Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mózgowej w mikroorganizmach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości, całkowitych obrazów wewnętrznego odbicia, fluorescencji lub murawy mikroorganizmów zawierających ścianę komórkową. W tym celu należy najpierw przygotować szkiełka nakrywkowe i komórki. Drugim krokiem jest precyzyjne ustawienie mikroskopu w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.

Następnie wybierane są odpowiednie zdarzenia, kąty i warunki obrazowania do pozyskiwania obrazów lub filmów. Ostatnim etapem jest obróbka poobrazowa pozyskanych obrazów. Ostatecznie mikroskopia murawy służy do badania dynamiki lokalizacji białek w korze komórkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metalami przewyższającymi metale, takie jak konwencjonalne lub konfokalne do mikroskopii, jest to, że kontrast obrazu w mikroskopii jest bardzo wysoki, co pozwala na szybkie czasy i słabe oświetlenie. W związku z tym metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań błonowych, takie jak mechanizmy bocznej segregacji białek lub ruchliwość białek błonowych. Szkiełka nakrywkowe do mikroskopii murawy należy przed użyciem oczyścić z cząstek kurzu.

Ponieważ murawa jest wrażliwa na sygnały tła powstające z kurzu na brudnym szkiełku nakrywkowym. Do rozpoczęcia procedury czyszczenia szkiełek nakrywkowych wymagane jest oczyszczone szkiełko nakrywkowe z mniejszą ilością tła. Za pomocą kleszczy umieść szkiełka nakrywkowe w ceramicznym uchwycie z pokrywką.

Następnie napełnij szklany pojemnik jednym molowym wodorotlenkiem sodu. Ten wodorotlenek sodu może być wielokrotnie używany. Umieścić ceramiczny uchwyt zawierający szkiełka nakrywkowe w wodorotlenku sodu i inkubować szkiełka nakrywkowe przez dwie godziny przy powolnych, ciągłych obrotach.

Nie inkubować dłużej niż osiem godzin, ponieważ spowoduje to powstanie nieprzezroczystych szkiełek nakrywkowych po dwóch godzinach, umyć szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną dwa razy przez pięć minut za każdym razem przy powolnych, ciągłych obrotach, przechowywać oczyszczone szkiełka nakrywkowe w ceramicznym uchwycie pokrytym 100% etanolem. Aby przygotować najsubtelniejsze komórki Bacillus do mikroskopii darniowej, rozcieńczyć do OD 600 od 0,01 do 0,05 w pięciu mililitrach odpowiedniej pożywki wzrostowej i rozebrać do fazy wykładniczej. Przygotuj 1,25% aros w syntetycznym podłożu, rozpuść proszek aros w 1,5 mililitrowej plastikowej tubie w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie przechowuj w bloku grzewczym w temperaturze 72 stopni Celsjusza.

Dodaj małą kroplę aros na środek szkiełka i za pomocą drugiego slajdu wciśnij aros w płaską podkładkę po co najmniej dwóch minutach, ostrożnie rozdziel szkiełka. Zakręć 500 mikrolitrów najsubtelniejszych komórek Bacillus w mikrowirówce z prędkością 12 000 obr./min przez jedną minutę. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w podłożu o objętości 50 mikrolitrów.

Dodaj dwa do czterech mikrolitrów komórek do środka podkładki aros. Następnie za pomocą kleszczy usuń oczyszczoną szkiełko nakrywkowe z pojemnika wypełnionego etanolem i wysusz je sprężonym powietrzem. Ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce.

Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej dwie minuty przed mikroskopią. W przypadku długotrwałego obrazowania należy uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego podgrzaną mieszanką wazeliny, lanoliny i parafiny lub Val app. Aby przygotować komórki Saccharomyces visi do mikroskopii darniowej, należy rozcieńczyć kulturę wstępną i hodować w odpowiednich pożywkach przez co najmniej pięć godzin.

Aby uzyskać fazę wykładniczą, wyjmij szkiełko nakrywkowe z pojemnika wypełnionego etanolem i wysusz je sprężonym powietrzem z pipetą. Pięć mikrolitrów, konwalescencja i roztwór lub con a na pokrywie. Slip and dry z powietrzem pod ciśnieniem Klimatyzacja A wiąże się z węglowodanami ściany komórkowej drożdży i unieruchamia komórki drożdży.

