Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych in vivo przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj demonstrujemy protokół wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, aby umożliwić wykrywanie, śledzenie i ilościowe określanie funkcjonalnych kompleksów molekularnych. Protokół ten rozpoczyna się od hodowli bakterii, które wytwarzają białko znakowane cząsteczką barwnika fluorescencyjnego. Po czterech do sześciu godzinach z hodowli ekstrahuje się niewielką objętość komórek, a ich włókna wici są obcinane przez ścinanie.

Szklana szkiełko pokrywowe wewnątrz komory przepływowej jest powlekane, aby umożliwić komórkom przyleganie do powierzchni. Komórki są wstrzykiwane do komory przepływowej i wiązane za pomocą żelowego kikuta, który jest oglądany we fluorescencji za pomocą laserowej mikroskopii wzbudzenia. Kamera o wysokiej wydajności kwantowej rejestruje następnie jasne pole i obrazy fluorescencyjne oznaczonych kompleksów molekularnych.

Cześć, nazywam się Ian Doy i pracuję z Markiem Lee na Wydziale Biochemii Uniwersytetu Oksfordzkiego. Nazywam się Alex Robertson i pracuję z Markiem Lee na wydziale fizyki. Nazywam się Nick De i pracuję w laboratorium zajmującym się wyciekami, również pracuję na wydziale fizyki.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wizualizacji pojedynczych kompleksów molekularnych u żywych bakterii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Używamy tej procedury do Badanie, aby to zrobić w stanie funkcjonalnym. Używamy również do badania dynamiki w czasie rzeczywistym naturalnej maszyny biologicznej i nanometrowej skali soczewek.

Więc zacznijmy. Na początek rozmrozić 50 mikrolitrów zamrożonych łodyg bakterii E coli. Zostały one zmodyfikowane genetycznie.

Aby oznaczyć białko fluorescencyjną cząsteczką barwnika, zaszczepij pięć mililitrów pożywki wzrostowej LB i hoduj bakterie tlenowo, wstrząsając przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka weź 50 mikrolitrów nasyconej kultury i zahoduj ją na pożywce do hodowli glukozy o minimalnej zawartości M 63, inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin. Tutaj używane są dwa różne szczepy komórek.

Jeden z nich wyraża cytochrom transportujący elektron połączony z GFP. Drugi wyraża białko zaangażowane w silnik wici bakteryjnej. Komórki połączone z GFP mogą być albo zbierane bezpośrednio z rosnącej subkultury, jeśli mają być postrzegane jako unieruchomione próbki, albo mogą być ścinane w celu obcięcia wici bakteryjnych, jeśli są oglądane w warunkach uwięzi.

Aby ścinać bakterie, umieść od jednego do pięciu mililitrów subkultury w urządzeniu składającym się z dwóch sterylnych strzykawek za sterylnymi rurkami. Naprzemiennie wciskaj każdą pompę strzykawkową, aby przepchnąć kulturę przez wąską rurkę około 50 do 100 razy, w zależności od stopnia uzyskanego ścinania; Następnie odwiruj kulturę, aby osadzać komórki, a następnie ponownie zawieś komórki w minimalnej pożywce, aby usunąć fragmenty wici. Gdy komórki będą gotowe, przygotuj oczyszczone szkiełka nakrywkowe BK seven, zanurzając je w nasyconym roztworze wodorotlenku potasu i etanolu na 20 minut.

Dokładnie spłucz w wodzie dejonizowanej i etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na co najmniej godzinę. Następnie skonstruuj prostą komórkę przepływową, aby pomieścić komórki w mikroskopie. W tym celu narysuj linie smaru parafinowego na szkiełku mikroskopowym BK seven, a następnie utwórz kanapkę tunelową, umieszczając na wierzchu jedno z oczyszczonych szkiełek nakrywkowych.

Delikatnie dociśnij szczypcami. Powinno to dać objętość komory przepływowej od pięciu do 10 mikrolitrów. Aby obserwować unieruchomione komórki, należy wypełnić komórkę przepływową, wstrzykując 0,1% roztwór poli-L-lizyny i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną minutę.

Następnie przepłukać komórkę przepływową, wstrzykując 100 mikrolitrów minimalnej pożywki z jednego końca komory przepływowej i jednocześnie odprowadzając media przez komórkę przepływową za pomocą bibułki z drugiej strony, WIC rzucił 20 mikrolitrów rozcieńczenia jeden na 500 mikrosfer lateksowych o średnicy 200 nanometrów w minimalnym nośniku, aby oznaczyć powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Umieść komórkę przepływową w prostej komorze wilgotnościowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Komora przepływowa jest odwrócona w taki sposób, że szkiełko nakrywkowe jest skierowane w dół.

Niezwiązane kulki są następnie zmywane przez przesiąkanie przez 100 mikrolitrów minimalnej ilości podłoża za pomocą bibuły. Aby obserwować komórki na uwięzi, pomiń etap inkubacji poli-lizyny, napełnij komórkę przepływową pięcioma mikrogramami na mililitr roztworu przeciwciała gellan Anti-Flag, a następnie umieść ją w komorze wilgotnościowej na 10 minut. Po inkubacji przepłukać komórkę przepływową, przesiąkając bibułą.

Następnie WIC 20 mikrolitrów hodowli komórkowej przez komórkę przepływową za pomocą bibuły, używając ściętej próbki do obserwacji komórek na uwięzi lub nieudostępnionej próbki do oglądania unieruchomionych komórek, komórkę przepływową odwraca się i umieszcza w komorze wilgotnościowej na 20 minut. Niezwiązane komórki są następnie wypłukiwane przez przesiąkanie przez 100 mikrolitrów minimalnej ilości pożywki. Umieść kroplę olejku immersyjnego na środku górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Delikatnie umieść celę przepływową na uchwycie próbki niestandardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Powinno to nawiązać kontakt optyczny z soczewką obiektywu o dużej aperturze numerycznej. Następnie włącz kamerę zwielokrotniającą elektrony mikroskopu i ustaw kamerę na chłodzenie na minus 70 stopni Celsjusza.

Oprogramowanie jest ustawione na pobieranie obrazów z typową częstotliwością odświeżania 25 Hz. W trybie transferu klatek. Włącz oświetlenie w jasnym polu i ustaw ostrość obrazu.

Wybierz odpowiednią komórkę lub grupę komórek, które mają być zobrazowane na podstawie ich utknięcia w długiej osi. Równolegle do powierzchni szkiełka nakrywkowego wyreguluj ostrość, aby upewnić się, że kulki lateksowe o długości 200 nanometrów przyklejone do powierzchni szkiełka nakrywkowego są dokładnie ostre. Uzyskaj sekwencję obrazów w jasnym polu, aby zarejestrować kontur ciała komórki.

Oświetlenie w jasnym polu jest następnie wyłączane, a wzmocnienie kamery jest włączane do maksimum w celu obrazowania przy użyciu całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego, znanej również jako murawa. Rozpocznij akwizycję kamery i otwórz migawkę lasera, aby wzbudzić białka fluorescencyjne w bakteriach. Parametry intensywności lasera i szybkości akwizycji muszą być zoptymalizowane pod kątem konkretnego systemu biologicznego.

Badane próbki są oświetlane do momentu wybielenia fotograficznego, co zwykle trwa około 10 sekund. Po zebraniu danych obrazy są wprowadzane do niestandardowego pisemnego programu analitycznego, który automatycznie wykrywa położenie plamek fluorescencyjnych w komórkach z dokładnością do kilku nanometrów i wyodrębnia ich rozmiar i jasność. Jasność śladu wybielania fotograficznego w odniesieniu do czasu przyciągania kompleksu molekularnego jest następnie wykorzystywana do oszacowania zastosowania stechiometrii.

Dzięki tej metodzie obraz komórek oglądanych w jasnym polu jest bardzo wyraźny, tak że obwody ciał komórek są ciemne na tle białego, szarego ciała komórek za pomocą fluorescencji z unieruchomionymi komórkami. Wyraźne plamy o intensywności zwykle od 250 do 300 nanometrów szerokości można zobaczyć tutaj wyświetlane w fałszywych kolorach. Zdrowe komórki na uwięzi można zobaczyć obracające się wokół punktu przyczepu uwięzi na obrazach w jasnym polu pod wzbudzeniem fluorescencyjnym.

Niektóre kompleksy molekularne mogą być również widoczne w punkcie przyłączenia, co wskazuje na lokalizację białka w zbiorniku za pomocą silnika Gellera. Plamki te są pojedynczymi kompleksami molekularnymi. Liczba tych, które są widoczne, będzie zależeć od użytego trybu oświetlenia i od tego, ile kompleksów jest faktycznie obecnych w komórce w danym momencie.

Jeśli gęstość plam jest początkowo bardzo wysoka, jak ma to miejsce w przypadku zastosowanych tutaj znakowanych cytochromów, wówczas wykonanie wstępnego wybielania frap może poprawić kontrast obrazowania. Ruchliwość plamek zależy od konkretnego systemu biologicznego. W ramach badań właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować pojedyncze kompleksy molekularne za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie mieć ogniw ścinających, ponieważ może to pogorszyć funkcjonalność silnika flagowego. Ważne jest również, aby nie pozostawiać komórek na szkiełkach mikroskopowych na dłużej niż godzinę, ponieważ mogą one ulec wyczerpaniu tlenu. Automatyzacja jest wymagana do znalezienia najlepszych warunków obrazowania.

Pomocne może być użycie samego oczyszczonego GFP w celu ustalenia właściwej mocy lasera dla konkretnego systemu mikroskopowego. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.