Więc zacznijmy. W kilku momentach tego protokołu zastępujesz pożywkę rozwijających się IPSC lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pożywką kondycjonowaną metamfetaminą.

Przygotowanie tego podłoża zajmuje sześć dni. Zacznij więc co najmniej tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby rozpocząć, wysiewaj każdą studzienkę szóstki.

Dobrze płytka z dwoma razy 10 do piątego cf jedna komórka podająca metamfetaminę w dwóch mililitrach wzrostu metamfetaminy. Pożywkę inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zmień pożywkę na ludzką hodowlę komórkową E-S-I-P-S.

Pożywkę inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zebrać sklarowany osad i zastąpić go świeżą pożywką co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 mikrometra.

Uzupełnij pobrany supernatant o 15 nanogramów na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów BFGF. Skończysz z około 16 mililitrami pożywki kondycjonowanej metamfetaminą, przechowuj każdy dzień zebrany supernatant oddzielnie w czterech stopniach SIU. Pożywka kondycjonowana metamfetaminą może być przechowywana przez jeden do dwóch tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez kilka miesięcy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Teraz, gdy masz pewność, że twoje podłoże kondycjonowane metamfetaminą będzie gotowe, kiedy będziesz go potrzebować, porozmawiajmy o przygotowaniu komórek. Pierwszym zadaniem w generowaniu IPSC jest wykorzystanie lentiwirusów do transdukcji ludzkich komórek fibroblastów napletka lub komórek BJ z czterema transkrypcjami charakterystycznymi dla komórek macierzystych. Aby przygotować się do transdukcji, zasiewaj komórki BJ o gęstości od jednego razy 10 do piątego dołka na dołek sześciodołkowej płytki i hodowli.

Komórki w dwóch mililitrach wzrostu, pożywka przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla tego samego dnia. Rozpocznij przygotowywanie płytek z metamfetaminą, dodając dwa mililitry 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do sześciodołkowej płytki i inkubując przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Żelatyna powleka studzienki i służy jako matryca dla nich.

Teraz komórki BJ są gotowe do transdukcji lentiwirusa, aby przygotować wirusa do transdukcji. Uzupełnij dwa mililitry świeżej pożywki sześcioma mikrogramami na mililitr poli mózgu i czterema lentiwirusami, z których każdy wyraża jeden z ludzkich czynników transkrypcyjnych. T cztery, SO dwa nanog i lin 28, takie, że każdy z nich jest przy tej samej wielokrotności infekcji lub MOI.

Wszystkie te lentiwirusy są zawarte w zestawie lentiwirusów czynnika przeprogramowującego człowieka. Aby przeprowadzić transdukcję, po prostu zastąp pożywkę wzrostu komórek BJ pożywką zawierającą wirusa. Delikatnie kołysz płytką, aby podłoże równomiernie pokryło dno.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla tego samego dnia. Wyjmij jedną fiolkę z jednym ogniwem podającym metamfetaminę z ciekłego azotu i rozmroź. Usuń roztwór żelatyny z płytek podajnika metamfetaminy, które są teraz pokryte żelatyną na każdej.

Cóż, dodaj 0,2 razy 10 do piątych komórek w dwóch mililitrach wzrostu metamfetaminy. Średni. Inkubuj MES przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia odłącz komórki BJ z 0,05% trypsyny EDTA i odwiruj w temperaturze 200 G przez pięć minut.

Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej. Usuń pożywkę z płytki podajnika metamfetaminy i dodaj dwa mililitry na dołek zawiesiny komórek BJ. Stężenie komórek BJ powinno wynosić około pięć razy 10 do czwartej komórki na studzienkę.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. 24 godziny po wycofaniu się komórek BJ na płytce podającej metamfetaminę zastąp pożywkę ludzkim E-S-I-P-S, czyli embrionalną hodowlą komórek macierzystych lub indukowaną pluripotencjalną hodowlą komórek macierzystych. Średni. Kontynuuj zmianę podłoża co 24 godziny przez siedem dni.

Siódmego dnia zastąp pożywkę do hodowli komórek ES dwoma mililitrami pożywki kondycjonowanej metamfetaminą. Ogniwa podające metamfetaminę dostarczają rozpuszczalnych czynników potrzebnych do wzrostu komórek IPS. Ale teraz musimy dodać więcej tych czynników, aby utrzymać kulturę w zdrowiu.

