Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar topologii adhezji komórek do podłoża z nanometrową precyzją. Osiąga się to poprzez uprawę komórek na przezroczystych szkiełkach przedmiotowych i ich inkubację z markerem fluorescencyjnym. Następnie kalibrowana jest pozycja kątowa regulowanego lustra mikroskopu, a uzyskana wartość zostaje zapisana w programie pozycjonującym lustro.

Kolejnym krokiem jest rejestracja obrazów fluorescencyjnych podczas naświetlania pod około 10 różnymi kątami. Ostatnim etapem jest obliczenie odległości komórek od podłoża z precyzją do kilku nanometrów. Ostatecznie wyniki dotyczące topologii adhezji komórek do podłoża są wykorzystywane do wykazania różnic w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, na przykład między komórkami nowotworowymi a komórkami o mniejszym stopniu złośliwości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że rzeczywista rozdzielczość mieści się w zakresie zaledwie kilku nanometrów. Choć metoda ta pozwala na badanie błon komórkowych, może ona zostać zastosowana również do innych układów, takich jak małe pęcherzyki lub nanomateriały.

Eksperyment zaprezentuje nasza postdoktorantka Petra, która przygotuje próbki komórek, oraz nasz inżynier, Michael Wagner, który przeprowadzi badanie. Aby przygotować komórki do mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem, należy wysiać pojedyncze komórki z gęstością 100 komórek na milimetr kwadratowy na szkiełku przedmiotowym w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki. Hodować komórki przez 72 godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Następnie na komórki nanieść fluorescencyjną membranową sondę 6-DAD (2,6-dimetylaminonaftalina) lub loran w stężeniu 8 µM w pożywce hodowlanej i inkubować przez 60 minut przed badaniem w mikroskopie fluorescencyjnym. Przemyć komórki roztworem PBS, pipetując bufor na szkiełko przedmiotowe w celu usunięcia pożywki, a następnie wytrzeć roztwór buforowy z tylnej strony szkiełka. Do obrazowania pod różnymi kątami należy użyć mikroskopu odwróconego, takiego jak Zeiss Axio plan, wyposażonego w podświetlenie tylne i kamerę exon E-M-C-C-D.

W mikroskopii TIRF kondensor zastępuje się specjalnie wykonanym urządzeniem oświetlającym z półcylindrycznym pryzmatem szklanym sprzężonym optycznie z przedmiotowym szkiełkiem. Wiązka laserowa pada z kolimowanego światłowodu jednomodowego, która po obrazowaniu przez pryzmat szklany i kolejne komponenty optyczne ponownie tworzy wiązkę równoległą na powierzchni próbki. Należy zadbać o to, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania.

Pozycja ta jest zaznaczona na sprzęgaczu wyjściowym światłowodu. Należy użyć lustra regulowanego znajdującego się wewnątrz kondensora, które jest obrazowane w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania lub promienia przedmiotowego. Lustro regulowane może być napędzane silnikiem krokowym sterowanym przez oprogramowanie.

Każda pozycja odpowiada ściśle określonemu kątowi padania, wyznaczonemu na podstawie pomiarów z wykorzystaniem metryki go. Aby skalibrować pozycję kątową regulowanego lustra, należy użyć barwnika fluorescencyjnego, takiego jak 1 mM nukleotyd flawinowy rozpuszczony w wodzie. W celu wizualizacji kąta krytycznego przy zmianie kąta padania, jako wartość stałą przyjmuje się kąt krytyczny wynoszący 61,3 stopnia dla przejścia szkło-woda; pozycja kątowa lustra, przy której kąt padania jest równy kątowi krytycznemu, jest zapisana w programie pozycjonowania lustra.

Za pomocą oprogramowania kamery ustaw parametry kamery E-M-C-C-D, w tym wzmocnienie temperaturowe, czas rejestracji oraz prędkość przesunięcia. Użyj olejku imersyjnego, aby zapewnić kontakt optyczny z próbką. Za pomocą pryzmatu szklanego wybierz obiektyw o powiększeniu odpowiednim dla komórek i umiarkowanej aperturze numerycznej.

Aby zwizualizować obiekt w mikroskopie, należy użyć odpowiedniego filtra długoprzepustowego lub pasmowoprzepustowego do detekcji fluorescencji. Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjne identycznych próbek przy zmiennym kącie oświetlenia. Kąty padania powinny być równe lub większe od kąta krytycznego.

Przy kącie krytycznym wynoszącym 64,5 stopnia dla interfejsu szkło-komórka, zaleca się zakres kątowy od 66 do 74 stopni z krokiem 0,5 stopnia lub jednego stopnia. Aby rozpocząć analizę danych, należy użyć programu LabVIEW do odczytania obrazów zarejestrowanych pod różnymi kątami, a także ustawień kamery, długości fali wzbudzenia oraz współczynników załamania światła. W celu właściwej oceny danych importowane są ustawienia dla szkła, wynoszące 1,52, oraz dla komórek, wynoszące 1,37.

Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji oraz współczynnik transmisji są obliczane automatycznie. Dla powodzenia procedury istotne jest, aby obrazy zostały starannie zarejestrowane i wybrane do analizy. Należy wybrać obrazy wykorzystywane do oceny odległości komórek od podłoża zgodnie z równaniem.

W przypadku markerów błony można wykluczyć pojedyncze obrazy o jednorodnym oświetleniu, takie jak pokazano w tym przykładzie. Należy obliczyć obrazy topologii podłoża komórkowego i wybrać odpowiedni kod kolorów do wyświetlania podczas oceny. Profile poszczególnych pikseli mogą być wyświetlane w sposób przedstawiony na tej rycinie.

Profile te mogą służyć jako wskaźnik jakości dopasowania. Na koniec należy zapisać protokół oceny. Rysunek ten przedstawia obrazy całkowitego wewnętrznego odbicia komórek glejaka U2 51 z aktywnym genem supresorowym nowotworów TP 53.

Po inkubacji z luanie pomiarach wykonanych pod różnymi kątami padania: 66 stopniami, co odpowiada głębokości penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego wynoszącej około 140 nanometrów, 69 stopniami, co odpowiada głębokości penetracji 75 nanometrów oraz 73 stopniami, co odpowiada głębokości penetracji 60 nanometrów, wraz ze spadkiem głębokości penetracji intensywność fluorescencji maleje, a sygnał pochodzi z bardziej powierzchownych obszarów komórek, takich jak kontakty ogniskowe na ich krawędziach. Odległości komórek od podłoża przedstawiono w Panelu D za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie od 0 do 600 nanometrów, jak pokazano tutaj.

Odległości między komórkami a podłożem znacznie się różnią, od zaledwie kilku nanometrów, reprezentowanych kolorami od białego do żółtego, do 250–300 nanometrów, reprezentowanych kolorem ciemnoczerwonym. Wskazuje to na bliskie sąsiedztwo kontaktów ogniskowych i większych odległości między komórkami a podłożem. Podobną zmienność odległości między komórkami a podłożem obliczono dla komórek glejaka U2 51 mg z aktywowanym genem supresorowym guza P 10.

W przeciwieństwie do nich, odległości komórek od podłoża są raczej stałe dla komórek kontrolnych U2 51 mg (oznaczonych kolorem żółtym) oraz komórek typu dzikiego (oznaczonych kolorami od pomarańczowego do czerwonego) po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie topologii komórka-podłoże do badania komórek nowotworowych oraz zmian morfologicznych pod wpływem terapii laserowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wizualizacji powierzchni z rzeczywistą rozdzielczością w zakresie nanometrów przy niskiej ekspozycji na światło, która jest dobrze tolerowana przez żywe organizmy.