Name: Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych in vivo przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj protokół mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach bakteryjnych. Ta metoda umożliwia wykrywanie, śledzenie i ilościowe określanie funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za przekazanie szczepów bakteryjnych przez grupy prof. Judith Armitage (University of Oxford, UK) oraz prof. Conrada Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD jest wspólnie finansowany przez Dept of Biochemistry (Oxford University) oraz OCISB; AR otrzymuje finansowanie w ramach stypendium doktoranckiego DTC z Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC); ND jest finansowany przez Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC); MCL jest finansowany w ramach Royal Society University Research Fellowship.

<ol>
<li>Aby rozpocząć tę procedurę, 50 μl zamrożonych zapasów komórek bakteryjnych Escherichia coli ekspresujących białka fluorescencyjne należy najpierw rozmrozić i hodować tlenowo z wytrząsaniem w 5 ml pożywki LB przez noc w temperaturze 37 °C. Rano 50 μl tej nasyconej kultury należy pobrać i przesiać do minimalnej pożywki M63 z glukozą, inkubując w temperaturze 30 °C przez 4 do 6 godzin. W tym przypadku demonstrujemy użycie dwóch różnych szczepów komórek, z których jeden ekspresuje cytochrom transportujący elektrony połączony z GFP, a drugi białko zaangażowane w bakteryjny silnik wiciowy połączone z GFP.</li>
<li>Komórki można zebrać bezpośrednio z rosnącej subkultury, jeśli mają być badane jako próbki unieruchomione, lub można je poddać ścinaniu w celu skrócenia wici bakteryjnych, jeśli mają być badane w warunkach „przypięcia” (tethered).</li>
<li>Ścinanie polega na umieszczeniu zazwyczaj 1-5 ml subkultury w urządzeniu składającym się z dwóch sterylnych strzykawek połączonych sterylnym przewodem. Ścinanie odbywa się poprzez naprzemienne naciskanie tłoków każdej strzykawki, aby przepchnąć kulturę przez wąską rurkę. Czynność tę wykonuje się 50-100 razy, w zależności od wymaganego stopnia ścinania. Następnie kulturę wiruje się w celu osadzenia komórek, które następnie zawiesza się ponownie w pożywce minimalnej w celu usunięcia fragmentów wici.</li>
<li>Przygotowujemy oczyszczone szkiełka nakrywkowe BK7 poprzez zanurzenie ich w nasyconym roztworze KOH w etanolu na 20 min, a następnie dokładne wypłukanie w wodzie dejonizowanej i etanolu oraz pozostawienie do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 1 h.</li>
<li>Konstruujemy prostą komorę przepływową (flow-cell), aby umieścić komórki w mikroskopie. Polega to na narysowaniu linii z parafiny na szkiełku mikroskopowym BK7, a następnie stworzeniu „tunelu-kanapki” poprzez nałożenie na górze jednej z oczyszczonych nakrywek i delikatne dociśnięcie jej pęsetą, co daje objętość komory przepływowej wynoszącą 5-10 μl.</li>
<li>Aby obserwować komórki unieruchomione, wypełniamy komorę przepływową poprzez iniekcję 0,1% w/v roztworem poli-L-lizyny i inkubujemy w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 min. Następnie wypłukujemy komorę, używając 100 μl pożywki minimalnej, wstrzykując pożywkę z jednego końca komory przepływowej i odsączając ją papierem tkankowym z drugiego końca.</li>
<li>Następnie odsączamy 20 μl rozcieńczenia 1:500 mikrosfer lateksowych o średnicy 200 nm (Polysciences) w pożywce minimalnej, aby oznakować powierzchnię nakrywki. Komorę przepływową odwraca się tak, aby nakrywka była skierowana w dół, umieszcza na platformie oddalonej od powierzchni w prostej komorze wilgotnościowej i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 min. Niezwiązane koraliki są następnie usuwane poprzez odsączanie 100 μl pożywki minimalnej.</li>
