Name: Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych metodą lipidową Bicelle (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową krystalizację białek błonowych metodą lipidowych bicelli. Technika ta umożliwia wykorzystanie standardowego sprzętu laboratoryjnego do efektywnego uzyskiwania kryształów białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Jamesowi Bowie i dr. Salemowi Fahamowi za zapewnienie wiedzy technicznej oraz wskazówek dotyczących metody biceli, a także dr. Aviv Paz za pomocne dyskusje. Dziękujemy Le Du za wsparcie eksperymentalne. Rachna Ujwal posiada interes finansowy w firmie MemX Biosciences LLC, która jednak nie wspierała niniejszych prac. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantów NIH (RO1 GM078844).

Krystalizacja oparta na bicelach składa się z czterech podstawowych etapów (Rysunek 2): i) przygotowania mieszaniny lipidu i amfifila tworzącej bicele; ii) wprowadzenia oczyszczonego białka do ośrodka z bicelami; iii) prób krystalizacji (manualnie lub robotycznie); oraz iv) wizualizacji, ekstrakcji kryształów i zamrażania. Kroki te zostały szczegółowo opisane poniżej
1. Przygotowanie biceli
Bicele mogą powstawać w różnych kombinacjach lipidów i amfifili oraz w szerokim zakresie stężeń. Dlatego zaleca się zastosowanie składu początkowego opartego na wcześniej sprawdzonych warunkach (Tabela 1). Najskuteczniejszą mieszanką jest formulacja biceli DMPC:CHAPSO, którą można nabyć w handlu jako gotowy, wymieszany preparat (patrz Tabela odczynników poniżej) lub przygotować w laboratorium zgodnie z opisem. W ramach tego ćwiczenia przygotujemy 1 ml 35% mieszaniny DMPC:CHAPSO w stosunku molowym 2,8:1.
<ol>
 <li>Odważyć 0,26 g DMPC (Mr 67,9 g/mol), 0,09 g CHAPSO (Mr 630,9 g/mol) i dodać wodę dejonizowaną do uzyskania końcowej objętości 1,0 ml.
 <ul type="disc">
 <li>Procentowa zawartość biceli może wynosić od 10% do 40% przy stosunku molowym DMPC:CHAPSO w zakresie 2,6-3,0:1 (Tabela 1).</li>
 <li>Uwaga: Im wyższe stężenie biceli, tym trudniej rozpuścić lipid, co skutkuje wyższą lepkością roztworu. Jednak skoncentrowana formulacja biceli może być korzystna w przypadku niskiego stężenia białka.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Rozpuszczenie lipidu w celu uzyskania homogennego roztworu wymaga znacznego nakładu pracy, co sprawia, że ten etap jest najbardziej czasochłonny w metodzie biceli. Powtarzać następujące kroki aż do całkowitego wymieszania DMPC:
 <ol>
 <li>Podgrzać mieszaninę do ~40°C w kąpieli wodnej lub inkubatorze i mieszać w vortexie przez ~1 minutę.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: Wraz z kolejnymi cyklami podgrzewanie mieszaniny może prowadzić do powstania konsystencji żelowej, co utrudnia mieszanie w vortexie.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Schłodzić mieszaninę na lodzie i mieszać w vortexie przez kilka minut. Chłodzenie pomaga upłynnić roztwór, co ułatwia mieszanie w vortexie.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: W miarę powtarzania cykli mieszanina może stać się mętna podczas chłodzenia.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Powtarzać powyższe kroki (1.2.1 i 1.2.2) aż do całkowitego rozpuszczenia lipidu.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: Proces ten może trwać kilka godzin. Formowanie się biceli jest sygnalizowane przez zmiany w zachowaniu fazowym formulacji DMPC:CHAPSO. Po zakończeniu procesu mieszanina będzie miała postać przejrzystego żelu w temperaturze pokojowej lub wyższej oraz lepki ciecz na lodzie.</li>
 </ul>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Mieszanina biceli jest teraz gotowa do użycia i może być przechowywana w temperaturze -20°C w celu długoterminowego magazynowania (do 5 lat). Ze względu na ryzyko hydrolizy grupy głowy fosfolipidu nie zaleca się przechowywania biceli w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas.</li>
</ol>
2. Inkorporacja białka do biceli
Większość struktur białek błonowych (MP) uzyskanych z biceli została skrystalizowana przy stężeniu biceli DMPC:CHAPSO w zakresie od 2 do 8%, stosując stężenie białka od 8 do 12 mg/ml (Tabela 1). Jeśli to możliwe, wstępne przesiewy powinny być przeprowadzane zgodnie z tymi wytycznymi, a dodatkowe stężenia mogą być testowane na etapie optymalizacji. W porównaniu z metodą LCP, wprowadzanie białka do biceli jest prostym procesem (Rysunek 3), który należy przeprowadzić w tym samym dniu, co próby krystalizacji.
