Nanotopologia adhezji komórek w mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM)

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar topologii adhezji komórek na podłożu z dokładnością nanometrową. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek na przezroczystych szkiełkach i inkubację ich za pomocą markera fluorescencyjnego. Następnie kalibrowane jest położenie kątowe regulowanego zwierciadła mikroskopu, a pozycja jest zapisywana w programie pozycjonowania lustra.

Kolejnym krokiem jest zarejestrowanie obrazów fluorescencyjnych po naświetlaniu pod około 10 różnymi kątami. Ostatnim krokiem jest obliczenie odległości substratów komórkowych z dokładnością do kilku nanometrów. Ostatecznie wyniki topologii adhezji komórek na podłożu są wykorzystywane do pokazania różnic w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, na przykład komórkami nowotworowymi i mniej złośliwymi.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że rzeczywista rozdzielczość mieści się w zakresie zaledwie kilku nanometrów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w błony komórkowe. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak małe pęcherzyki lub nanomateriały.

Demonstracją eksperymentu będzie nasz postdoc Petra, która przygotuje próbki komórek i nasz inżynier, Michael Wagner, który przeprowadzi eksperyment Aby przygotować komórki do zmiennego kąta, całkowitego wewnętrznego odbicia. Mikroskopia fluorescencyjna wysiewa pojedyncze komórki o gęstości 100 komórek na milimetr kwadratowy na szkiełku podstawowym w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% cielęcym płodem, surowicą i antybiotykami. Hoduj komórki przez 72 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie nałóż na komórki błonę fluorescencyjną, marker szósty D, dekan dwa, dimetyloaminonaftalen lub loran w stężeniu ośmiu mikromolów w hodowli, pożywkę inkubować przez 60 minut przed mikroskopią fluorescencyjną. Umyj komórki PBS, odpipetuj roztwór buforowy na szkiełku przedmiotowym, aby usunąć pożywkę, a następnie zetrzyj roztwór buforowy z tyłu szkiełka z przedmiotu. Mikroskop pionowy, taki jak plan Zeiss Axio, wyposażony w kamerę E-M-C-C-D z podświetleniem wstecznym i/lub eksonem, służy do zmiany kąta.

T-I-R-F-M zastępuje kondensator wykonanym na zamówienie urządzeniem oświetleniowym z cylindrycznym szklanym pryzmatem hemi optycznie sprzężonym ze zjeżdżalnią obiektu. Wiązka laserowa pada na magazynkowane światłowód monomodowy, który po zobrazowaniu przez szklany pryzmat i dalsze elementy optyczne, ponownie powoduje powstanie równoległej wiązki na powierzchni próbki. Zwróć uwagę, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany, prostopadły do płaszczyzny padzenia.

Ta pozycja jest oznaczona na łączniku wyjściowym światłowodu. Użyj regulowanego lustra umieszczonego wewnątrz kondensatora, które jest obrazowane w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania lub promieniowania obiektu. Lusterko regulowane może być napędzane silnikiem krokowym, który jest sterowany przez oprogramowanie.

Każda pozycja odpowiada dobrze zdefiniowanemu kątowi incydentów, określonemu przez pomiary przeprowadzone za pomocą metryki Go. Aby skalibrować położenie kątowe regulowanego lustra, użyj barwnika fluorescencyjnego, takiego jak jeden milimolowy nukleotyd flawinowy, rozpuszczony w wodzie. Aby zobrazować kąt krytyczny po zmianie kąta padzenia, użyj kąta krytycznego 61,3 stopnia dla przejścia szklanej wody jako wartości stałej, położenie kątowe lustra, przy którym kąt zdarzeń jest równy kątowi krytycznemu, jest przechowywane w programie pozycjonowania lustra.

