Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Mikroskopy fluorescencyjne z arkuszami świetlnymi opartymi na komorze na próbki są zaprojektowane z myślą o wysokiej zawartości, a nie o wysokiej przepustowości. Testy obrazowania na żywo muszą być zatem wykonywane sekwencyjnie, a tym samym w mniejszym stopniu zależne od zmienności otoczenia. Nasz uchwyt na pajęczynę umożliwia układanie w stosy i jednoczesne obrazowanie wielu zarodków, eliminując zmienność otoczenia i zwiększając przepustowość.

Umieszczanie zarodków w uchwycie pajęczyny wymaga pewnej finezji. Film instruktażowy idealnie nadaje się do zilustrowania sekwencji wielu krótkich gestów dyrygencyjnych. Do kalibracji mikroskopu fluorescencyjnego opartego na komorze na próbkę z arkuszem świetlnym.

Najpierw należy ponownie sformlizować podwielokrotność agarozy w suchym mieszalniku grzewczym w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Pozwól stopionej agarozie ostygnąć do 35 stopni Celsjusza i przenieś 50 mikrolitrów agarozy do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Zmieszać 0,5 mikrolitra roztworu mikrosfery fluorescencyjnej z agarozą z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez jedną minutę i wypełnić szczelinowy otwór w uchwycie pajęczyny 10 mikrolitrami mieszaniny roztworu mikrosfery fluorescencyjnej agarozy.

Odessać jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozy i pozwól agarozie zestalić się przez 30 do 60 sekund. Napełnij komorę na próbkę autoklawowaną wodą z kranu i powoli włóż uchwyt pajęczyny do komory na próbkę. Przesuń otwór podłużny przed soczewkę detekcyjną i obróć uchwyt do pozycji 45 stopni w stosunku do osi oświetlenia i wykrywania.

Uchwyt pajęczyny nie powinien być widoczny w kanale światła transmisyjnego. Przełącz się na odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj moc lasera oraz czas naświetlania, tak aby mikrosfery fluorescencyjne dostarczały odpowiedni sygnał. Określ objętość widoku, która całkowicie pokrywa teraz poprzecznie zorientowaną folię agarozową i oblicz maksymalną możliwą rozdzielczość osiową dla odpowiedniej kombinacji soczewek oświetleniowych i detekcyjnych, aby zdefiniować odstęp Z.

Następnie zapisz trójwymiarowy stos testowy Z mikrosfer fluorescencyjnych i porównaj maksymalne projekcje X, Y i Z z tabelą kalibracyjną. Jeśli mikrosfery wydają się rozmyte, rozmyte i/lub zniekształcone. Dostosuj położenie soczewek oświetlenia i/lub detekcji.

W celu dechorionacji zarodka dodaj osiem mililitrów autoklawizowanej wody z kranu do studzienek A1, A2, A3 i B3 z jedną sześciodołkową płytką na linię. Następnie dodaj siedem mililitrów autoklalawowanej wody z kranu i jeden mililitr roztworu podchlorynu sodu do studzienek B1 i B2. Umieścić pierwszą płytkę pod mikroskopem stereoskopowym i wprowadzić pierwszy zarodek zawierający sitko do komórek do dołka A1.

Myj zarodki pod delikatnym mieszaniem przez 30 do 60 sekund, zanim przeniesiesz sitko do dołka B1. Potrząsaj energicznie płytką przez 30 sekund, a następnie przenieś sitko do dołka A2. Myj zarodki przez jedną minutę pod delikatnym mieszaniem i przenieś sitko do studzienki B2 w celu energicznego potrząsania, aż większość zarodków całkowicie ulegnie dechorionacji.

Następnie przenieść sitko do studzienki A3 na jedną minutę delikatnego mycia, a następnie przechowywać sitko z dekorionowanymi zarodkami w basenie B3 do czasu, aż zarodki innych linii zostaną potraktowane zgodnie z wykazanymi metodami. Aby zamontować zarodki na uchwycie pajęczyny, należy ponownie upłynnić kolejną porcję agarozy, jak pokazano. Gdy agaroza ostygnie, umieść uchwyt pajęczyny pod mikroskopem stereoskopowym i dodaj 10 mikrolitrów agarozy na szczelinowy otwór.

Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić agarozę po szczelinowym otworze, a następnie zassaj jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozy. Gdy agaroza zastygnie, użyj pędzla, aby ostrożnie wybrać i przenieść zarodki na folię agarozową. Ułóż je wzdłuż długiej osi otworu szczelinowego, tak aby ich oś przednio-tylna była wyrównana z długą osią otworu podłużnego.

Aby ustabilizować zarodki, ostrożnie odpipetuj od jednego do dwóch mikrolitrów agarozy w szczelinę między zarodkami a folią agarozową. Gdy agaroza zastygnie, powoli włóż uchwyt pajęczyny z zamontowanymi zarodkami do komory na próbki wypełnionej buforem obrazu. Aby zobrazować zarodki, upewnij się, że uchwyt pajęczyny znajduje się w pozycji 45 stopni względem osi oświetlenia i detekcji, a w kanale światła transmisyjnego przesuń zarodek do środka pola widzenia.

Uchwyt na pajęczynę nie powinien być widoczny. Następnie przesuwaj zarodek ze stopniem mikrotranslacji w Z, aż środkowa płaszczyzna zarodka nałoży się na płaszczyznę ogniskową, a kontur stanie się ostry. Nie przełączając się na kanał fluorescencyjny, przesuń zarodek o 250 mikronów w obu kierunkach, aby określić objętość widzenia.

Jeśli wymagane jest obrazowanie w wielu kierunkach, należy odpowiednio obrócić zarodek, ustawić ostrość zarodka i określić objętość widzenia, jak właśnie pokazano. Następnie powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych zamontowanych zarodków. Po określeniu objętości widzenia dla wszystkich zarodków należy określić parametry kanału fluorescencji i filmu poklatkowego, a następnie rozpocząć proces obrazowania.

W przypadku testów trwających kilka dni należy rozważyć przynajmniej częściowe zakrycie otworu komory próbki, aby zmniejszyć parowanie. Po zakończeniu badania obrazowego ostrożnie wyjmij uchwyt pajęczyny z komory na próbkę i za pomocą małego pędzla oderwij zarodki od filmu agarozowego i umieść zarodki na odpowiednio oznakowanym szkiełku mikroskopowym. Umieścić szkiełko w naczyniu do pobierania w celu inkubacji w odpowiednich standardowych warunkach chowu.

W miarę zbliżania się punktu wylęgu należy często sprawdzać szalki do pobierania i przenosić wyklute larwy do indywidualnych dołków na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki do połowy odpowiednią pożywką wzrostową, a następnie wysiaduj larwy w odpowiednich standardowych warunkach chowu. Gdy obserwowane osobniki osiągną dorosłość, należy zapewnić odpowiednich partnerów do krycia i po kilku dniach sprawdzić potomstwo.

Na tym filmie można zaobserwować dynamikę sygnału fluorescencyjnego trzech zarodków pochodzących z różnych transgenicznych linii Drosophila w okresie około jednego dnia. Spodziewano się podobnego wzorca fluorescencji, ponieważ wszystkie linie wyrażały zlokalizowany jądrowo EGFP pod kontrolą przypuszczalnie wszechobecnych i składnikowo aktywnych promotorów. Porównawcze wyniki obrazowania na żywo ujawniły jednak silne przestrzenne różnice czasowe we wzorcach ekspresji, które nie były efektami wtórnymi wynikającymi z wariancji otoczenia.

W tej analizie trzech zarodków Tribolium zawierających ten sam transgen oparty na piggybacku. Porównawcze wyniki obrazowania na żywo procesu zamykania okna surowiczego podczas gastrulacji sugerują, że druga podlinia zapewnia znacznie silniejszy ogólny sygnał niż pozostałe dwie podlinie. Jak wskazują te dane, kontekst genomiczny może mieć również silny wpływ na poziom ekspresji transgenów w Tribolium.

Nasze podejście doskonale nadaje się do analizy fenotypów knockdown i knockout, ponieważ pozwala na jednoczesne obrazowanie zarodków kontrolnych typu dzikiego. Nasz protokół może być również wykorzystany do porównania morfogenezy dwóch lub więcej gatunków owadów. W ten sposób uzyskasz głębszy wgląd w ewolucję rozwoju.