<ol>
 <li>Rozmrozić mieszaninę biceli DMPC:CHAPSO w temperaturze pokojowej, aż do zmiany fazy w przejrzysty żel.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie wpływa na właściwości biceli.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Umieścić mieszaninę w lodzie w celu upłynnienia i krótko wymieszać w wortexie, aby przywrócić jednorodną fazę biceli. Po umieszczeniu w lodzie mieszanina może stać się mętna.</li>
 <li>Od tego momentu mieszaninę biceli oraz oczyszczone białko należy przechowywać w lodzie. Pozwoli to utrzymać bicele w fazie ciekłej, co ułatwi pipetowanie.</li>
 <li>Dodać mieszaninę biceli do oczyszczonego białka rozpuszczonego w detergencie w stosunku 1:4 (V/V).
 <ul type="disc">
 <li>Na przykład: 10 μl mieszaniny białko-bicela otrzymuje się poprzez zmieszanie 80 μl białka z 20 μl biceli. Jeśli stężenie białka wynosi 15 mg/ml, a stężenie biceli 35%, otrzymana zostanie mieszanina białka wbudowanego w bicele o stężeniu białka 12 mg/ml i stężeniu biceli 7%.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Wymieszać, delikatnie pipetując zawartość w górę i w dół, aż roztwór stanie się przejrzysty i jednorodny.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: W przypadku pojawienia się pęcherzyków powietrza można je usunąć poprzez krótkie wirowanie (30-60 sekund, 1300 rpm, 4°C) w wirówce stołowej.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Inkubować mieszaninę w lodzie przez co najmniej 30 min, aby umożliwić pełną inkorporację białka do biceli. Mieszanina białko-bicela jest teraz gotowa do prób krystalizacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie prób krystalizacji
Inne techniki krystalizacji lipidowej, takie jak LCP, wymagają specjalistycznego sprzętu ze względu na wysoką lepkość medium; jednak unikalne zachowanie fazowe biceli pozwala na ich zastosowanie w praktycznie każdym standardowym formacie krystalizacji, w tym w systemach zrobotyzowanych (Rysunek 3). Próby krystalizacji można przeprowadzać w formacie kropli wiszącej lub siedzącej, wykorzystując standardowe, dostępne komercyjnie ekrany.
<ol>
 <li>Niezależnie od tego, czy tacki są przygotowywane ręcznie, czy przy użyciu robota do krystalizacji, mieszaninę białko-bicelle należy utrzymywać na lodzie. Zapobiegnie to ogrzaniu mieszaniny białko-bicelle i zapewni minimalną lepkość roztworu.</li>
 <li>Ręczne próby krystalizacji – przy użyciu standardowej pipety mieszaninę białko-bicelle można mieszać z roztworem z rezerwuaru w ten sam sposób, w jaki wykonuje się to zazwyczaj w przypadku białek rozpuszczalnych lub białek błonowych solubilizowanych detergentem.