<li>Jeśli chcemy obserwować komórki przypięte, pomijamy etap z poli-L-lizyną, a zamiast tego wypełniamy komorę przepływową przeciwciałem antyflagellinowym w stężeniu 5 mg/ml. Komorę przepływową umieszcza się w komorze wilgotnościowej na 10 min, a następnie wypłukuje poprzez odsączanie.</li>
<li>Następnie przez komorę przepływową odsącza się 20 μl kultury komórkowej, używając próbki ściętej w przypadku obserwacji komórek przypiętych lub próbki nieściętej przy obserwacji komórek unieruchomionych.</li>
<li>Komorę przepływową odwraca się i umieszcza w komorze wilgotnościowej na 20 min. Niezwiązane komórki są następnie wypłukiwane poprzez odsączanie 100 μl pożywki minimalnej.</li>
<li>Kroplę olejku immersyjnego umieszcza się w centrum górnej powierzchni nakrywki, a następnie komorę przepływową delikatnie kładzie się na uchwycie próbek specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego, zapewniając kontakt optyczny z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej.</li>
<li>Włącza się kamerę z mnożeniem elektronów w mikroskopie i ustawia chłodzenie kamery na -70 °C. Oprogramowanie ustawia się na akwizycję obrazów przy typowej częstotliwości klatek 25 Hz w trybie transferu klatek, początkowo wyłączając kontrolę wzmocnienia w kamerze.</li>
<li>Włącza się oświetlenie w polu jasnym i ustawia ostrość obrazu, wybierając odpowiednią komórkę lub grupę komórek do obrazowania na podstawie tego, czy są one przytwierdzone z osią długą równolegle do powierzchni nakrywki. Ostrość jest precyzyjnie regulowana, aby upewnić się, że koraliki lateksowe 200 nm przytwierdzone do powierzchni nakrywki są dokładnie w ostrości.</li>
<li>Sekwencja obrazów jest pozyskiwana w polu jasnym, aby zarejestrować obrys ciała komórki. Oświetlenie w polu jasnym zostaje wyłączone, a wzmocnienie kamery ustawione na maksimum.</li>
<li>W przypadku standardowej akwizycji z wykorzystaniem fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (lub TIRF), wiązka lasera o odpowiedniej długości fali (tutaj, do wzbudzenia zielonego białka fluorescencyjnego używamy lasera 473 nm) jest wstępnie ustawiona tak, aby była ogniskowana w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, ale przesunięta bocznie z osi optycznej, aby wygenerować pole ewanescentne do wzbudzenia fluorescencji w próbce komórkowej.</li>
<li>Uruchamia się akwizycję kamery i otwiera migawkę lasera, aby wzbudzić białka fluorescencyjne wewnątrz bakterii. Parametry natężenia lasera i szybkości akwizycji muszą zostać zoptymalizowane dla konkretnego badanego systemu biologicznego poprzez eksperymentowanie z różnymi wartościami, ale typowy zakres istotny dla badania mobilnych kompleksów białkowych w błonie komórkowej to moc lasera 1-10 mW w okrągłym obszarze wzbudzenia o średnicy ~30 μm, z czasem ekspozycji na klatkę od 5-40 ms. Próbki są naświetlane aż do fotowyblaknięcia, zazwyczaj przez ~10 s.</li>
<li>Ten protokół może być stosowany zarówno dla komórek przypiętych, w których ciało komórki obraca się wokół punktu przyczepienia między nakrywką a kikutem wici, jak i dla komórek unieruchomionych, które są sztywno przymocowane do powierzchni nakrywki.</li>
