Name: Montaż, strojenie i użytkowanie bezaperturowego mikroskopu bliskiego pola w podczerwieni do obrazowania białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj montaż i strojenie bezaperturowego mikroskopu bliskiego pola w podczerwieni do obrazowania agregatów białkowych. Ta metoda umożliwia badanie struktur białek w neurobiologii i biofizyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe NSF, NSERC, NIH oraz ONR.

<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

montaż, strojenie i wykorzystanie bezaperturowego mikroskopu w bliskim polu podczerwieni do obrazowania białek

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Celem niniejszej pracy jest przeprowadzenie czytelnika przez proces montażu i obsługi podczerwonego mikroskopu bliskiego pola do obrazowania poza limitem dyfrakcyjnym. Bezaperturowy mikroskop bliskiego pola jest instrumentem typu rozproszeniowego, który dostarcza widm podczerwieni z rozdzielczością około 20 nm. Przedstawiono pełną listę komponentów oraz szczegółowy protokół użytkowania. Omówiono typowe błędy popełniane podczas montażu i strojenia instrumentu. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący strukturę drugorzędową włókna amyloidowego.

Opisano montaż bliskiego pola mikroskopu na podczerwień do obrazowania agregatów białkowych.

Montaż, strojenie i wykorzystanie bezaperturowego mikroskopu w bliskim polu podczerwieni do obrazowania białek

Celem niniejszej pracy jest poinstruowanie czytelnika w zakresie montażu i obsługi podczerwonego mikroskopu bliskiego pola do obrazowania poza limitem dyfrakcyjnym. ...

