Montaż, strojenie i użytkowanie bezaperturowego mikroskopu bliskiego pola w podczerwieni do obrazowania białek

Wstępny montaż zestawu optycznego kończy się ustawieniem wielomodowego mikroskopu FM i optycznego. Wyrównanie niewidzialnej wiązki podczerwieni jest łatwiejsze dzięki uprzedniemu wyrównaniu za pomocą widzialnego czerwonego lasera helowo-neonowego. Linia ciągła nakładająca się na podczerwień, linia przerywana, której celem jest obserwacja światła laserowego padającego na wierzchołek końcówki wspornika i detektor podczerwieni.

Ostateczne wyrównanie wiązki podczerwieni odbywa się poprzez regulację położenia mikroskopu optycznego, a także luster, aby uzyskać sygnał jednego F o odpowiednim kształcie, gdy uzyskany zostanie pożądany sygnał bliskiego pola. Równolegle zbierane są zdjęcia topografii FM i bliskiego pola za pomocą oprogramowania nano scope. Cześć, nazywam się profesor Gilbert Walker i pracuję na Wydziale Chemii Uniwersytetu w Toronto.

Cześć, nazywam się Melissa Paulite, również pracuję w laboratorium Gilberta Walkera. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wstępnego montażu i wyrównania listy apertury, mikroskopu skaningowego w podczerwieni bliskiego pola. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania agregatów białkowych.

Więc zacznijmy. Zanim zaczniemy opisywać montaż i regulację systemu obrazowania, przyjrzyjmy się najpierw krótkiemu przeglądowi całego systemu. Części systemu obrazowania, które opiszemy w tym filmie, obejmują stół optyczny, podstawę wielomodowego mikroskopu sił atomowych lub FM, skaner wielomodowego A FM, podwyższoną płytkę stykową prowadzącą optyczną, która odzwierciedla tubę optyczną z tęczówką i środkiem.

Zablokuj kostkę optyczną za pomocą częściowego odbłyśnika z selenku, tuby optycznej używanej do mocowania zestawu na platformie podnoszącej. Obiektyw na podczerwień, tubus optyczny do zbierania wstecznego światła rozproszonego. Sześcian z paraboloidą poza osią odbija sześcian, aby utrzymać płytkę germanową pod kątem 45 stopni.

Okular mikroskopu, otwór otworkowy zamontowany na stoliku XY, detektor podczerwieni rtęciowo-kadmowy lub MCT. Detektor podczerwieni przedwzmacniacz stopnia XY, aby przesunąć pozycję wiązki, stół podnoszący do skupienia wiązki, stopień Z do ustawienia detektora podczerwieni i stopień X do ustawienia detektora podczerwieni. Aby rozpocząć montaż zestawu optycznego, użyj lusterek strojeniowych, aby ustawić wiązkę helu neonowego równolegle do stołu optycznego.

Następnie, bez rozdzielacza wiązki w sześcianie i z wydłużoną tubą optyczną na drugim końcu sześcianu, skieruj wiązkę helu neonowego przez tęczówki przymocowane do końców rurek. Teraz wyjmij skaner i zamocuj wydłużoną tubus optyczny w miejscu obiektywu na podczerwień. Włóż częściowy odbłyśnik z selenku, aby skierować wiązkę w stronę próbki.

Powinien być zamontowany w taki sposób, aby wiązka helu neonowego padała na przednią powierzchnię reflektora w geometrycznym środku sześcianu optycznego. Obracając częściowy odbłyśnik, skieruj wiązkę przez zamknięte wyjście. Iris, ponieważ mocowanie częściowego odbłyśnika nie utrzymuje go dokładnie prostopadle, używamy dwóch regulacyjnych montowanych w domu, aby umożliwić pionowy ruch belki.

Następnie użyj gumowych O-ringów, aby zamontować lusterko paraloidalne, dokręcając. O-ringi kompresują się, co pozwala na regulację lustra. Użyj dodatkowych luster, aby skierować wiązkę helu neonowego w przeciwnym kierunku, dostosowując ją tak, aby przechodziła przez poprzednio używane tęczówki.

Belka ta zostanie wykorzystana do regulacji zwierciadła paraboloidalnego. Lustro paraloidalne umieszczone w kostce optycznej odbija światło w kierunku detektora, który zostanie umieszczony za otworkiem. regulacyjne umożliwiają skierowanie belki przez otwór umieszczony na wyjściu kostki.