 <ul type="disc">
 <li>Uwaga: Podczas prób należy utrzymywać mieszaninę białko-bicelle na lodzie.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Robotyczne próby krystalizacji – próby te zostały dostosowane do robota do krystalizacji Mosquito, jednak w zasadzie (przy zachowaniu tych samych środków ostrożności) technika ta powinna być kompatybilna ze wszystkimi robotami do krystalizacji. Poniższe wskazówki zapewnią, że mieszanina białko-bicelle pozostanie chłodna i zostanie precyzyjnie pobrana przez robota:
 <ol>
 <li>Wychłodzić płytkę z mieszaniną białko-bicelle, umieszczając ją na lodzie.</li>
 <li>Napippetować mieszaninę białko-bicelle do płytki i nadal utrzymywać płytkę na lodzie. Płytka ta powinna być ostatnim elementem umieszczonym w robocie przed rozpoczęciem cyklu.</li>
 <li>Ustawić tackę z rezerwuarami oraz pokrywy do krystalizacji odpowiednio na platformach 3 i 5 robota Mosquito.</li>
 <li>Umieścić płytkę zawierającą mieszaninę białko-bicelle na platformie 4 robota Mosquito. Zapewnia to, że mieszanina białko-bicelle zostanie pobrana przez robota jako ostatnia i natychmiast wydispensowana.</li>
 <li>Aby zapobiec nagrzewaniu i zwiększeniu lepkości, nie należy mieszać rezerwuaru z mieszaniną białko-bicelle.</li>
 <li>Przy przeprowadzaniu wielu przesiewów, niezwłocznie po zakończeniu cyklu należy zwrócić płytkę z bicellami i białkiem na lód w celu schłodzenia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Objętość kropli oraz stosunek (białko:rezerwuar) można dobrać analogicznie do konwencjonalnych prób krystalizacji. Na przykład początkowe próby krystalizacji z użyciem robota Mosquito można przygotować, stosując 0.25 μl mieszaniny białko:bicelle oraz 0.25 μl roztworu z rezerwuaru.</li>
 <li>Próbki do krystalizacji należy inkubować w komorze w temperaturze 20°C. Temperatura jest dobrym parametrem przesiewowym i optymalizacyjnym, ponieważ zachowanie fazowe bicelli zależy od temperatury.
 <ul type="disc">
 <li>Wyższe temperatury indukują fazę lamelarną12 (Rysunek 1), co ma tę zaletę, że białko jest wstępnie organizowane w warstwy. Można testować temperatury poniżej 20°C, jednak nie należy schodzić poniżej 4°C, ponieważ może to spowodować wytrącanie się lipidów w dłuższym okresie czasu.</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Podobnie jak w przypadku tradycyjnych prób krystalizacji, próby z bicellami należy regularnie monitorować pod kątem pojawienia się i wzrostu kryształów. Zalecamy sprawdzanie tacek w 1.st i 3.rd dobie po przygotowaniu, a następnie inspekcję w odstępach tygodniowych.</li>
 <li>Optymalizację kryształów można przeprowadzić, stosując metody rutynowo używane dla kryształów opartych na detergentach, w tym przesiewy siatkowe (grid screening), przesiewy dodatków, zmianę temperatury itp. Dodatkowo można zmieniać procentową zawartość bicelli oraz stosunek białko:bicelle. Co więcej, bicelle można domieszkować specyficznymi lipidami, które mogą być niezbędne dla stabilności lub funkcji białka.</li>
</ol>
4. Wizualizacja, ekstrakcja kryształów i mrożenie
Ponieważ próby krystalizacji z mieszaniną białko-bicela wykazują lepkość zbliżoną do kropli białko-detergent, wizualizacja i ekstrakcja kryształów są rutynowe i przeprowadzane zgodnie z tradycyjnymi ustawieniami.