<li>Niektóre szczepy komórek o wysokiej liczbie kopii kompleksów zyskują na wstępnym, ograniczonym dyfrakcyjnie wyblaknięciu laserowym jednego bieguna komórki przed obrazowaniem TIRF. Wyblaknięcie to jest równoważne z tym stosowanym w metodzie powrotu fluorescencji po fotowyblaknięciu (lub FRAP). W naszym specjalistycznym mikroskopie część światła lasera wzbudzającego może być odprowadzona do drugiej niezależnej ścieżki używanej do wyblaknięcia typu FRAP. Zazwyczaj stosuje się moc lasera 1-10 mW, a typowy czas wyblaknięcia mieści się w zakresie 10-300 ms. Skutkuje to znacznie wyższym kontrastem obrazowania w strefie wyblakłej komórki, co pozwala na łatwiejszą wizualizację pojedynczych kompleksów, które następnie dyfundują do tego obszaru.</li>
<li>Do wizualizacji kompleksów w cytoplazmie komórki, które dyfundują znacznie szybciej niż te w błonie komórkowej, stosuje się inny tryb oświetlenia zwany „slimfield”. Tutaj skupiona wiązka lasera jest rozszerzana bocznie tak, aby objąć tylko jedną komórkę. Tworzy to bardzo intensywne pole, pozwalające na wykonywanie znacznie krótszych ekspozycji, zazwyczaj rzędu milisekundy.</li>
<li>Po akwizycji danych obrazy są przesyłane do specjalnie napisanego oprogramowania (zakodowanego w LabVIEW 8.5). Automatycznie wykrywa ono pozycje fluorescencyjnych plamek w komórkach z precyzją zazwyczaj kilku nanometrów i wyodrębnia ich rozmiar oraz jasność. Jasność śladu fotowyblaknięcia w funkcji czasu śledzonego kompleksu molekularnego jest następnie wykorzystywana do oszacowania stechiometrii, tzn. ile pojedynczych białek fluorescencyjnych tworzy pojedynczy kompleks molekularny.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu obrazy komórek obserwowane w polu jasnym są bardzo wyraźne, z ciemnymi obrysami ciał komórkowych na tle białego/szarego wnętrza (Rycina 1a). W przypadku fluorescencji z wykorzystaniem unieruchomionych komórek widoczne są wyraźne punkty intensywności, zazwyczaj o szerokości 250-300 nm (Rycina 1b). Zdrowe, przytwierdzone komórki będą obracać się wokół punktu przytwierdzenia na obrazach w polu jasnym. Pod wpływem wzbudzenia fluorescencyjnego w punkcie przytwierdzenia mogą być widoczne niektóre kompleksy molekularne, co w naszym przypadku wskazuje na lokalizację znakowanego białka w obrębie silnika wiciowego. Punkty te są pojedynczymi kompleksami molekularnymi, a ich liczba zależy od zastosowanego trybu oświetlenia oraz od tego, ile kompleksów znajduje się w komórce w danym momencie. Mobilność punktów zależy od badanego specyficznego układu biologicznego. Jeśli początkowa gęstość punktów jest bardzo wysoka, co ma miejsce w przypadku zastosowanych tutaj znakowanych cytochromów, przeprowadzenie wstępnego wybielania FRAP może poprawić kontrast obrazowania.
<img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek bakteryjnych; A: obraz w kontraście fazowym, B: analiza emisji fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. (A) Obraz w polu jasnym oraz (B) obraz TIRF (fałszywe kolory) unieruchomionej komórki Escherichia coli wykazującej ekspresję białka połączonego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), które jest znane z udziału w pracy silniczków wiciowych bakterii. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć większą wersję ryciny 1.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Należy uważać, aby nie doprowadzić do zbyt silnego ścinania komórek podczas obserwacji bakterii przytwierdzonych do podłoża, ponieważ może to upośledzić funkcjonalność silniczków flagellarnych. Ważne jest, aby nie używać komórek dłużej niż przez godzinę po umieszczeniu ich na preparacie mikroskopowym, gdyż może dojść do wyczerpania zapasów tlenu. Może być wymagana znaczna optymalizacja w celu znalezienia najlepszych warunków obrazowania mikroskopowego dostosowanych do konkretnego badanego systemu biologicznego. Wskazane ...

wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych in vivo wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Pełny wgląd w mechanizmy działania żywych komórek można uzyskać jedynie poprzez badanie kluczowych procesów, które wywołują i kierują zdarzeniami na poziomie komórkowym. Do tej pory ogromna złożoność systemów biologicznych sprawiała, że precyzyjne eksperymenty na poziomie pojedynczych cząsteczek były zbyt wymagające, co prowadziło do koncentrowania się na badaniach pojedynczych układów z wykorzystaniem stosunkowo mało precyzyjnych pomiarów uśrednionych dla całej populacji (bulk ensemble-average measurements). Jednak wiele istotnych procesów w żywej komórce zachodzi na poziomie zaledwie jednej lub kilku cząsteczek; pomiary populacyjne zazwyczaj maskują stochastyczny i heterogeniczny charakter tych zdarzeń. W niniejszej pracy, wykorzystując zaawansowaną mikroskopię optyczną oraz analityczne narzędzia analizy obrazu, demonstrujemy sposób monitorowania białek w pojedynczej żywej komórce bakteryjnej z precyzją na poziomie pojedynczych cząsteczek, a także sposób obserwacji dynamiki w obrębie kompleksów molekularnych w funkcjonujących maszynach biologicznych. Zastosowane techniki mają bezpośrednie znaczenie fizjologiczne. Są one minimalnie perturbujące i nieinwazyjne dla badanej próbki biologicznej oraz w pełni dostosowane do badań materiału żywego, co nie jest łatwo dostępne w innych biofizycznych podejściach do badania pojedynczych cząsteczek. Ponadto wszystkie badane preparaty biologiczne produkują białko znakowane fluorescencyjnie na poziomach niemal identycznych z tymi w niemodyfikowanych szczepach komórkowych („kodowanie genomiczne”), w przeciwieństwie do częściej stosowanego, lecz mniej idealnego podejścia polegającego na generowaniu znacznie większej ilości białka niż występuje to naturalnie („ekspresja plazmidowa”). Dzięki temu badane próbki biologiczne są znacznie bliższe naturalnym organizmom, a tym samym obserwacje są bardziej istotne dla rzeczywistych procesów fizjologicznych.

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Pełne zrozumienie mechanizmów działania żywych komórek można osiągnąć jedynie poprzez badanie kluczowych procesów, które wywołują i kierują zdarzeniami na poziomie komórkowym...

W niniejszym materiale prezentujemy protokół przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach bakteryjnych, umożliwiający wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych. Protokół rozpoczyna się od hodowli bakterii, które syntetyzują białko znakowane cząsteczką barwnika fluorescencyjnego. Po czterech do sześciu godzinach z hodowli pobierana jest niewielka objętość komórek, a ich włókna flagellarne są skracane poprzez ścinanie.Szklana lamelka wewnątrz komory przepływowej jest powlekana, aby umożliwić przyleganie komórek do powierzchni. Komórki są wstrzykiwane do komory przepływowej i przytwierdzane za pomocą żelowego słupka, który jest obrazowany w fluorescencji przy użyciu mikroskopii z wzbudzeniem laserowym. Kamera o wysokiej wydajności kwantowej rejestruje następnie jasne obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencyjne znakowanych kompleksów molekularnych.Witajcie, nazywam się Ian Doy i pracuję z Markiem Lee w Departamencie Biochemii na Uniwersytecie Oksfordzkim. Jestem Alex Robertson i pracuję z Markiem Lee w departamencie fizyki. Jestem Nick De z laboratorium leak, również działającego przy departamencie fizyki.