Name: Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mózgowej w mikroorganizmach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Poznaj mikroskopię TIRF do badania dynamiki białek w korze komórkowej mikroorganizmów. Ta technika umożliwia wysokorozdzielcze obserwacje lokalizacji białek w komórkach z otoczką komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana przez Towarzystwo Maxa Plancka.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Mikroskopia TIRF jest preferowaną techniką obrazowania białek peryferyjnych. Mała głębokość penetracji pola ewanescentnego minimalizuje ilość światła poza ogniskiem, co prowadzi do bardzo dobrego stosunku sygnału do szumu i umożliwia akwizycję danych z wysoką częstotliwością klatek lub obrazowanie białek o bardzo słabej ekspresji. Połączenie wysokiego kontrastu i wysokiej częstotliwości klatek sprawia, że mikroskopia TIRF jest idealnym narzędziem do obrazowania dynamiki czasowo-przestrzennej białek zlokalizowanych w korz...

<table><tbody><tr><td>Inkubator orbitalny</td><td>UniEquip</td><td>UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td></td><td>Układ niestandardowy</td><td></td></tr><tr><td>Szklany pojemnik</td><td>Vitlab</td><td>340-232880353</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczny statyw do barwienia</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Konkanawalina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki nr 1 (18 x 18 mm)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB018018A1</td><td></td></tr><tr><td>Przedmiotu mikroskopowe</td><td>Menzel-Glaser</td><td>AA00000102E</td><td></td></tr><tr><td>Olejek imersyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Immersol 518F</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8795</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Mikroskopia TIRF stała się potężną technologią obrazowania służącą do badania dynamiki czasowo-przestrzennej cząsteczek fluorescencyjnych in vitro oraz w żywych komórkach1. Zjawisko optyczne całkowitego wewnętrznego odbicia występuje, gdy światło przechodzi z ośrodka o wysokim współczynniku załamania do ośrodka o niskim współczynniku załamania pod kątem większym niż charakterystyczny kąt krytyczny (tzn. bardziej równolegle do granicy ośrodków). Chociaż w takich warunkach całe światło ulega odbiciu, powstaje fala ewanescentna, która rozprzestrzenia się w poprzek i wzdłuż granicy, zanikając wykładniczo wraz z odległością i przenikając jedynie obszary próbki znajdujące się w odległości 100-200 nm od interfejsu2. Oprócz zapewnienia doskonałej rozdzielczości osiowej, ograniczone wzbudzanie fluoroforów znajdujących się poza ogniskową pozwala na uzyskanie bardzo wysokiego stosunku sygnału do szumu oraz minimalizuje szkodliwe efekty fotoblaknięcia2,3. Jako technika szerokopolowa, TIRF umożliwia również szybszą akwizycję obrazów niż większość konfokalnych układów opartych na skanowaniu.
Na pierwszy rzut oka niewielka głębokość penetracji TIRF wydaje się być niekompatybilna z obrazowaniem komórek bakteryjnych i grzybów, które często są otoczone grubymi ścianami komórkowymi. Wręcz przeciwnie, odkryliśmy, że ściany komórkowe drożdży i bakterii w rzeczywistości poprawiają użyteczność TIRF i zwiększają zakres obserwowalnych struktur4-8. Wiele procesów komórkowych może zatem być bezpośrednio badanych za pomocą TIRF w małych, jednokomórkowych mikroorganizmach, które często oferują potężne techniki manipulacji genetycznej. Pozwala to na przeprowadzanie eksperymentów z zakresu biochemia in vivo, w których kinetykę oddziaływań i aktywności białek można bezpośrednio oceniać w żywych komórkach.
Opisujemy tutaj poszczególne etapy niezbędne do uzyskania wysokiej jakości obrazów TIRF dla komórek Saccharomyces cerevisiae lub Bacillus subtilis. Wskazujemy na różne problemy, które mogą wpływać na wizualizację sond fluorescencyjnych w komórkach przy użyciu TIRF, i ilustrujemy tę procedurę za pomocą kilku przykładów zastosowań. Na koniec demonstrujemy, w jaki sposób obrazy TIRF można dodatkowo ulepszyć, stosując uznane techniki rekonstrukcji obrazu.

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Mikroskopia TIRF stała się potężną technologią obrazowania służącą do badania dynamiki czasowo-przestrzennej cząsteczek fluorescencyjnych in vitro oraz w żywych komórkach1. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów fluorescencyjnych lub obrazów typu turf w technice całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) mikroorganizmów posiadających ścianę komórkową. W pierwszej kolejności przygotowuje się szkiełka nakrywkowe oraz komórki. Drugim krokiem jest precyzyjne ustawienie mikroskopu w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.Następnie, w celu pozyskania obrazów lub filmów, wybiera się odpowiednie zdarzenia, kąty oraz warunki obrazowania. Ostatnim etapem jest postprocesing uzyskanych obrazów. W ostateczności mikroskopia turf jest wykorzystywana do badania dynamiki lokalizacji białek w korze komórkowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do metod konwencjonalnych lub konfokalnych w mikroskopii jest bardzo wysoki kontrast obrazu, co pozwala na skrócenie czasu pomiaru i zastosowanie słabego oświetlenia. W związku z tym metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad błonami, takie jak mechanizmy bocznej segregacji białek czy mobilność białek błonowych. Przed użyciem szkiełka podstawowe do mikroskopii TIRF należy oczyścić z cząsteczek kurzu.Ponieważ technika turf jest wrażliwa na sygnały tła pochodz

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory w mikroorganizmach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę...

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych 

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj mikroskopię TIRF do badania dynamiki białek w korze komórkowej mikroorganizmów. Ta technika umożliwia wysokorozdzielcze obserwacje lokalizacji białek w komórkach z otoczką komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mózgowej w mikroorganizmach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Przeglądaj więcej filmów