Po dostrojeniu wiązki przez otwór otworkowy umieść detektor MCT blisko otworka. Dostosuj położenie detektora podczerwieni tak, aby wiązka helu neonowego znajdowała się na elemencie pomiarowym detektora. Przesuń detektor w dół o około dwa milimetry.

Teraz włóż montaż z okienkiem niemieckim do kostki optycznej znajdującej się przed otworkiem. Okienko germanowe z powłoką odbiciową służy jako filtr podczerwieni i umożliwia obserwacje wizualne wspornika i próbki. Następnie zamocuj okular.

Skręcenie kąta kostki pozwala na skierowanie okularu w żądanym kierunku poprzez obrócenie mocowania okienka germanowego. Skieruj wiązkę helu neonowego przez środek okularu. Podłącz obiektyw na podczerwień do skanera FM i zamocuj ogranicznik wiązki.

Umieść próbkę na skanerze i skieruj wiązkę helu neonowego przez wejściową rurkę optyczną. Upewnij się, że wiązka jest wystarczająco szeroka, aby rozlać się po belce. Zatrzymaj się, regulując gwint okularu.

Uzyskaj ostry obraz wiązki skupionej na próbce. Następnie zamocuj głowicę FM i podłącz sondę do próbki. Skieruj wiązkę helu neonowego na koniec wspornika obrazowania.

Jeśli to zrobisz, przemieszcz wiązkę ze środka wejściowej tuby optycznej. Powtarzaj kroki strojenia, aż wiązka zostanie wyśrodkowana. Aby rozpocząć ostateczną regulację zwierciadła peral, zastąp otwór wyjściowy przysłoną w pozycji ogniskowej zwierciadła paraboloidalnego i usuń okienko germanowe i detektor podczerwieni.

Pamiętaj, aby zaznaczyć pozycję detektora podczerwieni. Zamocuj dodatkowy obiektyw za przysłoną na przybliżonej ogniskowej obiektywu. Zaangażowany wspornik powinien być teraz widoczny przez soczewkę.

Dostosuj położenie lustra paraboloidalnego tak, aby wyśrodkować się do końca końcówki przez zamkniętą tęczówkę. Należy pamiętać, że gdy wiązka helu neonowego jest prawidłowo skupiona na końcówce, między końcówką a jej odbiciem na powierzchni próbek pojawia się jasny blask. Ponownie zamocuj okno germanowe i wyreguluj je, aby zapewnić wygodną obserwację wizualną wspornika.

Zastąp tęczówkę otworkiem. Pamiętaj, że otwór używany do wykrywania podczerwieni powinien być przesunięty poza środek ze względu na przemieszczenie wiązki podczerwieni przez okienko germanowe. Umieść detektor podczerwieni we wcześniej zaznaczonej pozycji i skieruj wiązkę podczerwieni tak, aby przemieszczała się razem z widzialną wiązką używaną do strojenia.

Jesteśmy teraz gotowi, aby przyjrzeć się rutynowej procedurze dostosowania. Konfiguracja jest łatwiejsza do wyrównania z widzialną wiązką neonu helowego niż z niewidoczną wiązką podczerwieni. Ścieżka wiązki helu i wiązki podczerwieni spotyka się w odchylanym lustrze.

Jeśli to lustro zostanie przechylone w dół, neon helowy może przejść. Jeśli lustro znajduje się na swoim miejscu, podczerwień przechodzi do bliskiego pola. Ustawienie do wyrównania jednej z belek.

Użyj dwóch serwerów lustrzanych, które nie są wspólne z drugą ścieżką. Jeśli spojrzysz na wiązkę w ramieniu homo dyne, powinieneś zobaczyć profil wiązki podobny do korony. FM jest teraz zaangażowany w siłowe sprzężenie zwrotne w celu precyzyjnego wyrównania ze stopniem bliskiego pola.

Przesuń obiektyw mikroskopu odbijającego, aby skupić światło na końcówce, gdzie jest rozproszone. Umieść okienko germanowe w kostce optycznej. Po zwierciadle paraloidalnym wiązka jest skupiana w tym punkcie przez zwierciadło paraloidalne.

Przesuwaj stolik do tyłu lub do przodu, aż zobaczysz ostry obraz końcówki i jej odbicia na powierzchni próbki za pomocą okienka germanowego. Teraz spójrz przez teleskop, gdzie możesz zobaczyć wspornik i końcówkę bez wiązki helu neonowego. Nadal widać trochę czerwonego światła, ale jest to wewnętrzne światło z regulatora odległości A FM.