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji pojedynczych kompleksów molekularnych w żywych bakteriach przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Stosujemy tę procedurę, aby badać je w stanie funkcjonalnym. Wykorzystujemy ją również do badania dynamiki naturalnych maszyn biologicznych w czasie rzeczywistym w skali nanometrycznej.Zacznijmy zatem. Na początek rozmroź 50 µL zamrożonych szczepów bakterii e coli. Zostały one zmodyfikowane genetycznie.Aby oznakować białko cząsteczką barwnika fluorescencyjnego, zaszczepić pięć mililitrów pożywki wzrostowej LB i hodować bakterie tlenowo w wytrząsarkach przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia pobrać 50 µL nasyconej kultury i przenieść ją do minimalnej pożywki M 63 z glukozą, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez cztery do sześciu godzin. W tym przypadku zastosowano dwa różne szczepy komórkowe.Jeden z nich wykazuje ekspresję cytochromu transportującego elektrony połączonego z GFP. Drugi wykazuje ekspresję białka zaangażowanego w pracę bakteryjnego silnika wiciowego. Komórki połączone z GFP mogą być zbierane bezpośrednio z rosnącej subkultury, jeśli mają być obserwowane jako próbki unieruchomione, lub mogą zostać poddane ścinaniu w celu skrócenia wici bakteryjnych, jeśli są obserwowane w warunkach przytwierdzonych.Aby poddać bakterie ścinaniu, przenieś od 1 do 5 ml subkultury do urządzenia składającego się z dwóch sterylnych strzykawek za pomocą sterylnego pipetowania. Naprzemiennie naciskaj tłoki obu strzykawek, aby przepchnąć kulturę przez wąską rurkę około 50–100 razy, zależnie od uzyskanego stopnia ścinania. Następnie odwiruj kulturę w wirówce, aby uzyskać osad komórkowy, a potem resuspenduj komórki w minimalnym medium, aby usunąć fragmenty wici. Po przygotowaniu komórek przygotuj czyste szkiełka przedmiotowe BK7, zanurzając je w nasyconym roztworze wodorotlenku potasu i etanolu przez 20 minut.Dokładnie wypłucz w wodzie dejonizowanej i etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej jedną godzinę. Następnie skonstruuj prostą komorę przepływową, aby umieścić komórki w mikroskopie. W tym celu nanieś linie z wazeliny parafinerowej na szkiełko przedmiotowe z szkła BK7, a następnie stwórz konstrukcję typu kanapka, nakładając na górze jedno z oczyszczonych szkiełek nakrywkowych.Naciśnij delikatnie pęsetą. Powinno to zapewnić objętość komory przepływowej od 5 do 10 µL. Aby zaobserwować unieruchomione komórki, wypełnij komorę przepływową, wstrzykując 0,1% roztwór poli-L-lizyny, i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną minutę.Następnie przepłukano komorę przepływową, wstrzykując 100 µL minimalnego medium z jednego końca komory i jednocześnie odsączając medium z drugiego końca za pomocą ręcznika papierowego. Po tym procesie odsączono 20 µL rozcieńczenia 1:500 mikrosfer lateksowych o średnicy 200 nm w minimalnym medium, aby oznaczyć powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Komorę przepływową umieszczono w prostej komorze wilgotnościowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Komorę przepływową odwrócono tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w dół.Niewiązane kuleczki są następnie wypłukiwane poprzez odsączanie 100 µL minimalnego medium za pomocą ręcznika papierowego. Aby zaobserwować przytwierdzone komórki, należy pominąć etap inkubacji z poli-L-lizyną, zamiast tego wypełnić komorę przepływową roztworem przeciwciał Anti-Flag gellan w stężeniu 5 µg/mL, a następnie umieścić ją w komorze wilgotnościowej na 10 minut. Po inkubacji należy przepłukać komorę przepływową, odsączając jej zawartość ręcznikiem papierowym.Następnie, za pomocą papierowego ręcznika, wciągnij 20 µL hodowli komórkowej do komory przepływowej, wykorzystując próbkę poddaną ścinaniu w celu obserwacji komórek przytwierdzonych lub próbkę niepoddaną ścinaniu w celu obserwacji komórek unieruchomionych; komorę przepływową należy odwrócić i umieścić w komorze wilgotnościowej na 20 minut. Niewiążące się komórki są następnie wypłukiwane poprzez wciągnięcie 100 µL minimalnego medium. Na środku górnej powierzchni szkiełka nakrywkowe nałóż kroplę olejku imersyjnego.Ostrożnie umieść celę przepływową na uchwycie do próbek specjalnie skonstruowanego