Korzystając z oprogramowania aparatu, ustaw parametry kamery E-M-C-C-D, w tym przyrost temperatury, czas nagrywania i prędkość zmiany biegów. Użyj olejku immersyjnego, aby zapewnić kontakt optyczny próbki. Za pomocą szklanego pryzmatu wybierz soczewkę obiektywu o odpowiednim powiększeniu dla komórek i umiarkowanej aperturze numerycznej.

Aby uwidocznić obiekt w mikroskopie, należy użyć odpowiedniego filtra długoprzepustowego lub pasmowoprzepustowego do wykrywania fluorescencji. Rejestruj obrazy fluorescencyjne identycznych próbek po zmianie kąta oświetlenia. Kąty zdarzeń powinny być takie same lub większe niż kąt krytyczny.

Przy kącie krytycznym odpowiadającym 64,5 stopnia dla interfejsu szkła komórkowego zalecany jest zakres kątowy od 66 stopni do 74 stopni z krokami co 0,5 stopnia lub jeden stopień. Aby rozpocząć analizę danych, użyj programu Lab View, aby odczytać obrazy zarejestrowane pod różnymi kątami, a także ustawienia kamery, długość fali wzbudzenia i współczynniki załamania światła. W przypadku szkła (wartość 1,52) i komórek (wartość 1,37) ustawienia są importowane w celu prawidłowej oceny danych.

Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji i współczynnik transmisji są obliczane automatycznie dla powodzenia zabiegu. Ważne jest, aby obrazy były starannie rejestrowane i wybierane do analizy. Wybierz obrazy używane do oceny odległości substratów komórkowych zgodnie z równaniem.

W przypadku markera membranowego można wykluczyć pojedyncze obrazy w jednorodnym oświetleniu, takie jak pokazane w tym przykładzie. Oblicz obrazy topologii podłoża komórkowego i wybierz odpowiedni kod kolorystyczny do wyświetlenia podczas oceny. Profile poszczególnych pikseli mogą być wyświetlane tak, jak pokazano na tym rysunku.

Profile te mogą być używane jako wskaźnik jakości dopasowania. Na koniec zapisz protokół oceny. Rysunek ten przedstawia obrazy całkowitego wewnętrznego odbicia komórek glejaka U2 51 mg z aktywowanym genem supresorowym guza TP 53.

Po inkubacji z luanem zarejestrowano pod różnymi kątami padających, 66 stopni odpowiada głębokości penetracji ulotnego pola elektromagnetycznego wynoszącej około 140 nanometrów, 69 stopni, co odpowiada głębokości penetracji 75 nanometrów i 73 stopnie odpowiadającej głębokości penetracji 60 nanometrów ze zmniejszającą się penetracją. Fluorescencja głębi zmniejsza intensywność i pochodzi z bardziej powierzchownych miejsc komórek, takich jak styki ogniskowe na ich krawędziach. Odległości substratów komórkowych są przedstawione w panelu D za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie od zera do 600 nanometrów, jak pokazano tutaj.

Odległości substratów komórkowych różnią się znacznie w komórkach, od zaledwie kilku nanometrów reprezentowanych przez biały do żółtego i od 250 do 300 nanometrów reprezentowanych przez ciemną czerwień. Oznacza to, że kontakty ogniskowe i większe odległości między substratami komórkowymi znajdują się w bliskim sąsiedztwie. Podobną zmienność odległości substratów komórkowych oblicza się dla komórek glejaka U2 51 mg z aktywowanym genem supresorowym P 10.

W przeciwieństwie do tego, odległości substratów komórkowych są raczej stałe dla komórek kontrolnych U2 51 mg reprezentowanych przez komórki typu żółtego i dzikiego reprezentowanych przez kolor pomarańczowy do czerwonego Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się topologią substratów komórkowych do badania komórek nowotworowych i zmian morfologicznych po terapii laserowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować powierzchnie z rzeczywistą rozdzielczością w zakresie nanometrów przy słabym oświetleniu, co jest dobrze tolerowane przez organizmy żywe.