Następnie przenieś 4,5 mikrolitra zawiesiny komórek drożdży na jedną stronę konwentu, powlekanego szkiełka nakrywkowego. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym stroną do dołu, zaczynając od jednej krawędzi i powoli pozwalając kroplić. Pozwoli to uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej dwie minuty przed mikroskopią, uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą val app do długotrwałego obrazowania. Wszystkie eksperymenty pokazane w tym filmie są wykonywane na niestandardowej konfiguracji murawy opartej na w pełni zautomatyzowanym stojaku IMEX z obiektywem Olympus 100 x 1,45 NA. Zastosowane źródła światła to diody o mocy 75 miliwatów, pompowane lasery półprzewodnikowe lub DPSS o długości fali 488 nanometrów i 561 nanometrach.

Kąty murawy i fluorescencja. Odzyskiwanie po fotowybielaniu lub pozycji frat można natychmiast regulować za pomocą dwóch galwanometrów. Trzeci galwanometr służy do przełączania między epi, fluorescencją, frapem i murawą.

Galwanometry, które są sterowane bezpośrednio z oprogramowania do akwizycji na żywo, umożliwiają prosty pomiar kinetyki lokalizacji obiektów śledzonych na obrazach murawy zbieranych za pomocą kamery EM CCD i obiektywu o powiększeniu dwukrotnym przed kamerą. Akwizycja jest również kontrolowana przez oprogramowanie do akwizycji na żywo. Przed rozpoczęciem pracy z laserem załóż okulary ochronne lasera, wyświetl laser na suficie w trybie murawy i skalibruj pozycję zerowego stopnia, tak aby laser znajdował się w linii prostej.

W przypadku obiektywu skup plamkę lasera do minimalnego rozmiaru po optymalnym dopasowaniu, profil lasera powinien tworzyć dobrze zdefiniowaną plamkę o mniej więcej okrągłym kształcie. Wykonuj kalibrację przed każdą sesją. Aby uzyskać optymalną jakość obrazu, ustawienie mikroskopu darniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury.

Aby uzyskać optymalną jakość obrazu, należy starannie dostosować kąty i parametry akwizycji obrazu. Aby rozpocząć akwizycję obrazu, zidentyfikuj położenie komórek za pomocą oświetlenia w jasnym polu. Czerwone diody LED są szczególnie dobre, ponieważ nie powodują znacznych uszkodzeń fotograficznych.

Przełącz się na oświetlenie laserowe i wybierz odpowiednie kombinacje laserów i filtrów, aby wzbudzić wybrane fluorofory, upewnij się, że kąt murawy jest podkrytyczny. W przeciwnym razie sygnały pochodzące z białek fuzyjnych GFP nie zostaną wykryte. Znajdź górną część komórki, która jest stroną komórki zwróconą w stronę szkiełka nakrywkowego.

Stopniowo zwiększaj kąt padania wiązki laserowej, aż sygnały znikną, a następnie powoli zmniejszaj kąt, aż do momentu, w którym fluorescencja na powierzchni komórki pojawi się ponownie. Ponownie wyreguluj ostrość Z, aby uzyskać optymalną pozycję na powierzchni. Dopuszczalne kąty murawy nie tworzą rozmytej aureoli na krawędzi komórki, jak pokazano na tym przykładzie białka drożdżowego.

PMA jeden GFP zobrazowany z malejącymi kątami padania od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu. Obrazy pokazują nagłą utratę sygnału pod kątem krytycznym i postępujący spadek informacji strukturalnych oraz stosunku sygnału do szumu, dostosuj intensywność lasera i wzmocnienie kamery, aby zmaksymalizować zakres dynamiki. Zazwyczaj kamery E-M-C-C-D są optymalne do wykrywania bardzo słabych sygnałów przy wysokim stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia murawy jest bardzo czuła na małą wysokość. Różnice w szkiełku nakrywkowym skutkują tym, że tylko kilka komórek może być obrazowanych w tym samym czasie. Ten obraz gęstej zawiesiny fluorescencyjnych koralików jest przykładem nierównego pola widzenia, w którym ostra jest tylko część pola widzenia.

W związku z tym w przypadku małych komórek obszar akwizycji może być często zredukowany do podregionu zawierającego wybrany obiekt. W przypadku eksperymentów z dwukolorową murawą przebijanie fluoroforów musi być zminimalizowane dla par R-F-P-G-F-P. Używaj oddzielnych filtrów emisji, ponieważ zapytanie ofertowe jest co tydzień wzbudzane przez światło o długości 488 nanometrów.