mikroskopu fluorescencyjnego. Powinno to zapewnić kontakt optyczny z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej. Następnie włącz kamerę z mnożeniem elektronów mikroskopu i ustaw chłodzenie kamery na -70 °C.Oprogramowanie jest ustawione na rejestrację obrazów z typową częstotliwością klatek 25 hertz. W trybie transferu klatek. Włącz oświetlenie w polu jasnym i ustaw ostrość obrazu.Wybierz odpowiednią komórkę lub grupę komórek do obrazowania na podstawie tego, czy są one przytwierdzone wzdłuż swojej długiej osi. Równolegle do powierzchni szkiełka podstawowego wyreguluj ostrość tak, aby 200 nanometer lateksowe kuleczki przytwierdzone do powierzchni szkiełka były dokładnie w ogniskowej. Pozyskaj sekwencję obrazów w polu jasnym, aby zarejestrować obrys ciała komórki.Następnie wyłącza się oświetlenie w jasnym polu i ustawia maksymalną wzmocnienie kamery w celu obrazowania z wykorzystaniem całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji, znanego również jako TIRF. Należy rozpocząć akwizycję obrazu i otworzyć migawkę lasera, aby wzbudzić białka fluorescencyjne wewnątrz bakterii. Parametry intensywności lasera oraz prędkości akwizycji muszą zostać zoptymalizowane dla danego systemu biologicznego.Próbki poddane badaniu są naświetlane aż do momentu fotowybielenia, co zazwyczaj trwa około 10 sekund. Po zebraniu danych obrazy są wprowadzane do specjalnie napisanego programu analitycznego, który automatycznie wykrywa pozycje fluorescencyjnych punktów w komórkach z precyzją do kilku nanometrów i wyodrębnia ich wielkość oraz jasność. Jasność krzywej fotowybielenia w funkcji czasu dla kompleksu molekularnego jest następnie wykorzystywana do oszacowania stechiometrii.Stosując tę metodę, obraz komórek obserwowany w jasnym polu jest bardzo wyraźny, tak że obrysy ciał komórkowych są ciemne na tle biało-szarego ciała komórki przy zastosowaniu fluorescencji z unieruchomionymi komórkami. Widoczne są tutaj w sztucznych kolorach wyraźne punkty o intensywności, których szerokość wynosi zazwyczaj od 250 do 300 nanometrów. W obrazach w jasnym polu pod wpływem wzbudzenia fluorescencyjnego można zaobserwować zdrowe, przytwierdzone komórki rotujące wokół punktu przytwierdzenia.W punkcie przyczepienia można również dostrzec niektóre kompleksy molekularne, co wskazuje na lokalizację białka transportowanego wraz z motorem Geller. Punkty te stanowią poszczególne kompleksy molekularne. Liczba widocznych kompleksów zależy od zastosowanego trybu oświetlenia oraz od tego, ile takich kompleksów znajduje się w danej chwili w komórce.Jeśli początkowa gęstość plamek jest bardzo wysoka, jak ma to miejsce w przypadku użytych tutaj znakowanych cytochromów, wykonanie wstępnego wybielania metodą FRAP może poprawić kontrast obrazowania. Mobilność plamek zależy od konkretnego układu biologicznego. W ramach badania pokazaliśmy właśnie, jak wizualizować pojedyncze kompleksy molekularne przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie dopuścić do ścinania komórek, ponieważ może to upośledzić funkcjonalność silnika wici. Należy również pamiętać, aby nie pozostawiać komórek na szkiełkach mikroskopowych przez więcej niż godzinę, gdyż mogą one ulec niedotlenieniu. W celu znalezienia optymalnych warunków obrazowania wymagana jest automatyzacja.Użycie samego oczyszczonego GFP może pomóc w ustaleniu prawidłowej mocy lasera dla konkretnego systemu mikroskopowego. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w eksperymentach.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizowanie pojedynczych kompleksów cząsteczkowych in vivo za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Poznaj protokół mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach bakteryjnych. Ta metoda umożliwia wykrywanie, śledzenie i ilościowe określanie funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów