Name: Nanotopologia adhezji komórek w mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj nanotopologię adhezji komórek z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej VA-TIRFM. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary odległości komórka-podłoże z rozdzielczością nanometryczną i porównanie właściwości adhezyjnych różnych linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują krajowi Baden-Württemberg oraz Unii Europejskiej – Europejskiemu Funduszowi Rozwoju Regionalnego – za sfinansowanie ZAFH-PHOTONn, Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań (BMBF) za sfinansowanie grantu badawczego nr 1792C08, a także Baden-Württemberg-Stiftung GmbH za sfinansowanie projektu „Aurami”.

1. Wysiew i inkubacja komórek
<ol>
	<li>Wysiać pojedyncze komórki, np. komórki glejaka U373-MG lub U-251-MG, z typową gęstością 100 cells/mm2 na szkiełku przedmiotowym i hodować je przez 48–72 hr w pożywce hodowlanej (np. RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej i antybiotyki) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Inkubować komórki z markerem błonowym, np. 6-dodekanoylo-2-dimetyloaminonaftaliną (laurdanem) przez 60 min w stężeniu 8 μM (w pożywce hodowlanej)4, lub markerem cytoplazmatycznym, np. octonianem kalceiny przez 40 min w stężeniu 5 μM3, lub związanym z błoną fotosensybilizatorem, np. protoporfiryną IX indukowaną poprzez 4 hr inkubacji z jej prekursorem, kwasem 5-aminolewulinowym (5-ALA; 1 mM)4,5.</li>
	<li>Przemyć komórki pożywką hodowlaną lub roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przed badaniem w mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
2. VA-TIRFM
<ol>
	<li>Należy użyć mikroskopu pionowego, np. Zeiss Axioplan, i zastąpić jego kondensor urządzeniem oświetleniowym, zgodnie z opisem w Ref. 3, z półkulowym lub półcylindrycznym pryzmatem szklanym sprzężonym optycznie z przedmiotnikiem (patrz Rycina 1).</li>
	<li>Należy zastosować równoległą kolimowaną wiązkę laserową, która po obrazowaniu przez pryzmat szklany i dalsze komponenty optyczne (np. zwierciadło wklęsłe) ponownie tworzy wiązkę równoległą na powierzchni próbki (promień źrenicy telecentrycznej). Należy zadbać, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania.</li>
	<li>Należy użyć regulowanego zwierciadła znajdującego się wewnątrz kondensora, które jest obrazowane w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania (promień obiektu). Regulowane zwierciadło może być napędzane silnikiem krokowym, gdzie każda pozycja odpowiada ściśle określonemu kątowi padania, wyznaczonemu za pomocą pomiarów goniometrycznych3.</li>
	<li>Należy skalibrować pozycję kątową regulowanego zwierciadła, przyjmując kąt krytyczny Θc=61.3° dla przejścia szkło-woda jako wartość stałą. Θc można zwizualizować podczas zmiany Θ, gdy w wodzie rozpuszczony jest barwnik fluorescencyjny (np. 1 mM mononukleotyd flawinowy, FMN). Pozycja zwierciadła dla Θ=Θc jest zapisywana w programie pozycjonowania zwierciadła.</li>
	<li>Należy ustawić parametry kamery (z podświetleniem tylnym Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, U.K.6), w tym temperaturę, wzmocnienie, czas rejestracji oraz prędkość przesunięcia.</li>
	<li>Należy użyć obiektywu o odpowiednim powiększeniu i najlepiej umiarkowanej aperturze numerycznej (np. 40×/0.75 lub 63×/0.90 w immersji wodnej) i zlokalizować przedmiotnik w mikroskopie. Należy zastosować olej immersyjny, aby zapewnić kontakt optyczny próbki z pryzmatem szklanym. Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjne identycznych próbek przy zmianie kąta oświetlenia (Θ≥Θc, gdzie Θc odpowiada 64.5° dla interfejsu komórka-szkło). Zaleca się zakres kątowy od 66° do 74° z krokiem 0.5° lub 1°. Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiedniego filtra długoprzepustowego lub pasmowo-przepustowego.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Odczytaj obrazy (np. (w formacie ASCII) zarejestrowane pod różnymi kątami Θ, a także ustawienia kamery (do dyskryminacji tła), długość fali wzbudzenia oraz współczynniki załamania światła dla szkła (n1 = 1,52) oraz komórek (n2 = 1,37) do programu ewaluacyjnego (LabView; NanoCell). Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji d(Θ) oraz współczynnik transmisji T(Θ) są obliczane automatycznie.</li>
	<li>Wybierz obrazy wykorzystane do oceny odległości między komórką a podłożem Δ zgodnie z równaniem 5 (marker błony) lub równaniem 4 (marker cytoplazmy). Można wykluczyć pojedyncze obrazy o niejednorodnym oświetleniu (wykazujące np. pasy).</li>
	<li>Oblicz obrazy topologii komórka-podłoże i wybierz odpowiedni kod kolorystyczny do wyświetlania. Podczas ewaluacji można wyświetlić profile poszczególnych pikseli, jak pokazano w Rysunek 2Profile te mogą służyć jako wskaźnik jakości dopasowania.</li>