<ol>
 <li>Wizualizacja: W przeciwieństwie do mediów LCP, które często wymagają wysokiej jakości oświetlenia w świetle zwykłym i spolaryzowanym do detekcji kryształów, wizualizacja w przypadku biceli nie jest utrudniona. Kolorowe, jak i bezbarwne krople kryształów białkowych mogą być łatwo analizowane przy użyciu standardowych mikroskopów i nie jest wymagany żaden specjalistyczny sprzęt.</li>
 <li>Bicele, podobnie jak inne media lipidowe, mają tendencję do generowania wysokiego odsetka wyników fałszywie dodatnich. Mikroskop UV znacznie ułatwia odróżnienie kryształów białek od kryształów soli (Rycina 4).</li>
 <li>Ekstrakcja i mrożenie: Ekstrakcja i mrożenie kryształów są stosunkowo proste i nie wymagają rozpuszczania otaczającego medium bicelowego. Dodatkowo sama faza bicelowa zapewnia umiarkowaną krioprotekcję.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Zazwyczaj pojawienie się kryształów zajmuje od 2 do 3 dni, a ich wzrost do maksymalnych rozmiarów trwa około tygodnia lub dłużej. Tak było w przypadku kryształów bakteriorhodopsyny oraz mysiego napięciowo zależnego kanału anionowego 1 (mVDAC1)4,8. W przypadku innych białek błonowych wzrost kryształów może trwać kilka tygodni, dlatego ważne jest monitorowanie prób krystalizacji znacznie dłużej niż przez pierwsze tygodnie.
Podobnie jak w przypadku innych mediów lipidowych, bicelle wykazują tendencję do tworzenia kształtów, które mogą sprawiać wrażenie krystalicznych. Zaobserwowano również, że prowadzi to do powstania większego odsetka kryształów soli i detergentów. Mikroskop UV wykrywający fluorescencję tryptofanu może znacząco pomóc w wyeliminowaniu takich białkowych wyników fałszywie dodatnich. Rysunek 4 przedstawia kształty lipidów, kryształy soli i białek w świetle widzialnym oraz UV, co ułatwia rozróżnienie różnych obserwowanych rezultatów.
<img alt="Schemat samoorganizacji dwuwarstwy DMPC i miceli CHAPSO tworzących bicelle, przejście do fazy lamellarnej." src="/files/ftp_upload/3383/3383fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Schemat biceliBicele składają się z cząsteczek lipidów tworzących dwuwarstwę, takich jak DMPC (kolor niebieski), oraz amfifila, takiego jak CHAPSO (kolor zielony), który chroni hydrofobowe krawędzie dwuwarstwy. Wraz ze wzrostem temperatury bicele o kształcie dysków przechodzą transformację fazową w perforowaną warstwę lamelarną.12.
<img alt="Schemat procesu krystalizacji białek w bicelach: przygotowanie, inkorporacja, próby, wizualizacja." src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Schemat blokowy metody krystalizacji w bicelach, przedstawiający cztery podstawowe kroki.
<img alt="Schemat procesu krystalizacji białka z białkiem solubilizowanym detergentem, bicele; próby zrobotyzowane." src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Schemat przygotowania prób krystalizacji. Oczyszczone białka błonowe rozpuszczone w detergencie można mieszać bezpośrednio z bicelami w temperaturze 0°C, po prostu pipetując obie zawartości razem. Po inkubowaniu mieszaniny białka z bicelami w temperaturze 0°C przez około 30 minut, można przygotować próby krystalizacji, stosując dowolny standardowy format, w tym z wykorzystaniem robotyki.
<img alt="Proces krystalizacji białek; obrazy z mikroskopii świetlnej i UV, analiza formowania się kryształów." src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Wizualizacja prób krystalizacji. Obraz widoczny (górny panel) oraz obraz UV (dolny panel) z (A) Kryształy w kształcie igieł zaobserwowane w warunkach zawierających wyłącznie sól. W przypadku kryształów tych nie stwierdzono fluorescencji, co wskazuje na wynik fałszywie dodatni. (B) Kryształ w kształcie pręta utworzony w warunkach MPD. Kryształ wykazywał słabą fluorescencję, jednak za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej stwierdzono, że nie jest on białkowy. (C) Kryształ zaobserwowany około czterech tygodni po przygotowaniu prób. Silna fluorescencja pod światłem UV potwierdza, że jest to kryształ białka.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nie.</td>
 <td>Białko</td>
 <td>Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.</td>
 <td>Przygotowanie biceli</td>
 <td>Stężenie białka</td>
 <td>Detergent1</td>
 <td>Rozdzielczość (Å)</td>
 <td>Bibliografia</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>Bakteriorodopsyna2</td>
 <td>Halobacterium salinarum</td>
 <td>8% DMPC:CHAPSO (2,8:1)</td>
 <td>8 mg/ml</td>
 <td> </td>
 <td>2.0</td>
 <td>Faham i Bowie, 2002</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>8% DTPC:CHAPSO (3:1)</td>
 <td>8 mg/ml</td>
 <td> </td>
 <td>1.8</td>
 <td>Faham it al., 2005</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>Kompleks receptora β2-adrenergicznego/Fab</td>
 <td>Homo sapiens</td>
 <td>8,3% DMPC:CHAPSO (3:1)</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 <td>DDM</td>
 <td>3.4/3.7</td>
 <td>Rasmussen i wsp., 2007</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>Napięziozależny kanał anionowy 1</td>
 <td>Mus musculus</td>
 <td>7% DMPC:CHAPSO (2,8:1)</td>
 <td>12 mg/ml</td>
 <td>LDAO</td>
 <td>2.3</td>
 <td>Ujwal i in., 2008</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>Xanthorhodopsyna</td>
 <td>Salinibacter ruber</td>
 <td>4,2% DMPC, 5% NM</td>
 <td>4 mg/ml</td>
 <td>DDM</td>
 <td>1.9</td>
 <td>Luecke it al., 2009</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>Proteaza romboidalna</td>
 <td>Escherichia coli</td>
 <td>2% DMPC:CHAPSO (2,6:1)</td>
 <td>9 mg/ml</td>
 <td>Nonyloglukozyd</td>
 <td>1.7</td>
 <td>Vinothkumar, 2011</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
1 Detergent używany do oczyszczania białek błonowych 
2 Naturalne lipidy z purpurowych błon mogą być przenoszone podczas procesu oczyszczania
Tabela 1. Podsumowanie warunków krystalizacji dla struktur białek błonowych rozwiązanych z wykorzystaniem biceli.

<ol><li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phases%3A+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+Monoacylglycerols%3A+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li>
<li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li>
<li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li>
<li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin%2C+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li>
<li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+%C3%85+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+%5Bbgr%5D2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li>
<li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering%3A+a+new+model+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Bicele to unikalne media lipidowe, które zapewniają środowisko przypominające natywną dwuwarstwę, zachowując się jednocześnie tak, jakby były solubilizowane przez detergenty. Właściwość ta daje bicelem wyraźną przewagę nad innymi lipidowymi metodami krystalizacji, ponieważ technika ta nie wymaga okresu nauki ani specjalistycznego sprzętu. Po uzyskaniu bicele – zarówno komercyjnych, jak i przygotowanych w laboratorium – można je bezpośrednio mieszać z oczyszczonym białkiem, a od tego momentu próby krystalizacji przebiegaj...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Affymetrix</td><td>D514</td><td></td></tr><tr><td>CHAPSO</td><td>Affymetrix</td><td>C317</td><td></td></tr><tr><td>Gotowe do użycia biczele</td><td>MemX Biosciences</td><td>MX201001/MX201002</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany krystalizacji</td><td>Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>Do wstępnych badań można wykorzystać standardowe, dostępne komercyjnie ekrany</td></tr><tr><td>Ustawienie krystalizacji</td><td></td><td></td><td>Można wykorzystać standardowe ustawienie manualne i/lub robotyczne dostępne w laboratorium.</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Białka błonowe (MPs) odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak pompowanie określonych cząsteczek przez nieprzepuszczalną w innym przypadku dwuwarstwę błoniową otaczającą wszystkie komórki i organelle. Zmiany w funkcji białek błonowych prowadzą do wielu ludzkich chorób i zaburzeń; w związku z tym szczegółowe zrozumienie ich struktur pozostaje kluczowym celem badań biologicznych. Jednakże wyznaczanie struktury białek błonowych wciąż stanowi znaczne wyzwanie, wynikające często z ich hydrofobowości.
