Name: Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila w mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi. Protokół z uchwytem typu pajęczyna eliminuje wariancję otoczenia i zwiększa przepustowość badań w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ernstowi H. K. Stelzerowi za możliwość skorzystania z jego zasobów, jak również cennych komentarzy dotyczących manuskryptu, Anicie Anderl za wsparcie w obrazowaniu na żywo Tribolium, Svenowi Plathowi za wsparcie techniczne, a także Ilanowi Davisowi, Nicole Grieder i Geroldowi Schubigerowi za udostępnienie swoich transgenicznych linii Drosophila za pośrednictwem Bloomington Stock Center.

1. Praca przygotowawcza
<ol>
	<li>Wybierz kombinację soczewki oświetleniowej/soczewki detekcyjnej/kamery dla LSFM, która odpowiada pytaniu naukowemu i ustaw mikroskop. Wielkość pola widzenia to iloraz wielkości chipa kamery i powiększenia soczewki detekcyjnej. Soczewka oświetleniowa powinna być tak dobrana, aby całe pole widzenia było pokryte mniej więcej płaskim arkuszem światła34. W tabeli 1 wymieniono trzy zalecane kombinacje.</li>
	<li>Aby przygotować porcje agarozy i naczynia do pobierania, dodaj 2 g niskotopliwej agarozy do 200 ml autoklawowanej wody z kranu i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 600-800 W, aż wszystkie cząstki agarozy się rozpuszczą. Przygotować kilka porcji agarozy o pojemności 1 ml w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml lub 2 ml, a następnie napełnić agarozą kilka szalek Petriego o średnicy 90 mm o wysokości 3-5 mm. Zestalone porcje i szalki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dla Drosophila: Aby przygotować świeże fiolki hodowlane, należy ugotować odpowiednią ilość przygotowanej na zamówienie lub dostępnej w handlu pożywki Drosophila, przenieść 5-15 ml do szerokich fiolek i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Aby przygotować potrawy do składania jaj, dodaj 1 g niskotopliwej agarozy do 50 ml autoklawowanej wody z kranu i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 600-800 W, aż wszystkie cząsteczki agarozy się rozpuszczą. Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia do 45 °C, a następnie dodaj 50 ml soku owocowego (najlepiej jabłkowego lub z czerwonych winogron) i dokładnie wymieszaj. Wlać mieszaninę do szalek Petriego Ø 35 mm i przechowywać zestalone naczynia do składania jaj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dla tribolium: Aby przygotować pożywkę, przełóż mąkę pełnoziarnistą oraz nieaktywne suche drożdże przez sito o oczkach 710 μm, a następnie uzupełnij przesianą mąkę 5% (w/w) przesianych drożdży. Aby przygotować podłoże do składania jaj, przełóż drobną mąkę pszenną oraz nieaktywne suche drożdże przez sito o oczkach 250 μm, a następnie uzupełnij przesianą mąkę 5% (w/w) przesianych drożdży.</li>
</ol>
2. Kalibracja LSFM opartych na komorze na próbki za pomocą mikrosfer fluorescencyjnych
UWAGA: Celem kalibracji jest wyrównanie punktów ogniskowych soczewek oświetleniowych i detekcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), ponieważ jest to przesłanka do uzyskania wyraźnych obrazów. LSFM należy kalibrować regularnie, co najmniej raz na 3-4 tygodnie.