	<li>Zarchiwizuj protokół oceny.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne eksperymenty są przeprowadzane z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych komórek glejaka U251-MG, udostępnionych przez prof. Jana Mollenhauera z Katedry Onkologii Molekularnej Uniwersytetu Południowej Danii w Odense. W dwóch subklonach tych komórek U251 geny supresorowe TP53 lub PTEN są nadeksprymowane przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Tet-On, w wyniku czego komórki te wykazują obniżony potencjał nowotworowy i mogą być uznane za mniej złośliwe. Jako kontrole wykorzystuje się silnie złośliwe komórki U251-MG pozbawione genu supresorowego, natomiast komórki U251-MG typu dzikiego służą do dalszych porównań. Jako źródło wzbudzenia zastosowano diodę laserową emitującą quasi-ciągłą serię impulsów pikosekundowych (LDH400 ze sterownikiem PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Niemcy; długość fali: 391 nm; energia impulsu: 12 pJ; częstotliwość repetycji: 40 MHz).
Na Rysunku 3 przedstawiono obrazy TIRFM komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53, inkubowanych z laurdanem (8 μM; 60 min), dla kątów padania 66,0°, 69,0° i 73,0°, co odpowiada głębokościom penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego wynoszącym odpowiednio około 140 nm, 75 nm i 60 nm. Wraz ze zmniejszeniem głębokości penetracji intensywność fluorescencji spada (patrz skale) i pochodzi z bardziej powierzchownych obszarów komórek (np. kontaktów ogniskowych na ich krawędziach). Odległości komórka-podłoże (zwizualizowane na Rysunku 3d za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie 0-600 nm) wykazują silne zróżnicowanie w obrębie komórek, od zaledwie kilku nanometrów (biało-żółte) do 250-300 nm (ciemnoczerwone), tzn. kontakty ogniskowe i większe odległości komórka-podłoże znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie. To samo dotyczy komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym PTEN (Rysunek 4d), podczas gdy odległości komórka-podłoże są raczej stałe dla kontrolnych komórek U251-MG oraz komórek typu dzikiego, z typowymi wartościami 80-100 nm (żółte; Rysunek 4b) i 150-200 nm (pomarańczowo-czerwone; Rysunek 4a).
<img alt="Optyczny układ mikroskopu; schemat drogi światła z lustrami, soczewką i pryzmatem do badań wzbudzenia." src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Urządzenie oświetleniowe dla VA-TIRFM w mikroskopie pionowym. Regulowane lustro napędzane silnikiem krokowym zapewnia rozdzielczość kątową ±0.25°.
<img alt="Wykres równowagi statycznej ln(I₀/T(ω)) w funkcji 1/d(θ) nm⁻¹ z dopasowaniem liniowym; analiza danych." src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Profil ewaluacji dla jednego piksela (schemat). Gdy ln[IF/T(Θ)] zostaje naniesiony jako funkcja 1/d(Θ), nachylenie reprezentuje odległość komórka-podłoże Δ. Nachylenie to jest zazwyczaj wyznaczane z precyzją wynoszącą około ±10%. Jedna wartość – wynikająca z niejednorodnego oświetlenia – została zaznaczona i wykluczona z ewaluacji.
<img alt="Analiza obrazowania mikroskopowego przedstawiająca dane dopasowania widmowego w skali szarości i na diagramach z kodowaniem kolorystycznym." src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Obrazy TIRFM komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53 po inkubacji z laurdanem (8 μM; 60 min) zarejestrowane pod różnymi kątami oświetlenia (a-c); odległości komórka-podłoże w zakresie 0-600 nm przedstawione za pomocą kodu kolorystycznego (d); długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Diagram rozkładu przestrzennego; pomiar nasycenia cieczą w ośrodkach porowatych, określony za pomocą skali kolorystycznej." src="/files/ftp_upload/4133/4133fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Odległości komórka-podłoże komórek glejaka U251-MG w zakresie 0-600 nm przedstawione za pomocą kodu kolorystycznego; (a) typ dziki (b) kontrole; (c) komórki z aktywowanym genem supresorowym TP53; (d) komórki z aktywowanym genem supresorowym PTEN; długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+reflection+microscopy%3A+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li>
<li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+%28I%29+Modelling+cell+contact+region+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li>
<li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%3A+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Opt.+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).</li>
<li>Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28VA-TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Pathol.+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li>
<li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device%3A+enhanced+sensitivity%2C+speed+and+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+with+continuous+wave+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li>
<li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li>
<li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitizers%3A+therapy+and+detection+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li>
<li>Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+microscopy%3A+technical+innovations+and+novel+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisano metodę pomiaru odległości między komórką a podłożem z precyzją nanometrową. Obecnie znaczne zainteresowanie budzą metody mikroskopii superrozdzielczej, np. oparte na oświetleniu strukturalnym7 lub detekcji pojedynczych cząsteczek8-10, a także mikroskopia z eliminacją emisji stymulowanej (STED)11. Żadna z tych technik nie pozwala jednak na uzyskanie rozdzielczości osiowej poniżej 50 nm. Ponadto w metodach detekcji pojedynczych cząsteczek wymagane jest dość wysokie natężeni...