Wstępny montaż układu optycznego kończy się ustawieniem AFM wielomodułowego oraz mikroskopu optycznego. Ustawienie niewidocznej wiązki podczerwieni jest ułatwione dzięki uprzedniemu wyrównaniu z widocznym czerwonym laserem helowo-neonowym. Linia ciągła oznacza nakładanie się wiązki podczerwieni, linia przerywana zaś wskazuje cel, którym jest obserwacja światła laserowego uderzającego w wierzchołek końcówki wspornika oraz detektor podczerwieni.Ostateczne ustawienie wiązki podczerwieni wykonuje się poprzez regulację pozycji mikroskopu optycznego oraz luster, aby uzyskać sygnał 1F o odpowiednim kształcie po otrzymaniu pożądanego sygnału bliskiego pola. Jednocześnie, przy użyciu oprogramowania nano scope, rejestrowane są topografia FM oraz obrazy bliskiego pola. Dzień dobry, jestem profesor Gilbert Walker z Katedry Chemii na Uniwersytecie w Toronto.Witajcie, jestem Melissa Paulite, również z laboratorium Gilberta Walkera. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wstępnego montażu i kalibracji apertury w blisko-polowym podczerwonym skaningowym mikroskopie (near field infrared scanning microscope). W naszym laboratorium wykorzystujemy tę procedurę do badania agregatów białkowych.Zacznijmy zatem. Zanim opiszemy montaż i regulację systemu obrazowania, przyjrzyjmy się najpierw krótkiemu przeglądowi całego układu. Elementy systemu obrazowania, które opiszemy w tym filmie, obejmują stół optyczny, podstawę wielotrybowego mikroskopu sił atomowych (AFM), skaner wielotrybowego AFM, podwyższoną płytę optyczną, lustra prowadzące oraz tubus optyczny z przysłoną i centrowaniem.Zablokuj kostkę optyczną za pomocą częściowego reflektora z selenku cynku oraz rurką optyczną służącą do zabezpieczenia układu na platformie podnośnikowej. Obiektyw podczerwieni oraz rurkę optyczną do zbierania światła wstecznie rozproszonego. Kostkę z lustrem paraboloidalnym pozaosiowym oraz kostkę do utrzymywania płytki germanowej pod kątem 45 stopni.Okular mikroskopu, otwór w otwierniku (pinhole) zamontowany na stoliku XY, detektor podczerwieni z tellurku kadmu i rtęci (MCT). Przedwzmacniacz detektora podczerwieni, stolik XY do przesuwania pozycji wiązki, stół podnośny do ogniskowania wiązki, stolik Z do pozycjonowania detektora podczerwieni oraz stolik X do pozycjonowania detektora podczerwieni. Aby rozpocząć montaż układu optycznego, należy użyć luster strojeniowych, aby ustawić wiązkę helu-neonu równolegle do stołu optycznego.Następnie, nie wprowadzając dzielnika wiązki do kostki i z wydłużoną rurką optyczną po drugiej stronie kostki, skieruj wiązkę helu-neonu przez przysłony przymocowane do końców rurek. Teraz wyjmij skaner i zamocuj wydłużoną rurkę optyczną w miejscu obiektywu podczerwonego. Wstaw częściowy reflektor z selenku cynku, aby skierować wiązkę w stronę próbki.Należy go zamontować w taki sposób, aby wiązka helu-neonu padała na przednią powierzchnię reflektora w geometrycznym centrum kostki optycznej. Poprzez obrót częściowego reflektora skieruj wiązkę przez zamknięte wyjście. Ponieważ uchwyt częściowego reflektora nie utrzymuje go dokładnie prostopadle, stosujemy dwie własnoręcznie zainstalowane śruby regulacyjne, aby umożliwić pionowy ruch wiązki.Następnie, używając gumowych pierścieni O-ring, zamontuj lustro paraloidowe poprzez dokręcenie śrub. Ściśnięcie pierścieni O-ring umożliwia regulację lustra. Wykorzystaj dodatkowe lustra, aby skierować wiązkę helu i neonu w przeciwnym kierunku, dostosowując ją tak, aby przechodziła przez wcześniej użyte przysłony.Wiązka ta posłuży do regulacji lustra paraboloidalnego. Lustro paraboloidalne umieszczone w kostce optycznej odbija światło w stronę detektora, który zostanie ustawiony za otworem zaciemniającym (pinhole). Śruby regulacyjne umożliwiają skierowanie wiązki przez otwór zaciemniający umieszczony na wyjściu z kostki.Po dostrojeniu wiązki przez otwór zwężający, umieść detektor MCT w pobliżu otworu. Dostosuj położenie detektora podczerwieni w taki sposób, aby wiązka helowo-neonowa padała na element pomiarowy detektora. Przesuń detektor w dół o około dwa milimetry.Następnie wsuń uchwyt z okienkiem germanowym do kostki optycznej znajdującej się przed otworem zwężającym (pinhole). Okienko germanowe z powłoką antyrefleksyjną pełni funkcję filtra podczerwieni i umożliwia wizualną obserwację wspornika oraz próbki. Na koniec zamontuj okular.Obrócenie kostki pozwala na skierowanie okularu w pożądanym kierunku poprzez obrót mocowania okna germanowego. Skieruj wiązkę helowo-neonową przez środek okularu. Podłącz obiektyw podczerwieni oraz skaner FM i zamocuj ogranicznik wiązki.Umieść próbkę na skanerze i skieruj wiązkę helu-neonu przez wejściową rurkę optyczną. Upewnij się, że wiązka jest wystarczająco szeroka, aby wykraczać poza obszar wiązki. Zatrzymaj proces, regulując gwint okularu.Uzyskaj ostry obraz wiązki skupionej na próbce. Następnie podłącz głowicę FM i przyłóż sondę do próbki. Skup wiązkę helowo-neonową na końcu wspornika obrazującego.Jeśli spowoduje to przesunięcie wiązki z centrum wejściowej tuby optycznej, należy powtórzyć kroki strojenia, aż wiązka zostanie wycentrowana. Aby rozpocząć końcowe regulacje lustra paraboloidalnego, należy zastąpić wyjściowy otwór PIN irisem w pozycji ogniskowej lustra paraboloidalnego oraz usunąć okno germanowe i detektor podczerwieni.Należy pamiętać o zaznaczeniu pozycji detektora podczerwieni. Po przysłonie, w przybliżonej ogniskowej soczewki, należy zamocować dodatkową soczewkę. Wprowadzony wspornik powinien być teraz widoczny przez soczewkę.Dostosuj pozycję lustra paraboloidycznego tak, aby wycentrować go względem końca igły przez zamkniętą przysłonę. Należy zauważyć, że gdy wiązka helu-neonu jest prawidłowo skupiona na igle, między igłą a jej odbiciem w powierzchni próbki pojawia się jasny błysk. Ponownie zamocuj okno germanowe i ustaw je tak, aby umożliwić wygodną obserwację wizualną wspornika.Zastąp przysłonę otworem zwężającym (pinhole). Należy pamiętać, że otwór zwężający używany do detekcji podczerwieni powinien być przesunięty poza centrum ze względu na odchylenie wiązki podczerwieni przez okno germanowe. Umieść detektor podczerwieni w wcześniej zaznaczonej pozycji i skieruj wiązkę podczerwieni tak, aby biegła równolegle z wiązką światła widzialnego używaną do strojenia.Możemy teraz przejść do rutynowej procedury regulacji. Układ jest łatwiejszy do wyrównania przy użyciu widocznej wiązki helowo-neonowej niż niewidocznej wiązki podczerwieni. Tor wiązki helowo-neonowej oraz wiązki podczerwieni zbiegają się na lustrze pochylnym.Jeśli to lustro jest pochylone w dół, laser helowo-neonowy może przejść. Jeśli lustro znajduje się w pozycji roboczej, podczerwień kierowana jest do pola bliskiego. Konfiguracja do wyrównania jednej z wiązek.Użyj dwóch luster, które nie są wspólne z drugą ścieżką. Patrząc na wiązkę w ramieniu homodynowym, powinieneś zobaczyć profil wiązki przypominający koronę. Teraz FM jest zaangażowany z funkcją sprzężenia zwrotnego dla precyzyjnego ustawienia z etapem bliskiego pola.Przesuń obiektyw mikroskopu zwierciadłowego, aby skupić światło na wierzchołku, w którym ulega ono rozproszeniu. Umieść okno germanowe w kostce optycznej. Po lustrze paraloidowym wiązka jest skupiana w tym punkcie przez lustro paraloidowe.Przesuwaj stolik do tyłu lub do przodu, aż za pomocą okna germanowego zobaczysz ostry obraz wierzchołka i jego odbicia na powierzchni próbki. Następnie spójrz przez teleskop, w którym widoczny będzie wspornik i wierzchołek bez wiązki helu-neonowej. Nadal może być widoczne czerwone światło, lecz jest to światło wewnętrzne z układu kontroli odległości AFM.Przesuwaj stolik w prawo, w lewo oraz w górę i w dół, aż na końcówce pojawi się jasnoczerwony odblask. Aby nałożyć pole homodyniczne na światło rozproszone, najpierw otwórz ramię homodyniczne. Następnie spójrz przez okular.Zobaczą Państwo trzy lub więcej plamek ułożonych w linii o malejącej intensywności. Przesuńcie lustro w ramieniu homodynowym tak, aby druga plamka pokryła się z obrazem wierzchołka w miejscu, gdzie wierzchołek i jego odbicie zlewają się ze sobą. Aby ustawić detektor, należy usunąć dodatkowe lustro.Wiązka helowo-neonowa będzie teraz skierowana w stronę detektora znajdującego się za rurką. Powinny być widoczne co najmniej dwie plamki w kształcie pierścienia. Druga plamka od prawej strony powinna przejść przez otwór w folii