Pożywka kondycjonowana metamfetaminą zawiera wszystkie rozpuszczalne czynniki wydzielane przez komórki karmiące metamfetaminę inkubowane przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Patrząc przez lunetę, wybierz kolonię komórek. Wyróżnia się małym, zwartym wyglądem przypominającym kopułę na świeżej 24-dołkowej płytce, którą poprzedziłeś 24 godziny wcześniej ccf, komórki karmiące metamfetaminę cofają wybraną kolonię w ludzkiej hodowli E-S-I-P-S.

Pożywka uzupełniona 10 mikromolową cząsteczką łodygi Y 2 7 6 3 2. Zależny inhibitor kinazy. Zmieniaj pożywkę hodowlaną bez suplementacji cząsteczką łodygi Y 2, 7, 6, 3, 2 co 24 godziny przez pierwsze siedem dni.

Po siedmiu dniach zmień podłoże na metamfetaminę. Warunek do pożywki kontynuuje przechodzenie komórek, aż wykażą typową morfologię ludzkich komórek ES. Szukaj małych, zwartych kolonii przypominających kopułę, które mają ostrą krawędź.

Kolonie powinny być jednorodne i mieć wysoki stosunek jądra do cytoplazmy. W tym momencie rozwinąłeś kolonie, które mają morfologię komórek ES, ale czy wyrażają również geny charakterystyczne dla komórek ES? Aby dowiedzieć się, zabarwić kolonie pod kątem markerów pluripotencji, takich jak TRA 180 1 TRA jeden 60 SSEA cztery s, SE, trzy T cztery sox, dwa nanog i SSEA jeden Aby rozpocząć delikatne mycie komórek trzy razy za pomocą PBS.

Następnie utrwal komórki za pomocą 500 mikrolitrów 4% paraformu, aldehydu lub innego utrwalacza przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach umyj komórki PB S3 jeszcze raz, aby usunąć nadmiar utrwalacza. Następnie blokuj niespecyficzne wiązanie przez inkubację komórek w 500 mikrolitrach buforu blokującego na studzienkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej Po etapie blokowania dodaj do każdego 250 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego jeden do 100 w buforze blokującym.

Dobrze inkubuj komórki w pierwotnym przeciwciałie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia. Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe. Inkubować komórki z 250 mikrolitrami przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego od jednego do 300 i buforować blokując na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając z dala od światła, aby uniknąć fotowybielania po inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym.

Umyj komórki trzy razy PBS do trzeciego prania. Dodaj DPI w ilości jednego mikrograma na mililitr, aby zabarwić jądra. Na koniec przeanalizuj ekspresję genów w swoich komórkach IPS.

Pod mikroskopem wyniki morfologii czterech ludzkich komórek fibry skóry, w których COT transdukowane za pomocą T, czterech, SOX, dwóch nanog i lin 28, zmian morfologicznych zaobserwowano już w czwartym dniu po transdukcji, a skupisko komórek stało się ściślej upakowane w 17 dniu ekspresji markerów siły plurry. Aby dokładniej scharakteryzować izolowane kolonie komórek IPS, szukaliśmy obecności wspólnych markerów pluripotencji ulegających ekspresji w komórkach ES. Kolonie wykazywały silną aktywność fosfatazy alkalicznej.

Dodatkowo przeprowadzono immunochemię lub ICC na koloniach komórek IPS z panelem przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, w tym markerów powierzchniowych TA 180 1 TRA 1 60 SSEA cztery i SS EEA trzy, a także markerów jądrowych, T cztery, SOX dwa i Nanog. Izolowane kolonie IPS były dodatnie dla wszystkich markerów. Wyniki ICC pokazują, że komórki IPS wykazywały odpowiedni wzorzec ekspresji markera pluripotencji, co pokazuje, że te komórki IPS bardzo przypominają niezróżnicowane ludzkie komórki ES.

Właśnie pokazaliśmy, jak generować komórki IPS poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą genów macierzystych. Zestaw lentiwirusa czynnika przeprogramowującego człowieka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wziąć pod uwagę kilka czynników.

Po pierwsze, może być konieczna modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do celu na etapie pierwotnej transdukcji, aby osiągnąć optymalną wydajność transdukcji. Po drugie, może mieć wpływ na warunki wzrostu komórek docelowych. Przeprogramowanie zdrowych i proliferacyjnych komórek jest bardziej podatne na przeprogramowanie.

Po trzecie, podczas modyfikowania protokołu dla różnych numerów komórek, zaleca się, aby docelowe liczby komórek były dostosowane proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego. Wreszcie, należy rozważyć zastosowanie inhibitorów skał, takich jak Y 2 7 6 3 2, aby zapewnić skuteczne przeprogramowanie, ponieważ ostatnie badania wykazały ich przydatność w zwiększaniu przeżywalności ludzkich kolonii tak. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.