Białka błonowe (MP) posiadają rozległe regiony hydrofobowe osadzone w dwuwarstwie. Detergenty są często stosowane w celu solubilizacji tych białek z dwuwarstwy, co prowadzi do powstania miceli białkowo-detergentowej, którą można następnie modyfikować w sposób podobny do białek rozpuszczalnych. Tradycyjnie próby krystalizacji prowadzi się z użyciem mieszaniny białka i detergentu, jednak często wykazują one oporność na krystalizację lub prowadzą do powstania kryształów słabej jakości. Problemy te wynikają z obecności detergentu&prime;niemożność odpowiedniego odwzorowania dwuwarstwy, co skutkuje słabą stabilnością i heterogennością. Ponadto detergent ekranuje hydrofobową powierzchnię białek błonowych (MP), zmniejszając powierzchnię dostępną dla kontaktów krystalicznych. Aby wyeliminować te wady, białka błonowe można krystalizować w mediach lipidowych, które dokładniej symulują ich środowisko endogenne i stały się ostatnio nowatorską techniką krystalizacji MP.
Lipidowa faza sześcienna (LCP) to trójwymiarowa lipidowa dwuwarstwa przeniknięta przez system połączonych kanałów wodnych1. Chociaż najczęściej stosowanym lipidem jest monooleina, do tworzenia LCP wykorzystywano również lipidy pokrewne, takie jak monopalmitoleina i monovaccenina2. Białka błonowe (MPs) są wbudowywane w LCP, gdzie dyfundują w trzech wymiarach i zasilają zarodki kryształów. Wielką zaletą LCP jest to, że białko pozostaje w środowisku bardziej zbliżonym do natywnego, jednak metoda ta posiada szereg wad technicznych, w tym wysoką lepkość (wymagającą specjalistycznego sprzętu) oraz trudności w wizualizacji i manipulacji kryształami3,4. Ze względu na te trudności techniczne do krystalizacji wykorzystaliśmy inne medium lipidowe – bicelle5,6 (Rysunek 1). Bicelle są mieszaninami lipidowo-amfifilowymi powstającymi w wyniku łączenia lipidu fosfatydylocholinowego (DMPC) z amfifilem (CHAPSO) lub lipidem krótkołańcuchowym (DHPC). W obrębie każdego dysku bicelli cząsteczki lipidów tworzą dwuwarstwę, natomiast cząsteczki amfifila wyścielają apolarne krawędzie, zapewniając korzystne właściwości zarówno dwuwarstw, jak i detergentów. Co istotne, poniżej temperatury przejścia mieszaniny białka z bicellami wykazują obniżoną lepkość i są manipulowane w sposób podobny do białek błonowych rozpuszczonych w detergentach, co czyni bicelle kompatybilnymi z robotami do krystalizacji.
Bicele zostały z powodzeniem wykorzystane do krystalizacji kilku białek błonowych5,7-11 (Tabela 1)Rosnąca kolekcja białek świadczy o wszechstronności bikeli w krystalizacji białek błonowych (MP) o strukturze zarówno alfa-helisy, jak i beta-harmonijki, pochodzących ze źródeł prokariotycznych i eukariotycznych. Ze względu na te sukcesy oraz łatwość wdrożenia w analizach wysokoprzepustowych, bikele powinny stanowić element warsztatu każdego krystalografa białek błonowych&prime;arsenału. W niniejszym filmie opisujemy metodologię biceli oraz przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wysokoprzepustowych prób krystalizacji oczyszczonych białek błonowych (MP) z wykorzystaniem standardowej robotyki.

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny bicel, ustawiania prób krystalizacji (zarówno ręcznie, jak i robotycznie) orazy odzyskiwania kryształów z medium.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

Białka błonowe (MPs) odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, takich jak pompowanie specyficznych cząsteczek przez w innym przypadku nieprzepuszczalną błonę ...