termoodpornej przed detektorem i trafić w element pomiarowy.Po zakończeniu rutynowej regulacji punkt o najwyższej intensywności powinien znajdować się na środku otworu. Przejdźmy do wyrównania wiązki podczerwieni. Aby wyrównać wiązkę podczerwieni, należy użyć linii lasera tlenku węgla o intensywności co najmniej 100 mW.Ułatwi to procesy wyrównywania. Na początek napełnij detektor ciekłym azotem. Odchyl lustro zamontowane na kinematycznym uchwycie odchylanym, tak aby wiązka podczerwieni została skierowana w stronę mikroskopu.Umieść miernik mocy za pierwszą przysłoną i wyreguluj lustro znajdujące się przed lustrem zamontowanym na kinematycznym uchwycie odchylanym. Aby uzyskać najwyższą moc, trzymaj miernik mocy za przysłoną położoną najbliżej etapu bliskiego pola i przesuń lustro pochylne, aż osiągniesz maksymalną moc. Na tym etapie procesu wyrównywania będziesz powtarzać te kroki kilkakrotnie, obserwując sygnał one F.Aby sprawdzić sygnał one F, przełącz referencję blokady w wzmacniaczu na one f równą częstotliwości oscylacji FM i przejdź do skanowania Zs w zakresie trzech metrów w trybie wykresu siły. W przypadku złego dopasowania widoczne będzie szerokie wybrzuszenie w skali trzech metrów. Aby to naprawić, należy powtarzać poprzednie kroki do momentu poprawy dopasowania.W przypadku średniego dopasowania krzywizna pierwszego piku będzie lekko wklęsła, choć drugi pik będzie większy od pierwszego. W tej sytuacji można spróbować skorygować ustawienie, regulując jedno lub oba lustra pozycjonujące. Przy dobrym dopasowaniu widoczne będą tylko dwa piki, z czego pierwszy będzie wyższy od drugiego.Krzywizna po prawej stronie pierwszego wybrzuszenia będzie ujemna. Po uzyskaniu dobrego wyrównania można przesunąć lustra, aby zwiększyć maksimum pierwszego wybrzuszenia. Sygnał one F powinien znajdować się w zakresie od 5 do 12 voltów, choć kształt pierwszego wybrzuszenia jest bardziej istotny.Na koniec przełącz się na 2F i spróbuj jeszcze nieco poprawić sygnał. Poprzez lekkie obracanie luster w celu zmiany fazy, sygnał 2F powinien znajdować się w przedziale od 0,6 do 2 V. Topografia eksperymentalna i pole bliskie.Przedstawiono obrazy od 21 do 31 włókien peptydowych. Górna skala wskazuje wysokość w nanometrach, a dolna skala kontrast w polu bliskim w napięciu lock-in; pokazany tutaj obraz topografii został zebrany jednocześnie z obrazem pola bliskiego uzyskanym przy użyciu promieniowania o liczbie falowej 1 631 cm⁻¹. Obraz topografii zebrany jednocześnie z obrazem pola bliskiego uzyskanym przy użyciu 1 691 cm⁻¹.Przedstawiono promieniowanie. Etykiety reprezentują poszczególne FI i służą do wyróżnienia rodzaju wtórnego potwierdzenia, jakie posiada każde FI. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak zmontować linię i użyć bliskopolowego skanującego mikroskopu podczerwonego z listą apertur.Zapamiętaj kroki podjęte podczas kalibracji, abyś mógł do nich powrócić w przypadku błędnego ustawienia, a przede wszystkim uzbrój się w cierpliwość. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie.Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

assembly-tuning-use-an-apertureless-near-field-infrared-microscope

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zgromadzenie, dostrajanie i użytkowanie mikroskopii podczerwieni w pobliżu pola bezotworowego do obrazowania białek

Topologię adhezji komórek do podłoża mierzy się z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM).

Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Przedstawiamy protokół do optycznego wykrywania pojedynczych, nieznakowanych białek w czasie rzeczywistym, gdy są wydzielane z żywych komórek. Opiera się to na mikroskopii rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), która może być stosowana do wielu różnych systemów i konfiguracji biologicznych.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj montaż i strojenie bezaperturowego mikroskopu bliskiego pola w podczerwieni do obrazowania agregatów białkowych. Ta metoda umożliwia badanie struktur białek w neurobiologii i biofizyce.

Montaż, strojenie i wykorzystanie bezaperturowego mikroskopu w bliskim polu podczerwieni do obrazowania białek

Przeglądaj więcej filmów