Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Witam, mój zespół bada rodzaj białka na końcu, rozciąga się przez błonę komórkową i patrzymy na związek z medycyną i biologią. W szczególności przyglądamy się jednemu konkretnemu białku, które wymagałoby ATP do kierowania swoją funkcją, a następnie, jest częścią, nazwa nazywa się transporterem kasetowym wiążącym ATP. W szczególności przyglądamy się ich fundamentalnej zależności między strukturą a funkcją, a następnie wykorzystujemy ją do zrozumienia wielu chorób przewlekłych, zwłaszcza chorób układu krążenia.

Ze względu na złożoność oczyszczania białek błonowych i ich stabilność w natywnych temperaturach, uzyskanie kryształów białek 3D jest głównym wyzwaniem w tej dziedzinie, a także ogranicza zastosowania związane z odkrywaniem leków. Nasz zespół opracował metody krio-EM i krystalografii rentgenowskiej do badań strukturalnych białek transportowych błonowych. Wcześniej nasze laboratorium rozwiązało również strukturę krystaliczną pierwszego ludzkiego heterodimeru obligatoryjnego ABCG5, G8 zarówno w stanie APO, jak i związanym z cholesterolem.

Nasze wyniki mogą stanowić przełom w odkrywaniu leków małocząsteczkowych lub ich ponownym wykorzystaniu. Uzyskanie kryształów białek 3D może również umożliwić eksperymenty z moczeniem w celu kokrystalizacji kompleksów białek i ligandów. Nasze laboratorium ma na celu określenie molekularnych podstaw rozpoznawania i translokacji lipidów przez zależne od ATP białka transportera lipidów.

Naszym celem jest również ustanowienie nowych metod w opracowywaniu leków do badania dynamiki molekularnej i aspektów strukturalnych transporterów ABC. Zacznij od chemicznej modyfikacji połączonych frakcji białkowych poprzez redukcyjną metylację. Aby to zrobić, weź oczyszczone białko i dodaj 20 milimolowych dimetyloaminoboranu, a następnie 40 milimolowych formaldehydów.

Inkubować mieszaninę w wytrząsarce oscylacyjnej przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj do mieszaniny dodatkowe 10 milimolowych dimetyloaminoboranu. Następnie inkubuj mieszaninę przez noc przez 12 do 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ugasić reakcję, dodając 100 milimolowy chlorek tris o pH 7,5. Użyć odpowiedniego buforu płuczącego i buforu elucyjnego do załadowania metylowanego białka do kolumny niklowej NTA. Najpierw umyj dwumililitrową kolumnę niklu NTA za pomocą 10 objętości kolumny buforu do płukania.

A następnie eluuj białko za pomocą buforu elucyjnego. Po elucji przepuścić eluent białkowy przez kolumnę odsalającą PD-10, wstępnie zrównoważoną odpowiednim buforem. Do odsolonego białka dodać cholesterol przygotowany w izopropanolu lub etanolu.

I inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka ultraodwiruj mieszaninę w temperaturze 150 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodać zebrany supernatant do koncentratora odśrodkowego z odcięciem 100 kilodaltonów i stężyć supernatant do końcowego stężenia od 30 do 50 miligramów na mililitr.

Ponownie odwirować skoncentrowane białko za pomocą szybkoobrotowej wirówki stołowej z chłodzeniem i usunąć osady. Umieść zebrany supernatant na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed przystąpieniem do zastygnięcia krystalizacji. Alkilowane białka przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza analizowano za pomocą analitycznej żelowej chromatografii filtracyjnej w ciągu miesiąca.

I wykazał niewielką utratę białka po tygodniu. Zacznij od przygotowania 10% roztworu podstawowego komórek B, zawierającego lipidy i detergent. Aby to zrobić, weź wstępnie wysuszony lipid, który jest mieszanką pięciu molowych procent cholesterolu i 95 molowych procent DMPC i dodaj do niego roztwór detergentu CHAPSO w wodzie dejonizowanej.

Za pomocą sonikatora do kąpieli wodnej ponownie zawiesić mieszaninę lipidów i detergentów, sonikując ją w lodowatej wodzie pod ciągłą mocą, aż roztwór będzie klarowny. Następnie za pomocą filtra odśrodkowego o średnicy 0,2 mikrona usuń wszelkie nierozpuszczone składniki. Następnie, pracując na lodzie, połącz powstały roztwór podstawowy komórek B z wcześniej przygotowaną próbką białka w stosunku objętościowym od jednego do czterech.

Inkubować mieszaninę białek B na lodzie przez 30 minut. W celu krystalizacji na 48-dołkowej płytce należy zmieszać 0,5 lub jeden mikrolitr mieszaniny komórek B z równą objętością roztworu rezerwuaru krystalizacji. Następnie ustaw krystalizację w trybie dyfuzji pary w wiszącej kropli, używając 48-dołkowej płytki i inkubuj zestaw do krystalizacji w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnego dnia sprawdź tacki do krystalizacji, aby upewnić się, że szkło nakrywkowe jest prawidłowo uszczelnione. Sprawdzaj wzrost kryształów co najmniej raz dziennie, używając stołowego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w polaryzator. Na koniec namocz kryształy białka w 0,2-molowym malonianu sodu i błyskawicznie zamroź je w pętlach kriogenicznych o długości 50 lub 100 mikrometrów przy użyciu ciekłego azotu.

Dojrzałe kryształy, które nadawały się do zbierania danych, zwykle pojawiały się w ciągu jednego do dwóch tygodni i generalnie miały wymiary 50 mikronów na 100 mikronów na dwa mikrony.