Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych metodą lipidową Bicelle

Ten film zademonstruje metodę przeprowadzania wysokoprzepustowych prób krystalizacji oczyszczonych białek błonowych przy użyciu lipikowych komórek B. Pierwsze limfocyty B są przygotowywane przez zmieszanie lipidu i oczyszczonego detergentem białka błonowego jest włączane do mieszaniny komórek B, a próby krystalizacji są przeprowadzane przy użyciu kontroli wizualnej robota o pojemności nanolitrów. Użycie standardowego mikroskopu świetlnego ujawnia obecność kryształów.

Po uformowaniu kryształy białka można wyekstrahować i zamrozić w celu zebrania danych i ustrukturyzowanego oznaczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki unikalnemu zachowaniu fazowemu limfocytów B, do krystalizacji można wykorzystać standardowy sprzęt i robotykę dostępną w laboratorium. Konfiguracja komórek B jest tak prostą techniką i pozwala na wyjęcie docelowego białka błonowego z detergentu w komórce i umieszczenie go w podłożu lipicowym.

Daje to zupełnie nowy zestaw warunków do przesiewania. Jest to tak prosta metoda, która została z powodzeniem zastosowana na wielu białkach błonowych, że po prostu nie ma powodu, aby jej nie wypróbować. Pierwszym krokiem w krystalizacji opartej na komórkach B jest przygotowanie mieszaniny amphi lipidowej tworzącej komórkę B.

Proces ten wymaga znacznego wysiłku i jest najbardziej czasochłonny. Pamiętaj, że może to potrwać kilka godzin. Limfocyty B mogą tworzyć się w różnych kombinacjach amphi lipidowych i w szerokim zakresie stężeń.

Aby zapoznać się z sugerowanymi punktami wyjścia, patrz tabela pierwsza w dołączonym pisemnym protokole, zacznij od przygotowania jednego mililitra 35% mieszaniny kapso DMPC w stosunku 2,8 do jednego mola. Aby to zrobić, odważ 0,26 grama DMPC i 0,09 grama Chapo w probówce. Doprowadzić objętość do 1,0 mililitra za pomocą wody dejonizowanej, odwirować mieszaninę.

Następnie podgrzej mieszaninę do około 40 stopni Celsjusza w łaźni wodnej, aż stanie się żelowata. Umieść rurkę na lodzie. Próbka powinna ponownie stać się płynna.

Następnie ponownie wiruj przez kilka minut, kontynuuj cykliczne przechodzenie przez etapy rozgrzewania, chłodzenia i wirowania, aż lipid całkowicie się rozpuści. Należy pamiętać, że w miarę wykonywania większej liczby cykli mieszanina może stać się mętna po schłodzeniu po zakończeniu. Mieszanina będzie przezroczystym żelem o temperaturze pokojowej lub wyższej, a lepką ciecz na lodzie przez komórki można umieścić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Następnie oczyszczone białka są włączane do pożywki komórek B. Jest to prosty proces i powinien być wykonany tego samego dnia, co krystalizacja, która jest pokazana w następnej części filmu. Rozmrażać mieszaninę komórek B kapso DMPC w temperaturze pokojowej, aż faza zmieni się w klarowny żel.

Umieść mieszaninę na lodzie, aby ją upłynnić, a następnie krótko ją zawiruj, aby przywrócić jednorodną fazę komórek B. Od tego momentu trzymaj mieszaninę komórek B i oczyszczone białko na lodzie. Dzięki temu komórka B pozostanie w fazie ciekłej, dzięki czemu będzie podatna na pipetowanie.

Następnie dodaj mieszaninę komórek B do oczyszczonego białka rozpuszczonego w detergentzie w stosunku od jednego do czterech, objętość do objętości. Następnie delikatnie pipetować w górę i w dół, aż roztwór stanie się klarowny i jednorodny. Jeśli pojawią się bąbelki, na chwilę odkręć je w wirówce stołowej.

Inkubować mieszaninę na lodzie przez co najmniej 30 minut, aby ułatwić całkowite włączenie białka do komórek. Mieszanina białek przez komórki jest teraz gotowa do prób krystalizacji. Próby krystalizacji zostaną zademonstrowane przy użyciu robota krystalizującego komary.

Ostudzić, 96-dołkową dolną płytkę w kształcie litery V, umieszczając ją na lodzie. Odpipetować mieszaninę białko po komórce do płytki, aby upewnić się, że lepkość roztworu jest minimalna. Trzymaj mieszaninę białko po komórce na lodzie do ostatniego etapu.

Zastosowany tutaj robot ma pięć platform. Umieścić mikropłytkę zawierającą zbiornik na platformie trzeciej, a pokrywę do krystalizacji, na którą będą dozowane krople, na platformie piątej. Następnie umieść białko na płytce komórkowej na platformie czwartej najbliżej pozycji dozowania.

Gwarantuje to, że mieszanina białek przez komórki jest ostatnią, która jest pobierana przez robota i jest natychmiast uwalniana. Za pomocą oprogramowania zainicjuj bieg, robot podniesie roztwór zbiornika, a następnie mieszaninę białek po komórkach i dozuje je na pokrywkę w postaci kropli, aby zapobiec nagrzewaniu się i zwiększonej lepkości podczas dozowania. Nie programuj komara tak, aby mieszał zbiornik z mieszaniną białko po komórce, gdy tylko bieg zostanie zakończony.

Wyjmij płytkę z białkiem kupna komórki z instrumentu i umieść ją na lodzie. Zdejmij pokrywkę z instrumentu i umieść ją na płytce zawierającej roztwór zbiornika tak, aby krople zostały odwrócone. Inkubować płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Należy pamiętać, że inne temperatury mogą być również testowane pod kątem tworzenia i optymalizacji kryształów. Wyższe temperatury indukują fazę blaszkową, która ma tę zaletę, że przed lub organizuje białko w warstwy. Można badać temperatury od czterech stopni Celsjusza do 20 stopni Celsjusza.

Temperatury poniżej czterech stopni Celsjusza mogą powodować wytrącanie się lipidów przez dłuższy czas w pierwszym, trzecim dniu, a następnie co tydzień, oceń wygląd i wzrost kryształów za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego. Pokazano tutaj obraz w jasnym polu i obraz UV kryształów w kształcie igieł obserwowanych w warunkach tylko ataku. Fluorescencja nie została wykryta w kryształach, co wskazuje na fałszywy alarm na tym obrazie.

Kryształ w kształcie pręta powstał, gdy jako środek strącający zastosowano diol metylu propanu. Kryształ fluoryzuje co tydzień, co wskazuje, że może to być kryształ białkowy, ale za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej okazało się, że nie jest on trwały. Pokazany tutaj jest kryształ zaobserwowany około cztery tygodnie po rozpoczęciu prób.

Silna fluorescencja w świetle UV potwierdza, że jest to kryształ białka. Jak oglądałeś na tym filmie. Gdy limfocyty B są dostępne, można je bezpośrednio zmieszać z oczyszczonym białkiem i od tego momentu krystalizacja przebiega prawie dokładnie tak, jak standardowe protokoły oparte na detergentach.

Kolejną wyraźną zaletą jest możliwość domieszkowania komórek B określonymi lipidami w celach optymalizacyjnych. Technika ta jest naprawdę bardzo wszechstronna i jest tak prosta w użyciu, że powinna być wypróbowana we wszystkich projektach krystalizacji białek błonowych.