Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów fluorescencyjnych lub obrazów typu turf w technice całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) mikroorganizmów posiadających ścianę komórkową. W pierwszej kolejności przygotowuje się szkiełka nakrywkowe oraz komórki. Drugim krokiem jest precyzyjne ustawienie mikroskopu w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.

Następnie, w celu pozyskania obrazów lub filmów, wybiera się odpowiednie zdarzenia, kąty oraz warunki obrazowania. Ostatnim etapem jest postprocesing uzyskanych obrazów. W ostateczności mikroskopia turf jest wykorzystywana do badania dynamiki lokalizacji białek w korze komórkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do metod konwencjonalnych lub konfokalnych w mikroskopii jest bardzo wysoki kontrast obrazu, co pozwala na skrócenie czasu pomiaru i zastosowanie słabego oświetlenia. W związku z tym metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad błonami, takie jak mechanizmy bocznej segregacji białek czy mobilność białek błonowych. Przed użyciem szkiełka podstawowe do mikroskopii TIRF należy oczyścić z cząsteczek kurzu.

Ponieważ technika turf jest wrażliwa na sygnały tła pochodzące z kurzu na zabrudzonej lamellce, do rozpoczęcia procedury czyszczenia lamellek wymagana jest czysta lamellka o niższym poziomie tła. Za pomocą pęsety umieść lamellki w ceramicznym pojemniku z pokrywką.

Następnie należy napełnić szklany pojemnik jednomolowym roztworem wodorotlenku sodu. Ten wodorotlenek sodu może być wykorzystywany wielokrotnie. Umieść uchwyt ceramiczny z szkiełkami nakrywkowymi w wodorotlenku sodu i inkubuj szkiełka przez dwie godziny w warunkach powolnej, ciągłej rotacji.

Nie inkubować dłużej niż osiem godzin, ponieważ po dwóch godzinach szkiełka podstawowe staną się nieprzezroczyste; wypłukać szkiełka podstawowe wodą destylowaną dwukrotnie po pięć minut przy wolnym, ciągłym obrotowaniu, a następnie przechowywać oczyszczone szkiełka w uchwycie ceramicznym zalane 100% ethanol. Aby przygotować komórki bacillus subtlest do mikroskopii turf, rozcieńczyć je do OD 600 wynoszącej 0,01 do 0,05 w pięciu mililitrach odpowiedniej pożywki i hodować do fazy wykładniczej. Przygotować 1,25% aros w pożywce syntetycznej: rozpuścić proszek aros w plastikowej probówce o pojemności 1,5 mililitra w temperaturze 95 °C, a następnie przechowywać w bloku grzejnym w temperaturze 72 °C.

Nanieś małą kroplę aros na środek szkiełka przedmiotowego, a następnie za pomocą drugiego szkiełka dociśnij aros, tworząc płaską warstwę; po co najmniej dwóch minutach ostrożnie rozdziel szkiełka. Odwirowuj 500 µL komórek bacillus subtlest w mikrocentryfużce przy 12 000 RPM przez jedną minutę. Usuń nadsącz i resuspenduj osad w 50 µL pożywki.

Dodaj od dwóch do czterech µL komórek na środek podkładki aros. Następnie, za pomocą pęsety, wyjmij oczyszczone szkiełko nakrywkowe z pojemnika wypełnionego etanolem i osusz je sprężonym powietrzem. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce.

Pozostaw komórki do osiadania przez co najmniej dwie minuty przed badaniem mikroskopowym. W przypadku obrazowania długoterminowego uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą podgrzanej mieszaniny wazeliny, lanoliny i parafiny lub preparatu Val app. Aby przygotować komórki Saccharomyces visi do mikroskopii turf, rozcieńcz prekulturę i hoduj w odpowiednich mediach przez co najmniej pięć godzin.

W fazie wykładniczej należy wyjąć szkiełko nakrywkowe z pojemnika z etanolem i osuszyć je sprężonym powietrzem za pomocą rozpylacza do pipet. Na szkiełko nakłada się 5 µL roztworu Con A, a następnie osusza sprężonym powietrzem. Con A wiąże się z węglowodanami ściany komórkowej drożdży, unieruchamiając komórki drożdży.

Następnie przenieś 4,5 µL zawiesiny komórek drożdży na jedną stronę szkiełka nakrywki z powłoką. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe stroną z próbką do dołu na szkiełku przedmiotowym, zaczynając od jednej krawędzi i pozwalając, aby krople powoli się rozlały. Pozwoli to uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Pozostaw komórki do osiadania przez co najmniej dwie minuty przed rozpoczęciem mikroskopii; krawędzie szkiełka nakrywki zabezpiecz za pomocą wazeliny w celu zapewnienia długotrwałego obrazowania. Wszystkie eksperymenty przedstawione w tym filmie zostały przeprowadzone na dostosowanym układzie turf opartym na w pełni zautomatyzowanym statywie IMEX z obiektywem Olympus 100 x 1,45 NA. Jako źródła światła zastosowano lasery DPSS (diode-pumped solid-state) o mocy 75 mW o długości fali 488 nm i 561 nm.