W niniejszym filmie zaprezentowana zostanie metoda przygotowania wysokoprzepustowych prób krystalizacji oczyszczonych białek błonowych z wykorzystaniem liposomów (tzw. Lipic B cells). W pierwszej kolejności przygotowuje się Lipic B cells poprzez mieszanie lipidów z detergentem, następnie do mieszaniny wprowadza się oczyszczone białko błonowe, a próby krystalizacji przeprowadza się przy użyciu robota nanolitrowego. Wizualna inspekcja z wykorzystaniem standardowego mikroskopu świetlnego pozwala na wykrycie obecności kryształów.Po ich utworzeniu kryształy białek można wyekstrahować i zamrozić w celu przeprowadzenia pomiarów i wyznaczenia struktury. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że dzięki unikalnemu zachowaniu fazowemu komórek B, do krystalizacji można wykorzystać standardowy sprzęt i robotykę dostępną w laboratorium. Konfiguracja komórek B jest prostą techniką, która pozwala przenieść docelowe białko błonowe z detergentowego środowiska komórkowego do ośrodka lipidowego.Daje to całkowicie nowy zestaw warunków do przesiewu. Jest to tak prosta metoda, która została z sukcesem zastosowana w przypadku wielu białek błonowych, że nie ma żadnego powodu, aby jej nie wypróbować. Pierwszym krokiem w krystalizacji opartej na limfocytach B jest przygotowanie lipidowej mieszaniny amfipatycznej formującej limfocyty B.Proces ten wymaga znacznego nakładu pracy i jest najbardziej czasochłonny. Należy pamiętać, że jego ukończenie może zająć kilka godzin. Komórki B mogą formować się w różnych kombinacjach lipidów amfifilowych i w szerokim zakresie stężeń.Sugerowane wartości początkowe znajdują się w tabeli 1 w towarzyszącym protokole pisemnym. Należy rozpocząć od przygotowania 1,0 ml mieszaniny DMPC i Chapo o stężeniu 35% w stosunku molarnym 2,8:1. W tym celu należy odważyć 0,26 g DMPC oraz 0,09 g Chapo do probówki. Doprowadzić objętość do 1,0 ml, używając wody dejonizowanej, a następnie wymieszać mieszaninę w wstrząsaczu typu vortex.Następnie ogrzewaj mieszaninę w kąpieli wodnej do około 40 °C, aż uzyska ona konsystencję żelu. Umieść probówkę na lodzie. Próbka powinna ponownie stać się płynna.Następnie ponownie mieszaj w wortexie przez kilka minut, kontynuując cykle ogrzewania, chłodzenia i wortexowania, aż lipidy zostaną całkowicie rozpuszczone. Należy pamiętać, że w miarę powtarzania cykli, po zakończeniu chłodzenia mieszanina może stać się mętna. W temperaturze pokojowej lub wyższej mieszanina będzie miała postać przejrzystego żelu, a na lodzie będzie gęstą cieczą. Komórki można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długoterminowego przechowywania.Następnie oczyszczone białka są wprowadzane do medium komórek B. Jest to prosty proces, który należy przeprowadzić w tym samym dniu co krystalizację, co zostanie omówione w następnej sekcji filmu. Rozmrozić mieszaninę komórek B z DMPC w temperaturze pokojowej, aż do momentu zmiany fazy w przejrzysty żel.Umieść mieszaninę na lodzie, aby ją upłynnić, a następnie krótko wymieszaj w wirówce typu vortex, aby przywrócić jednorodną fazę komórek B. Od tego momentu przechowuj mieszaninę komórek B oraz oczyszczone białko na lodzie. Pozwoli to utrzymać komórki B w fazie ciekłej, co umożliwi ich pipetowanie.Następnie dodaj mieszaninę komórek B do oczyszczonego białka rozpuszczonego w detergencie w stosunku objętościowym jeden do czterech. Następnie delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aż stanie się on klarowny i jednorodny. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, krótko odwiruj je w wirówce stołowej.Inkubuj mieszaninę na lodzie przez co najmniej 30 minut, aby wspomóc pełną inkorporację białka do komórek. Mieszanina białka z komórkami jest teraz gotowa do prób krystalizacji. Próby krystalizacji zostaną zademonstrowane przy użyciu robota do krystalizacji mosquito.Schłodzić płytkę 96-dołkową z wypukłym dnem (V bottom), umieszczając ją na lodzie. Przenieść mieszaninę białka i komórek pipetą do płytki, aby zapewnić minimalną lepkość roztworu. Przechowywać mieszaninę białka i komórek na lodzie do ostatniego kroku.Wykorzystany tutaj robot posiada pięć platform. Na platformie trzeciej należy umieścić mikropłytkę z rezerwuarem, a na platformie piątej pokrywę krystalizacyjną, na którą będą naniesione krople. Następnie na platformie czwartej, najbliżej pozycji dozowania, należy umieścić płytkę z białkiem otrzymanym z komórek.Zapewnia to, że mieszanina białka z komórkami zostanie pobrana przez robota jako ostatnia i natychmiast podana. Po uruchomieniu procesu za pomocą oprogramowania robot pobierze roztwór z rezerwuaru, a następnie mieszaninę białka z komórkami i naniosie je w formie kropel na pokrywkę, aby zapobiec nagrzewaniu i zwiększeniu lepkości podczas dozowania. Nie należy programować urządzenia Mosquito tak, aby mieszało roztwór z rezerwuaru z mieszaniną białka z komórkami bezpośrednio po zakończeniu cyklu.Wyjmij płytkę z białkiem komórkowym z urządzenia i umieść ją na lodzie. Zdejmij pokrywę z urządzenia i połóż ją na płytce zawierającej roztwór w rezerwuarze w taki sposób, aby krople były odwrócone do góry nogami. Inkubuj płytkę w temperaturze 20 °C.Należy zauważyć, że w celu formowania i optymalizacji kryształów można przetestować również inne temperatury. Wyższe temperatury indukują fazę lamelarną, która ma tę zaletę, że pozwala na wstępną organizację białka w warstwy. Można przeprowadzić przesiew temperatury od 4 °C do 20 °C.Temperatury poniżej 4°C mogą spowodować wytrącanie się lipidów w dłuższym okresie czasu; pierwszego, trzeciego dnia oraz w kolejnych tygodniach należy oceniać wygląd i wzrost kryształów przy użyciu standardowego mikroskopu świetlnego. Przedstawiono tutaj obraz w polu jasnym oraz obraz UV igłowatych kryształów zaobserwowanych wyłącznie w warunkach ataku. W kryształach nie wykryto fluorescencji, co wskazuje na wynik fałszywie dodatni na tym obrazie.Kryształ w kształcie pręta, który powstał przy zastosowaniu metylopropanodiolu jako czynnika wytrącającego. Kryształ wykazuje słabą fluorescencję, co sugerowało, że może to być kryształ białka, jednak analiza dyfrakcyjna rentgenowska wykazała, że nie jest on białkowy. Przedstawiono tutaj kryształ zaobserwowany około czterech tygodni po rozpoczęciu prób.Silna fluorescencja pod światłem UV potwierdza, że jest to kryształ białka, co można było zaobserwować na tym filmie. Po uzyskaniu komórek B można je zmieszać bezpośrednio z oczyszczonym białkiem, a od tego momentu krystalizacja przebiega niemal dokładnie tak samo, jak w standardowych protokołach opartych na detergentach.Kolejną wyraźną zaletą jest możliwość domieszkowania komórek B specyficznymi lipidami w celu optymalizacji. Technika ta charakteryzuje się ogromną wszechstronnością i jest na tyle prosta w zastosowaniu, że powinna być wypróbowana w każdym projekcie krystalizacji białek błonowych.

high-throughput-crystallization-membrane-proteins-using-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przekładanie z angielskiego na polski z zachowaniem wszystkich tagów HTML i formatowania dokładnie:

Wysokowydajna krystalizacja białek błonowych z użyciem metody lipidowych biceli

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Poznaj wysokoprzepustową krystalizację białek błonowych metodą lipidowych bicelli. Technika ta umożliwia wykorzystanie standardowego sprzętu laboratoryjnego do efektywnego uzyskiwania kryształów białek.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

Przeglądaj więcej filmów