<ol>
	<li>Ponownie upłynnić porcję agarozy w suchym podgrzewaczu/mieszalniku w temperaturze 80 °C, a następnie pozostawić podwielokrotność agarozy do ostygnięcia do 35 °C.</li>
	<li>Przenieść 50 μl agarozy do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dodać 0,5 μl fluorescencyjnego roztworu mikrosfery. Mieszać z prędkością 1 400 obr./min przez 1 min.</li>
	<li>Wypełnić szczelinowy otwór w uchwycie pajęczyny 10 μl mieszaniny agarozy i fluorescencyjnego roztworu mikrosfery, a następnie odessać jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienka warstwa agarozy. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.</li>
	<li>Napełnij komorę na próbkę autoklawowaną wodą z kranu. Powoli włóż uchwyt pajęczyny do komory na próbkę i przesuń szczelinowy otwór ze stopniami mikrotranslacyjnymi przed soczewką detekcyjną.</li>
	<li>Obróć uchwyt pajęczyny ze stolikiem obrotowym do pozycji 45° względem osi oświetlenia (x) i wykrywania (z). Uchwyt pajęczyny nie powinien być widoczny w kanale światła transmisyjnego.</li>
	<li>Przełącz się na odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj moc lasera oraz czas naświetlania tak, aby mikrosfery fluorescencyjne dostarczały odpowiedni sygnał.</li>
	<li>Określ objętość widoku, która całkowicie pokrywa teraz poprzecznie zorientowaną warstwę agarozy. Zdefiniuj odstęp z, obliczając maksymalną możliwą rozdzielczość osiową dla odpowiedniej kombinacji soczewki oświetleniowej/soczewki detekcyjnej34. Alternatywnie, 4-krotność rozdzielczości bocznej może być użyta jako przybliżone przybliżenie.</li>
	<li>Nagraj trójwymiarowy stos testowy z mikrosfer fluorescencyjnych i porównaj maksymalne projekcje x, y i z z tabelą kalibracji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Jeśli mikrosfery wydają się rozmyte, rozmyte i/lub zniekształcone (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C), dostosuj położenie soczewki oświetleniowej i/lub detekcyjnej.</li>
</ol>
3. Kolekcja zarodków Drosophila
<ol>
	<li>Przenieś 100-200 dorosłych osobników z wybranej linii Drosophila do świeżej fiolki hodowlanej na 2-3 dni przed testem obrazowym w celu ustalenia kultury pobrania jaj. Jeśli jeszcze nie istnieje, rozważ użycie starej fiolki do hodowli, aby rozpocząć hodowlę potomstwa. Aby upewnić się, że dorosłe osobniki nie mają więcej niż dwa tygodnie, należy zastąpić kulturę pobrania zarodków na czas kulturą potomstwa.</li>
	<li>Podgrzej naczynie do składania jaj do temperatury pokojowej i dodaj kroplę pasty drożdżowej na wierzch agaru.</li>
	<li>Przenieś dorosłe osobniki z kultury do zbioru jaj do pustej wąskiej fiolki i umieść ją na naczyniu do składania jaj. Inkubować zestaw do zbierania jaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Jeśli to możliwe, unikaj znieczulenia (zimno, CO2 ) podczas tego etapu.</li>
	<li>Umieścić dorosłe osobniki z powrotem w fiolce do chowu. Inkubować naczynie do składania jaj w dogodnej kombinacji temperatury/czasu, a następnie przenieść 10-20 zarodków małym pędzlem z naczynia do składania jaj do sitka o wielkości oczek 100 μm. Wyrzuć naczynie do składania jaj.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.1 do 3.4 dla każdej linii Drosophila.</li>
</ol>
4. Kolekcja zarodków Tribolium
UWAGA: Dla wygody, przedstawiono schemat procedury pobierania jaj Tribolium (Rysunek 3A), do którego odnoszą się również liczby w nawiasach w tym kroku.
<ol>
	<li>Przenieś 200-300 dorosłych (około 400-700 mg) wybranej linii Tribolium do pustej szklanej butelki o pojemności 1 litra 2-10 dni przed testem obrazowania, aby ustalić hodowlę jaj (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A_01). Napełnij butelkę 50-100 g świeżego podłoża wzrostowego. Jeśli jeszcze nie istnieje, rozważ rozpoczęcie hodowli potomstwa przy użyciu dostępnych larw i poczwarek. Aby upewnić się, że dorosłe osobniki nie mają więcej niż 3 miesiące, zastąp kulturę pobierania jaj na czas kulturą potomstwa.</li>
	<li>Przepuść kulturę zbierającą jaja przez sito o rozmiarze oczek 800 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A_02). Umieść pożywkę wzrostową, która zawiera zarodki niew stadium zaawansowania, do początkowej butelki (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A_03) i przenieś dorosłe osobniki do pustej szklanej butelki o pojemności 1 l (<silna klasa="xfig">Rycina 3A_04). Dodać 10 g podłoża do składania jaj (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A_05) i inkubować zestaw do zbierania jaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 3A_06,07).</li>
	<li>Przełóż zestaw do zbierania jaj przez sito o rozmiarze oczek 800 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A_08). Wróć dorosłych do ich początkowej butelki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A_09). W zależności od procesu rozwojowego, który powinien być zobrazowany, inkubuj pożywkę do składania jaj, która zawiera teraz około 30-100 zarodków, w dogodnej kombinacji temperatury / czasu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A_10).</li>
	<li>Przełóż pożywkę do składania jaj przez sito o rozmiarze oczek 300 μm (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 3A_11) i przenieś zarodki (<klasa silna = "xfig" > Rycina 3A_12) do sitka do komórek o rozmiarze oczek 100 μm. Wyrzuć przesiane podłoże do składania jaj (Rysunek 3A_13).</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.1 do 4.4 dla każdej linii tribolium.</li>
</ol>
5. Dechorionacja na bazie podchlorynu sodu
UWAGA: Zarówno zarodki Drosophila, jak i Tribolium są pokryte kosmówką, ochronną i silnie rozpraszającą światło warstwą białka, która nie jest niezbędna do prawidłowego rozwoju, o ile zarodki są utrzymywane w wilgoci po usunięciu. Protokół dechorionacji dla zarodków obu gatunków jest identyczny.
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę 6-dołkową, wypełniając studzienki A1, A2, A3 i B3 8 ml autoklawowanej wody z kranu, a studzienki B1 i B2 7 ml autoklawowanej wody z kranu i 1 ml roztworu podchlorynu sodu (NaOCl) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3B). Obserwuj proces dekorionacji pod mikroskopem stereoskopowym, najlepiej w świetle transmisyjnym. 
	UWAGA: Podchloryn sodu jest.</li>
	<li>Włożyć sitko do komórek zawierających zarodki (krok 3.4 i/lub 4.4) do studzienki A1 i umyć zarodki około 30-60 s pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieś sitko do komórek do dołka B1 i energicznie potrząsaj płytkami przez 30 s, a następnie przenieś je do dołka A2 i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przenieś sitko do komórek do dołka B2 i energicznie potrząsaj płytką, aż większość zarodków zostanie całkowicie zdechorionowana (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3C), a następnie przenieś je do dołka A3 i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przechowuj sitko do komórek w B3 dobrze przed przystąpieniem do procedury montażu.</li>
	<li>Powtórz kroki od 5.1 do 5.5 dla każdego wiersza.</li>
</ol>
6. Montaż wielu zarodków za pomocą uchwytu na pajęczynę
<ol>
	<li>Ponownie upłynnić porcję agarozy w suchym podgrzewaczu/mieszalniku w temperaturze 80 °C, a następnie pozostawić podwielokrotność agarozy do ostygnięcia do 35 °C.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 10 μl agarozy na wierzch szczelinowego otworu w uchwycie pajęczyny. Końcówką pipety rozprowadź agarozę na szczelinowym otworze, a następnie odessaj jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozowy. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.</li>
	<li>Dla każdej linii ostrożnie wybierz jeden lub więcej zarodków małym pędzlem i umieść je na folii agarozowej.</li>
	<li>Ułóż zarodki wzdłuż długiej osi otworu szczelinowego, a następnie wyrównaj ich oś przednio-tylną z długą osią otworu szczelinowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Ostrożnie ustabilizować zarodki, odpipetowując 1-2 μl agarozy w szczelinę między zarodkami a folią agarozową. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.</li>
	<li>Powoli włożyć uchwyt pajęczyny z zamontowanymi zarodkami do komory na próbki wypełnionej buforem obrazu.</li>
</ol>
7. Porównawcze obrazowanie na żywo w LSFM opartych na komorze próbek
<ol>
	<li>Przesuń jeden z zarodków z etapami mikrotranslacji przed soczewkę detekcyjną. Upewnij się, że uchwyt pajęczyny znajduje się w pozycji 45° względem osi oświetlenia (x) i wykrywania (z) (por. <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>W kanale światła transmisyjnego przesuń zarodek do środka pola widzenia. Uchwyt na pajęczynę nie powinien być widoczny.</li>
	<li>Przesuwaj zarodek z etapami mikrotranslacji w z tak długo, aż płaszczyzna środkowa zarodka zajdzie na płaszczyznę ogniskową, tj. do momentu, gdy kontur stanie się ostry. Nie przełączając się na kanał fluorescencyjny, określ objętość widzenia, oddalając się o 250 μm od płaszczyzny środkowej w obu kierunkach.</li>
	<li>Opcjonalnie, jeśli wymagane jest obrazowanie w wielu kierunkach, należy odpowiednio obrócić zarodek i powtórzyć kroki 7.2 i 7.3. Uchwyt pajęczyny obsługuje do czterech orientacji w krokach co 90°.</li>
	<li>Powtórz kroki od 7.1 do 7.3 (lub 7.4) dla wszystkich pozostałych zarodków zamontowanych na uchwycie pajęczyny (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Upewnij się, że zarodek znajdujący się najwyżej w górze nie opuszcza bufora obrazowania, gdy zarodek znajdujący się najniżej znajduje się przed soczewką wykrywającą.</li>
	<li>Zdefiniuj parametry kanału fluorescencji (moc lasera, czas ekspozycji, filtr detekcji) i poklatkowy (interwał, całkowity czas trwania) i rozpocznij proces obrazowania. Aby uzyskać informacje o wartościach orientacyjnych, zapoznaj się z tabelą metadanych przykładowych zestawów danych (tabela uzupełniająca 1). W przypadku testów, które trwają kilka dni, należy rozważyć przynajmniej częściowe zakrycie otworu komory próbki, aby zmniejszyć parowanie.</li>
</ol>
8. Pobieranie i dalsza hodowla zobrazowanych zarodków
<ol>
	<li>Po zakończeniu badania obrazowego ostrożnie wyjmij uchwyt pajęczyny z komory próbki.</li>
	<li>Odłącz zarodki od filmu agarozowego za pomocą małego pędzelka i przenieś je na odpowiednio oznakowane szkiełko mikroskopowe. Umieścić szkiełko w naczyniu do pobierania i inkubować w odpowiednich standardowych warunkach chowu.</li>
	<li>Jeśli chodzi o metody eksperymentalne, oszacuj, kiedy embriogeneza jest zakończona. W miarę zbliżania się punktu wylęgu należy często sprawdzać szalki do pobierania i przenosić wyklute larwy Drosophila do indywidualnych fiolek hodowlanych, a larwy Tribolium do indywidualnych studzienek na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki do połowy pożywką wzrostową. Inkubować w odpowiednich standardowych warunkach chowu.</li>
	<li>Gdy obserwowane osobniki osiągną dorosłe osobniki, należy zapewnić im odpowiedniego partnera do krycia i po kilku dniach sprawdzić, czy nie ma potomstwa.</li>
</ol>
9. Przetwarzanie danych obrazu i dokumentacja metadanych
UWAGA: Do przetwarzania danych obrazu zalecana jest metoda pochodna ImageJ FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI nie wymaga instalacji i dostępne są wersje 32- i 64-bitowe. Jednym z najczęściej używanych formatów danych LSFM jest format tagged image file format (TIFF), który umożliwia przechowywanie stosów obrazów w postaci kontenera TIFF.
<ol>
	<li>Obliczanie maksymalnych rzutów z dla wszystkich stosów z (punkt menu Obraz | Stosy | Z Project (Maksymalna intensywność), wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność). Maksymalne projekcje to podejścia upraszczające dane, które zmniejszają liczbę wymiarów przestrzennych z trzech do dwóch. Dostarczony jest skrypt FIJI do przetwarzania wsadowego (plik uzupełniający 1).</li>
	<li>Połącz odpowiednie maksymalne projekcje z, aby utworzyć stosy czasu (t stosów). Zapisz je w jednym kontenerze TIFF. Należy to zrobić dla wszystkich zarejestrowanych zarodków, a także dla odpowiednich kierunków i kanałów fluorescencyjnych, jeśli ma to zastosowanie.</li>
	<li>Obróć stos z i t wokół osi z, aby wyrównać oś przednio-tylną zarodków z osią obrazu x lub y (Zdjęcie | Przekształcanie | Obrót). Przytnij stosy z wzdłuż wszystkich trzech osi obrazu i stos t na osiach obrazu x i y, tak aby pozostało tylko minimalne miejsce w buforze (20-40 pikseli wzdłuż osi x i y, 5-10 obrazów wzdłuż osi z) wokół zarodka (Zdjęcie | Dostosuj | Rozmiar płótna dla osi x i y, Obraz | Stosy | Narzędzia | Slice Keeper dla osi z).
	<ol>
		<li>Należy to zrobić indywidualnie dla wszystkich zarejestrowanych zarodków, a także zgodnie z odpowiednimi wskazówkami, jeśli ma to zastosowanie. Kanały fluorescencyjne, jeśli ma to zastosowanie, powinny być przetwarzane z identycznymi parametrami rotacji i kadrowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Udokumentuj metadane tak szczegółowo, jak to możliwe. Jako wskazówkę można użyć tabeli metadanych przykładowych zestawów danych, które znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki (tabela uzupełniająca 1).</li>
</ol>
10. Wizualizacja danych
UWAGA: Ta wytyczna dotycząca wizualizacji danych skupia się przede wszystkim na tworzeniu matryc obrazów o maksymalnej projekcji, które pokazują kilka zarejestrowanych zarodków w różnych kierunkach i/lub w czasie. W poniższych krokach opisano procedurę wizualizacji danych, która została zastosowana do przykładowych zestawów danych w celu utworzenia pokazanych rysunków i filmów wideo, do których łącza znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki.
<ol>
	<li>Połącz t stosów w wielu kierunkach (Obraz | Stosy | Narzędzia | Połącz) i/lub połącz wiele kanałów fluorescencyjnych (Zdjęcie | Kolor | Merge Channels) w celu wizualizacji struktury biologicznej i/lub procesu będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Dostosuj intensywność stosów t (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast) w zależności od potrzeb za pomocą funkcji "Set". Minimalna wyświetlana wartość powinna być ustawiona nieco powyżej sygnału tła, maksymalna wyświetlana wartość powinna skutkować wygodnym kontrastem. Udokumentuj obie wartości, ponieważ można ich użyć do konsekwentnego dopasowania odpowiednich stosów z. Korekta nadruku za pomocą funkcji "Zastosuj". W zależności od metod eksperymentalnych należy rozważyć przetworzenie wszystkich zarejestrowanych zarodków o identycznych wartościach.</li>
	<li>Zapisz stosy t o dostosowanej intensywności jako osobne pliki, nie zastępuj nieskorygowanych stosów t. Skompiluj odpowiednie stosy podrzędne z dostosowanych stosów t za pomocą dedykowanych funkcji wyboru obrazu (np. Obraz | Stosy | Narzędzia | Slice Keeper) i użyj narzędzia do montażu (Obraz | Stosy | Make Montage), aby utworzyć siatki obrazów, które można wykorzystać do projektowania postaci.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z wyłącznych obszarów zastosowań LSFM jest biologia rozwojowa. W tej dyscyplinie ważne jest przyjrzenie się żywym okazom, w przeciwnym razie procesy morfogenetyczne nie mogą być opisane w sposób dynamiczny. Eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo w LSFM opartych na komorze próbek, jak opisano tutaj, są wygodne z dwóch głównych powodów.
Wariancja otoczenia, która jest nieunikniona w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo, może być proaktywnie eliminowana. W obrazowaniu na żyw...

Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z najważniejszych technik obrazowania w naukach przyrodniczych, szczególnie w biologii komórkowej i rozwojowej. W konfokalnych mikroskopach fluorescencyjnych1, które są najnowocześniejsze w trójwymiarowym obrazowaniu fluorescencyjnym od połowy lat 90., ta sama soczewka jest używana do wzbudzania fluoroforu i wykrywania światła emisyjnego. Wiązka lasera rozświetlającego wzbudza wszystkie fluorofory wzdłuż osi oświetlenia/detekcji, a odpowiedni sygnał nieostry jest rozróżniany przed wykryciem przez otwór otworkowy. W związku z tym dla każdego dwuwymiarowego obrazu oświetlana jest cała próbka. W związku z tym dla każdego trójwymiarowego obrazu, czyli stosu przestrzennie następujących po sobie obrazów dwuwymiarowych, cały próbk jest oświetlany od kilkudziesięciu do kilkuset razy2, co sprzyja fotowybielaniu i fototoksyczności3.