Przesuwaj stolik w prawo, w lewo i w górę w dół, aż na końcówce pojawi się jaskrawoczerwony błysk. Aby nałożyć się na pole ho dyne z rozproszonym światłem, najpierw otwórz ramię homo dyne. Następnie spójrz przez okular.

Zobaczysz trzy lub więcej punktów w linii o malejącej intensywności. Przesuń lustro w ramieniu homo dyne tak, aby drugi punkt nakładał się na obraz końcówki, w której końcówka i jej odbicie spotykają się. Aby ustawić czujnik, zdejmij dodatkowe lusterko.

Wiązka helu neonowego będzie teraz podążać w kierunku detektora za rurką. Możesz zobaczyć co najmniej dwie plamy przypominające pierścienie. Drugi punkt od prawej powinien przechodzić przez otwór w folii termoochronnej przed czujką i powinien uderzyć w element czujnikowy.

Miejsce o największej intensywności powinno być widoczne na dołku po zakończeniu rutynowej regulacji. Spójrzmy na wyrównanie wiązki podczerwieni. Aby wyrównać wiązkę podczerwieni, użyj linii laserowej tlenku węgla o intensywności co najmniej 100 miliwatów.

Ułatwi to wyrównanie. Aby rozpocząć, napełnij detektor ciekłym azotem. Podnieś lustro zamontowane na kinematycznym uchwycie odwracanym tak, aby wiązka podczerwieni była skierowana w stronę mikroskopu.

Umieść miernik mocy za pierwszą przysłoną i wyreguluj lusterko znajdujące się przed lustrem zamontowanym na kinematycznym uchwycie typu flip. Aby uzyskać najwyższą moc, trzymaj miernik mocy za tęczówką najbliżej stolika bliskiego pola i przesuwaj odchylane lustro, aż uzyskasz maksymalną moc. Tutaj podczas procesu wyrównywania powtórzysz te kroki kilka razy, obserwując jeden sygnał F.

Aby sprawdzić jeden sygnał F, przełącz odniesienie zamka we wzmacniaczu na jedno f równa się częstotliwości oscylacji FM i przejdź do trzymetrowego rozmiaru skanowania Zs w trybie wykresu siły. Jeśli masz złe wyrównanie, zobaczysz szeroki guzek na trzymetrowej skali. Aby to naprawić, będziesz musiał stale powtarzać wcześniejsze kroki, aż wyrównanie się poprawi

Jeśli masz średnie wyrównanie, krzywizna pierwszego guzka będzie wyglądać na lekko wklęsłą, chociaż drugi guzek będzie większy niż pierwszy. Tutaj możesz spróbować naprawić wyrównanie, regulując jedno lub oba lusterka wyrównania. Jeśli twoje wyrównanie jest dobre, zobaczysz tylko dwa guzki, a pierwszy będzie wyższy niż drugi.

Krzywizna po prawej stronie pierwszego wybrzuszenia będzie ujemna. Po dobrym wyrównaniu możesz przesunąć lusterka, aby zwiększyć maksimum pierwszego wybrzuszenia. Jeden sygnał F powinien leżeć gdzieś między 5 a 12 woltów, chociaż kształt pierwszego guzka jest bardziej krytyczny.

Na koniec przełącz się na dwa F i spróbuj nieco poprawić sygnał. Obracając lusterka nieznacznie zmieniając fazę, dwa sygnały F powinny leżeć gdzieś między 0,6 a dwoma woltami. Topografia eksperymentalna i bliskie pole.

Pokazano obrazy od 21 do 31 włókienek peptydowych. Górna skala pokazuje wysokość w nanometrach, a dolna skala pokazuje kontrast bliskiego pola w napięciu blokady, pokazany tutaj jest obraz topograficzny zebrany jednocześnie ze zdjęciem bliskiego pola uzyskanym przy użyciu 1 631 centymetrów odwrotnych. Promieniowanie. Obraz topograficzny wykonany jednocześnie ze zdjęciem bliskiego pola uzyskanym przy użyciu 1 691 centymetrów odwrotnych.

Pokazane jest promieniowanie. Etykiety reprezentują poszczególne fis i służą do podkreślenia rodzaju wtórnego potwierdzenia, które posiada każda FI. Właśnie pokazaliśmy, jak złożyć linię i używać skaningowego mikroskopu na podczerwień z listą apertur w bliskim polu.

Pamiętaj o krokach podjętych podczas wyrównywania, abyś mógł prześledzić swoje kroki, jeśli twoje wyrównanie jest nieprawidłowe, a przede wszystkim bądź cierpliwy. Otóż to. Dzięki za oglądanie.

Powodzenia w eksperymentach.