Przedstawiono tutaj typowy przebieg pracy pozwalający uniknąć przebijania i obrazowania dwukolorowego. Po zobrazowaniu komórek za pomocą oddzielnych zestawów filtrów, obrazy są degenerowane i wyrównywane za pomocą koralików fluorescencyjnych przed połączeniem Do analizy krytycznym parametrem wpływającym na jakość obrazu jest wyrównanie laserowe i czysty obiektyw. Po ustawieniu lasera i ustawieniu ostrości na pozycji Z używanej do obrazowania murawy, usuń próbkę i oczyść obiektyw z całego oleju.

Resztki oleju doprowadzą do dyfrakcji światła laserowego i plamek w profilu wiązki. Mikroskopia murawy może być wykorzystana do wizualizacji rozmieszczenia homologów aktyny i enzymów ściany komórkowej w komórkach bakteryjnych. W tym reprezentatywnym wyniku, komórki Bacillus subtles wyrażające fuzje GFP aktyny hoog MBL lub transpeptydazy PBPH zostały zobrazowane za pomocą darni i regularnej epifluorescencji.

Obrazy tutaj reprezentują średnie projekcje szeregu czasowego, aby wskazać obszar pokryty ruchliwością. Łaty MBL monitorowane w różnych trybach obrazowania. Niebieski kontur na obrazie nakładki wskazuje granicę komórki zwizualizowaną na obrazie obrazu w jasnym polu.

Tygodniowa ekspresja transpeptydazy PBPH lokalizuje się w plamach korowych, które są ledwo widoczne przez epifluorescencję, ale można je wyraźnie odróżnić za pomocą darni. Zmniejszoną penetrację najlepiej zaobserwować dla sygnału P-B-P-H-G-F-P w przegrodzie wskazanej strzałkami, która w epifluorescencji występuje jako linie, ale jako kropki na murawie. Następny zestaw obrazów pokazuje porównanie między epi fluorescencją a oświetleniem darni składnika kompleksu TOR, bit 61 w Saccharomyces visi.

Białko to ulega ekspresji co tydzień i tworzy małe plamy korowe z zaledwie kilkoma kopiami białka na plaster. We fluorescencji epi tylko kilka plam jest widocznych ponad silnym tłem, podczas gdy plamy można obrazować z bardzo dobrym stosunkiem sygnału do szumu na murawie. Dodatkową poprawę kontrastu obrazu można uzyskać poprzez różne etapy przetwarzania obrazu, takie jak odejmowanie rozmytych obrazów gaussowskich lub mediany, podczas gdy lokalne odejmowanie tła usuwa szum i wyostrza struktury o wysokiej intensywności.

Często odbywa się to kosztem utraty drobnych struktur i przesadnego wzmocnienia obszarów o wysokiej intensywności. Jak wskazuje strzałka, nadrzędną procedurą jest dekonwolucja 2D, którą można wykonać za pomocą bezpłatnych lub dostępnych na rynku pakietów oprogramowania. Wzrost kontrastu po dekonwolucji jest zilustrowany przez ten film poklatkowy GFP RAs two, który pokazuje naprzemiennie surowe i zdecentralizowane obrazy murawy.

Ponieważ GFP RA dwa jest szybko rotującym białkiem, ważne jest, aby rozwiązać problem z krótkimi czasami wchłaniania. Jego dynamiczne zachowanie. Przetwarzanie obrazu jest szczególnie ważne w przypadku analiz kolokalizacji, jak pokazano w tym poklatkowym dwukolorowym filmie z białkami drożdży, FET 3G FP i PMA one RFP.

Pierwsze 10 klatek reprezentuje obrazy nieprzetworzone, a pozostałe klatki to obrazy zdecentralizowane Aby możliwa była analiza, konieczne jest zmaksymalizowanie kontrastu i wyostrzenie rozmytych obrazów RAW. Turf i frap oferują potężną kombinację do badania dynamiki białek korowych. Zastosowanie tej techniki w najsubtelniejszych komórkach B wyrażających G-F-P-M-B-L wykluczyło bieżnik jako mechanizm obserwowanej ruchliwości plam zawierających MBL.

Wykres chm ruchomej plamy i profil intensywności wzdłuż wykresu chm wskazany linią przerywaną są pokazane w podobny sposób na strzępie murawy błony plazmatycznej drożdży. A TPAs PMA ujawnił powolne przegrupowania białek błony plazmatycznej drożdży, które po jego rozwoju rozchodzą się w domeny przypominające sieć pokrywające całą powierzchnię komórki. Technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie biologii komórki bakteryjnej w celu zbadania mechanizmu syntezy ściany komórkowej w BA subtilis.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskiwać obrazy mikroorganizmów, takich jak drożdże i bakterie, oraz jak ta technika może pomóc w badaniu dynamicznych właściwości białek korowych.