Kąty Turf i fluorescencja. Powrót po fotoblaknięciu lub pozycja FRAP mogą być dostosowywane natychmiastowo za pomocą dwóch galwanometrów. Trzeci galwanometr służy do przełączania między trybami epi, fluorescencji, FRAP i Turf.

Galwanometry, sterowane bezpośrednio przez oprogramowanie do akwizycji w czasie rzeczywistym, umożliwiają prosty pomiar kinetyki lokalizacji obiektów śledzonych na obrazach turf, które są gromadzone za pomocą kamery EM CCD i obiektywu o dwukrotnym powiększeniu umieszczonego przed kamerą. Akwizycja jest również kontrolowana przez oprogramowanie do akwizycji w czasie rzeczywistym. Przed rozpoczęciem pracy z laserem należy założyć okulary ochronne do pracy z laserem, skierować wiązkę lasera na sufit w trybie turf i skalibrować pozycję zero stopnia w taki sposób, aby laser tworzył linię prostą.

Z uwagi na cel badania, po optymalnej regulacji należy skupić plamkę lasera do minimalnego rozmiaru; profil lasera powinien tworzyć wyraźnie zdefiniowaną plamkę o w przybliżeniu okrągłym kształcie. Kalibrację należy przeprowadzać przed każdą sesją. Aby uzyskać optymalną jakość obrazu, prawidłowe wyrównanie mikroskopu do analizy darni jest kluczowe dla powodzenia tej procedury.

W celu uzyskania optymalnej jakości obrazu należy starannie dostosować odpowiednią inklinację, kąty oraz parametry akwizycji obrazu. Aby rozpocząć akwizycję, należy zidentyfikować położenie komórek, korzystając z oświetlenia w polu jasnym. Szczególnie odpowiednie są czerwone diody LED, ponieważ nie powodują one znaczących uszkodzeń fotochemicznych.

Przełącz na oświetlenie laserowe i wybierz odpowiednie lasery oraz kombinacje filtrów, aby pobudzić wybrane fluorofory; upewnij się, że kąt padania jest podkrytyczny. W przeciwnym razie sygnały pochodzące z białek fuzyjnych GFP nie zostaną wykryte. Zlokalizuj górną sekcję komórki, czyli stronę komórki skierowaną w stronę szkiełka podstawowego.

Stopniowo zwiększaj kąt padania wiązki lasera, aż sygnały zanikną, a następnie powoli zmniejszaj kąt do momentu, w którym na powierzchni komórki ponownie pojawi się fluorescencja. Ponownie dostrój ostrość w osi Z, aby uzyskać optymalną pozycję na powierzchni. Prawidłowe kąty nie powodują powstania rozmytego halo na krawędzi komórki, co zilustrowano na tym przykładzie białka drożdżowego.

Obrazy PMA one GFP wykonane przy malejących kątach padania, od lewego górnego do prawego dolnego rogu. Obrazy wykazują nagłą utratę sygnału przy kącie krytycznym oraz stopniowy spadek informacji strukturalnych i stosunku sygnału do szumu; należy dostosować intensywność lasera i wzmocnienie kamery w celu maksymalizacji zakresu dynamicznego. Zazwyczaj kamery E-M-C-C-D są optymalne do wykrywania bardzo słabych sygnałów przy wysokim stosunku sygnału do szumu.

Mikroskopia powierzchniowa (turf microscopy) jest bardzo czuła na niewielkie różnice wysokości szkiełka podstawowego, co skutkuje tym, że jednocześnie można obrazować tylko kilka komórek. Przedstawiony obraz gęstej zawiesiny fluorescencyjnych kulek jest przykładem nierównomiernego pola widzenia, w którym jedynie jego część znajduje się w ostrości.

Dlatego w przypadku małych komórek obszar akwizycji można często ograniczyć do podregionu zawierającego wybrany obiekt. W eksperymentach z dwukolorowym turfem należy zminimalizować prześwit fluoroforów dla par R-F-P-G-F-P. Należy stosować oddzielne filtry emisyjne, ponieważ RFP jest słabo wzbudzane światłem o długości 488 nanometrów.

Przedstawiono tutaj typowy schemat postępowania w celu uniknięcia przesłuchów (bleed-through) oraz podwójnego obrazowania kolorów. Po wykonaniu obrazowania komórek z użyciem osobnych zestawów filtrów, obrazy są odszumiane i wyrównywane przy użyciu kulek fluorescencyjnych przed ich nałożeniem na siebie. Kluczowym parametrem wpływającym na jakość obrazu podczas analizy jest wyrównanie lasera oraz czystość obiektywu. Po wyrównaniu lasera i ustawieniu ostrości w pozycji Z stosowanej do obrazowania turf, należy wyjąć próbkę i oczyścić obiektyw z całego oleju.