Kiedy wiązka światła rozchodząca się w ośrodku o współczynniku załamania n1 napotyka granicę z drugim ośrodkiem o współczynniku załamania n2 &lt; n1, następuje całkowite wewnętrzne odbicie dla wszystkich kątów padania Θ, które są większe od kąta krytycznego Θc=arcsin(n2/n1). Pomimo całkowitego odbicia, padająca wiązka światła wzbudza ewanescentne pole elektromagnetyczne, które przenika do drugiego ośrodka i zanika wykładniczo wraz z odległością z prostopadłą do granicy ośrodków zgodnie z równaniem I(z) = I0 e-z/d(Θ). I(z) odpowiada natężeniu pola elektromagnetycznego, a d(Θ) głębokości wnikania dla długości fali λ, zgodnie z wzorem 
 
d(Θ) = (λ/4π) (n12 sin2Θ - n22)-1/2
Jak opisano w literaturze1,2, I0 odpowiada natężeniu światła padającego Ie pomnożonemu przez współczynnik transmisji T(Θ) oraz stosunek n2/n1. Jeśli wektor pola elektrycznego tej wiązki światła jest spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania (t.j. płaszczyzny wyznaczonej przez wiązkę padającą i odbitą), współczynnik transmisji ten jest określony wzorem 
 
T(Θ) = 4 cos2 Θ / [1 - (n2/nL1)2]
W przypadku natężenia fluorescencji wykrytego w pomiarach TIRFM, absorpcję światła należy zintegrować dla wszystkich warstw próbki i pomnożyć przez wydajność kwantową fluorescencji η odpowiedniego barwnika oraz przez kąt zbierania Ω. Jak zgłoszono wcześniej3, natężenie to można opisać wzorem 
 
IF (Θ) = A T(Θ)òc(z) e-z/d(Θ) dz
jeśli wszystkie czynniki niezależne od kąta padania Θ i współrzędnej z zostaną uwzględnione w stałej eksperymentalnej A. Równanie 3 można rozwiązać analitycznie, przyjmując, że stężenie c(z) fluoroforów jest niemal stałe
- we wszystkich współrzędnych z ≥ Δ, np. w cytoplazmie komórek znajdujących się w odległości Δ od powierzchni międzyfazowej. W takim przypadku całkę należy obliczyć od z= Δ do z= ∞, co daje wynik 
 
IF = A c T(Θ) d(Θ) e-Δ/d(Θ)
- lub między z = Δ - t/2 a z = Δ + t/2, t.j. w obrębie cienkiej warstwy o grubości t, np. błony komórkowej znajdującej się w odległości Δ od granicy faz. W takim przypadku intensywność fluorescencji może zostać obliczona jako 
 
IF = A c T(Θ) t e-Δ/d(Θ), 
 
jeśli t jest małe w porównaniu z Δ.
Z równań (4) i (5) można obliczyć odległości komórka-podłoże Δ, jeżeli obrazy natężenia fluorescencji IF zostaną zarejestrowane dla zmiennych kątów Θ, a wartość ln (IF / T d) (Równ. 4) lub ln (IF / T) (Równ. 5) zostanie wyznaczona jako funkcja 1/d dla tych kątów. W przypadku markera błonowego laurdan użytego w niniejszej pracy (patrz poniżej), analiza została przeprowadzona zgodnie z równaniem 5.
Jak zgłoszono wcześniej3, akwizycja i ocena obrazu wymagają 
- jednorodnego rozkładu światła wzbudzenia na próbce, 
- spełnienia założeń modelu 2-warstwowego (z współczynnikami załamania n1 i n2 odpowiednio dla podłoża i cytoplazmy). Warunek ten jest zachowany, jeżeli błona plazmatyczna jest bardzo cienka, a warstwa medium zewnątrzkomórkowego (pomiędzy komórką a podłożem) jest mała w porównaniu z długością fali światła padającego.
Dodatkowo, korzystne jest zastosowanie obiektywu mikroskopowego o umiarkowanej aperturze numerycznej (zazwyczaj A ≤ 0.90), aby uniknąć odchyleń jasności wynikających z anizotropii promieniowania w polu bliskim interfejsu dielektrycznego.

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td>Nunc</td><td>Nunc Cellstar&lt;br/&gt; QM1300SVBA</td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td><td>Holten Safe</td><td>S2010 1.2 EN GG 1LN</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + 10%FCS + 1 % penicylina / streptomycyna</td><td>BIOCHROM</td><td></td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Szklane przedmioty do mikroskopu</td><td>Marienfeld</td><td>Czyste białe szkło</td><td>Zastosowano specjalną procedurę czyszczenia</td></tr><tr><td>6-dodekanoil-2-dimetylamino naftalen (laurdan)</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Marker fluorescencyjny (roztwór zapasowy: 2 mM w etanolu)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioplan 1</td><td></td></tr><tr><td>Dioda laserowa</td><td>PicoQuant</td><td>LDH 400 ze sterownikiem PDL 800-B</td><td>Długość fali: 391 nm</td></tr><tr><td>System jednomodowego światłowodu</td><td>Point Source</td><td>kineFlex</td><td>Stosowany z optyką kolimującą</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>DV887DC</td><td>Kamera z podświetleniem tylnym</td></tr></tbody></table>

nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (va-tirfm)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Topologia powierzchni, np. komórek rosnących na podłożu, jest określana z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM). Komórki są hodowane na przezroczystych szkiełkach i inkubowane z markerem fluorescencyjnym homogenicznie rozmieszczonym w ich błonie plazmatycznej. Oświetlenie odbywa się za pomocą równoległej wiązki lasera pod zmiennymi kątami całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) o różnych głębokościach penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego. Rejestracja obrazów fluorescencji podczas naświetlania pod około 10 różnymi kątami pozwala na obliczenie odległości między komórką a podłożem z precyzją kilku nanometrów. W ten sposób określa się różnice w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, np. komórkami nowotworowymi a komórkami o mniejszej złośliwości. Dodatkowo można badać ewentualne zmiany adhezji komórkowej po działaniu chemicznym lub fotodynamicznym. W porównaniu z innymi metodami mikroskopii superrozdzielczej ekspozycja na światło jest utrzymywana na bardzo niskim poziomie, dzięki czemu nie spodziewa się uszkodzeń żywych komórek.

Topologię adhezji komórek do podłoża mierzy się z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM).

Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Topologia powierzchni, np. komórek rosnących na podłożu, jest określana z nanometrową precyzją za pomocą fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar topologii adhezji komórek do podłoża z nanometrową precyzją. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek na przezroczystych szkiełkach przedmiotowych i inkubację z markerem fluorescencyjnym. Następnie kalibrowana jest pozycja kątowa regulowanego lustra mikroskopu, a uzyskana wartość jest zapisywana w programie pozycjonowania lustra.Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie obrazów fluorescencyjnych po naświetlaniu pod około 10 różnymi kątami. Ostatnim etapem jest obliczenie odległości między komórką a podłożem z precyzją rzędu kilku nanometrów. Ostatecznie wyniki topologii adhezji komórek do podłoża są wykorzystywane do wykazania różnic w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, na przykład między komórkami nowotworowymi a komórkami o mniejszej złośliwości.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest fakt, że rzeczywista rozdzielczość mieści się w zakresie zaledwie kilku nanometrów. Chociaż metoda ta pozwala na badanie błon komórkowych, można ją również zastosować w innych układach, takich jak małe pęcherzyki lub nanomateriały.Eksperyment zaprezentuje nasza stażystka postdoctoralna Petra, która przygotuje próbki komórek, oraz nasz inżynier Michael Wagner, który przeprowadzi badanie. Aby przygotować komórki do mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem, należy wysiać pojedyncze komórki z gęstością 100 komórek na milimetr kwadratowy na szkiełku przedmiotowym w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotyki. Hodować komórki przez 72 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Następnie do komórek należy dodać fluorescencyjną membranę, marker 6D, decano 2, dimetyloaminonaftalen lub loran w stężeniu 8 µM w pożywce hodowlanej i inkubować przez 60 minut przed badaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki należy przemyć PBS, pipetując roztwór buforu nad szkiełkiem przedmiotowym w celu usunięcia pożywki, a następnie wytrzeć roztwór buforu z tylnej strony szkiełka. Do obrazowania pod różnymi kątami wykorzystuje się mikroskop odwrócony, taki jak Zeiss Axio plan, wyposażony w podświetlenie tylne i/lub kamerę exon E-M-C-C-D.W mikroskopii TIRFM kondensator zastępuje się specjalnie wykonanym urządzeniem oświetleniowym z półcylindrycznym pryzmatem szklanym sprzężonym optycznie z przedmiotowym szkiełkiem. Wiązka lasera pada z kolimowanego światłowodu jednomodowego, który po obrazowaniu przez pryzmat szklany i kolejne komponenty optyczne ponownie tworzy wiązkę równoległą na powierzchni próbki. Należy zadbać o to, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania.Pozycja ta jest zaznaczona na sprzęgaczu wyjściowym włókna. Należy użyć lustra regulowanego znajdującego się wewnątrz kondensora, który jest obrazowany w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania lub promienia przedmiotowego. Lustro regulowane może być napędzane silnikiem krokowym sterowanym przez oprogramowanie.Każda pozycja odpowiada ściśle określonymu kątom padania wyznaczonym za pomocą pomiarów z użyciem wzorca mierniczego. Aby skalibrować pozycję kątową regulowanego lustra, należy użyć barwnika fluorescencyjnego, takiego jak jeden milimolowy flawin nukleotyd rozpuszczony w wodzie. W celu wizualizacji kąta krytycznego przy zmianie kąta padania, jako stałą wartość przyjmuje się kąt krytyczny 61,3 stopni dla przejścia szkło-woda; pozycja kątowa lustra, przy której kąt padania jest równy kątowi krytycznemu, jest zapisana w programie pozycjonowania lustra.Za pomocą oprogramowania kamery należy ustawić parametry kamery E-M-C-C-D, w tym wzmocnienie temperatury, czas rejestracji oraz prędkość przesunięcia. Należy użyć olejku imersyjnego, aby zapewnić kontakt optyczny z próbką. Za pomocą pryzmatu szklanego należy wybrać obiektyw o powiększeniu odpowiednim dla badanych komórek i umiarkowanej aperturze numerycznej.Aby zwizualizować obiekt w mikroskopie, należy zastosować odpowiedni filtr długoprzepustowy lub pasmowy do detekcji fluorescencji. Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjne identycznych próbek przy zmianie kąta oświetlenia. Kąty padania powinny być równe lub większe od kąta krytycznego.Przy kącie krytycznym wynoszącym 64,5 stopnia dla interfejsu szkło-komórka, zaleca się zakres kątowy od 66 stopni do 74 stopni z krokiem 0,5 stopnia lub jednego stopnia. Aby rozpocząć analizę danych, należy użyć programu LabVIEW do odczytania obrazów zarejestrowanych pod różnymi kątami, a także ustawień kamery, długości fali wzbudzenia i współczynników załamania światła. Dla szkła, który wynosi 1,52, oraz komórek, który wynosi 1,37, ustawienia są importowane w celu prawidłowej oceny danych.Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji oraz współczynnik transmisji są obliczane automatycznie. Dla powodzenia procedury istotne jest, aby obrazy były starannie rejestrowane i wybrane do analizy. Należy wybrać obrazy służące do oceny odległości komórek od podłoża zgodnie z równaniem.W przypadku markerów błonowych można wykluczyć poszczególne obrazy o jednorodnym oświetleniu, tak jak pokazano w tym przykładzie. Należy obliczyć obrazy topologii podłoża komórkowego i wybrać odpowiedni kod kolorystyczny do wyświetlania podczas ewaluacji. Profile poszczególnych pikseli mogą być wyświetlane w sposób przedstawiony na tej figurze.Profile te mogą służyć jako wskaźnik jakości dopasowania. Na koniec należy zapisać protokół ewaluacji. Rysunek ten przedstawia obrazy całkowitego wewnętrznego odbicia komórek glejaka U2 51 z aktywnym genem supresorowym nowotworu TP 53.Po inkubacji z luan, przy pomiarach wykonanych pod różnymi kątami padania: 66 stopni, co odpowiada głębokości penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego wynoszącej około 140 nanometrów, 69 stopni, co odpowiada głębokości penetracji 75 nanometrów oraz 73 stopnie, co odpowiada głębokości penetracji 60 nanometrów, zaobserwowano, że wraz ze zmniejszaniem się głębokości penetracji intensywność fluorescencji spada, a sygnał pochodzi z bardziej powierzchownych obszarów komórek, takich jak kontakty ogniskowe na ich krawędziach. Odległości między komórkami a podłożem przedstawiono w Panelu D za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie od 0 do 600 nanometrów, jak pokazano tutaj.Odległości między komórkami a podłożem znacznie się różnią, przyjmując wartości od zaledwie kilku nanometrów (oznaczonych kolorem od białego do żółtego) do 250–300 nanometrów (oznaczonych kolorem ciemnoczerwonym). Wskazuje to na bliskie sąsiedztwo punktów kontaktu oraz obszarów o większej odległości komórek od podłoża. Podobną zmienność odległości między komórkami a podłożem obliczono dla komórek glejaka U2 51 mg z aktywnym genem supresorowym nowotworu P 10.W przeciwieństwie do tego, odległości między komórkami a podłożem są raczej stałe dla komórek kontrolnych U2 51 mg reprezentowanych przez kolor żółty oraz komórek typu dzikiego reprezentowanych przez kolory od pomarańczowego do czerwonego po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie topologii podłoża komórkowego do badania komórek nowotworowych i zmian morfologicznych po terapii laserowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wizualizować powierzchnie z rzeczywistą rozdzielczością w zakresie nanometrów przy niskiej ekspozycji na światło, która jest dobrze tolerowana przez organizmy żywe.

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nanotopologia adhezyjności komórkowej w świetle mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM)

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj nanotopologię adhezji komórek z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej VA-TIRFM. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary odległości komórka-podłoże z rozdzielczością nanometryczną i porównanie właściwości adhezyjnych różnych linii komórkowych.

Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Przeglądaj więcej filmów