Pozostałości oleju spowodują dyfrakcję światła laserowego i powstawanie plamek w profilu wiązki. Mikroskopia typu turf może być wykorzystana do wizualizacji rozmieszczenia homologów aktyny i enzymów ściany komórkowej w komórkach bakteryjnych. Na tym reprezentatywnym wyniku przedstawiono obrazowanie komórek bacillus subtles ekspresyjących fuzje GFP z homologiem aktyny MBL lub transpeptydazą PBPH, wykonane za pomocą fluorescencji typu turf oraz regularnej epi-fluorescencji.

Przedstawione tutaj obrazy reprezentują średnie projekcje szeregów czasowych, wskazując obszar zajęty przez ruchome plamki MBL monitorowane w różnych trybach obrazowania. Niebieski obrys na obrazie nałożonym wskazuje granicę komórki zwizualizowaną na obrazie w polu jasnym.

Tygodniowo eksprimowana transpeptydaza PBPH lokalizuje się w plamkach korowych, które są słabo widoczne w fluorescencji epi, ale mogą zostać wyraźnie rozróżnione w trybie turf. Zredukowana penetracja jest najlepiej widoczna dla sygnału P-B-P-H-G-F-P w obrębie SEPTA wskazanych strzałkami, który w fluorescencji epi jawi się jako linie, a w trybie turf jako kropki. Następny zestaw obrazów przedstawia porównanie fluorescencji epi oraz oświetlenia turf dla komponentu kompleksu TOR, bit 61 w Saccharomyces visi.

Białko to jest słabo eksprimowane i tworzy niewielkie plamy kortykalne, zawierające zaledwie kilka kopii białka na plamę. W fluorescencji epifluorescencyjnej widocznych jest tylko kilka plam na tle silnego tła, podczas gdy w technice turf można obrazować plamy z bardzo korzystnym stosunkiem sygnału do szumu. Dodatkową poprawę kontrastu obrazu można uzyskać poprzez różne etapy przetwarzania obrazu, takie jak odejmowanie obrazów rozmytych z wykorzystaniem filtru Gaussa lub filtru medianowego, podczas gdy odejmowanie tła lokalnego usuwa szumy i wyostrza struktury o wysokiej intensywności.

Często dzieje się to kosztem utraty drobnych struktur i nadmiernego wzmocnienia obszarów o wysokiej intensywności. Jak wskazuje strzałka, lepszą procedurą jest dekonwolucja 2D, którą można przeprowadzić za pomocą bezpłatnych lub komercyjnych pakietów oprogramowania. Zwiększenie kontrastu po dekonwolucji zilustrowano w tym filmie poklatkowym GFP RAs two, który pokazuje naprzemiennie surowe oraz zdekonwolucjonowane obrazy turf.

Ponieważ białko GFP RA2 jest białkiem o wysokiej mobilności, kluczowe dla rozdzielczości jego dynamicznego zachowania są krótkie czasy akwizycji. Przetwarzanie obrazu jest szczególnie istotne w analizach kolokalizacji, co zilustrowano w tym poklatkowym filmie dwukolorowym przedstawiającym białka drożdżowe FET 3G FP oraz PMA 1 RFP.

Pierwsze 10 klatek przedstawia obrazy surowe, a pozostałe klatki są obrazami po dekonwolucji. Aby umożliwić analizę, kluczowe jest zmaksymalizowanie kontrastu i wyostrzenie rozmytych obrazów surowych. Turf i frap oferują potężną kombinację do badania dynamiki białek kortykalnych. Zastosowanie tej techniki w komórkach B subtlest wykazujących ekspresję G-F-P-M-B-L pozwoliło wykluczyć treadmilling jako mechanizm obserwowanej ruchliwości obszarów zawierających MBL.

Wykres chm przesuwającego się obszaru oraz profil intensywności wzdłuż wyBiegu wykresu chm wskazanego linią przerywaną przedstawiono w sposób podobny do turf frap błony plazmatycznej drożdży. Analiza TPAs PMA one ujawniła powolne przegrupowania białek błony plazmatycznej drożdży, które po swoim rozwoju rozprzestrzeniają się w domeny przypominające sieć, pokrywające całą powierzchnię komórki. Technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie biologii komórki bakterii w celu zbadania mechanizmu syntezy ściany komórkowej u BA subtilis.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pozyskiwania obrazów typu „turf” mikroorganizmów, takich jak drożdże i bakterie, oraz tego, jak technika ta może pomóc w badaniu właściwości dynamicznych białek koryktykalnych.