Prawie dwadzieścia lat temu, technologia oparta na arkuszach świetlnych4 pojawiła się jako obiecująca alternatywa dla trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego i tym samym stała się cennym narzędziem w biologii rozwojowej5. W tym podejściu oświetlenie i detekcja są rozłączone. Soczewka iluminacyjna służy do generowania arkusza świetlnego o głębokości zaledwie kilku mikrometrów w płaszczyźnie ogniskowej prostopadle ułożonej soczewki detekcyjnej. W związku z tym dla każdego obrazu dwuwymiarowego oświetlana jest tylko cienka płaska objętość wokół płaszczyzny ogniskowej. W związku z tym, dla każdego trójwymiarowego obrazu, cała próbka jest oświetlona tylko raz, co znacznie zmniejsza fotowybielanie i fototoksyczność6. Z tego powodu mikroskopy fluorescencyjne z arkuszami świetlnymi (LSFM) oferują skuteczne rozwiązania do badania złożonych procesów w wielu biologicznie istotnych skalach i dlatego mają szczególną wartość w biologii rozwojowej, w której próbki o wielkości kilku milimetrów muszą być analizowane na poziomie subkomórkowym.
Historycznie rzecz biorąc, LSFM były oparte na komorach próbkowania7,8. W tych konfiguracjach osie oświetlenia (x) i detekcji (z) są zwykle ustawione prostopadle do osi grawitacji (y). Komory na próbki oferują dużą swobodę eksperymentowania. Po pierwsze, zapewniają duże pojemności bufora obrazowania, co z kolei ułatwia korzystanie z systemu perfuzyjnego do kontrolowania środowiska, np. w celu utrzymania określonej temperatury9 lub zastosowania stresorów biochemicznych. Co więcej, obsługują one niestandardowe metody montażu10, które są dostosowane do odpowiednich potrzeb eksperymentalnych, zachowując jednocześnie trójwymiarową, w niektórych przypadkach dynamiczną11, integralność próbki. Dodatkowo, konfiguracje oparte na komorze na próbki są zwykle wyposażone w funkcję obracania, która służy do obracania próbek wokół osi y, a tym samym obrazowania ich wzdłuż dwóch, czterech lub nawet więcej kierunków. Ponieważ zarodki powszechnie stosowanych organizmów modelowych są, w kontekście mikroskopii, stosunkowo duże, kolejne obrazowanie wzdłuż osi brzuszno-grzbietowej, bocznej i/lub przednio-tylnej ciała zapewnia bardziej wszechstronną reprezentację. Pozwala to np. na długoterminowe śledzenie komórek, które poruszają się wzdłuż złożonych trójwymiarowych ścieżek migracji12,13.
Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych została szeroko zastosowana do badania morfogenezy embrionalnej Drosophila melanogaster, zarówno systematycznie14,15, jak również ze szczególnym naciskiem na biofizyczne aspekty rozwoju. Na przykład wykorzystano go do zebrania danych morfogenetycznych o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia biomechanicznego związku między wgłębieniem endodermy a wydłużeniem osi podczas wydłużania pasma zarodkowego16 i dalej, aby powiązać złożony przepływ komórkowy z wzorcami generowania siły podczas gastrulacji17. Został również połączony z innymi najnowocześniejszymi technikami, np. optogenetyką, aby zbadać regulację sygnalizacji Wnt podczas wzorca przednio-tylnego w epidermie18.
Jednak badanie tylko jednego gatunku nie daje wglądu w ewolucję rozwoju. Aby zrozumieć embriogenezę w kontekście filogenetycznym, przeprowadzono intensywne badania z wykorzystaniem alternatywnych organizmów modelowych owadów. Jednym z najwszechstronniej zbadanych gatunków jest chrząszcz mączny Tribolium castaneum, ekonomicznie istotny przechowywany szkodnik zbożowy19, którego morfogeneza embrionalna została już również systematycznie zobrazowana za pomocą LSFM20. Morfogeneza embrionalna tych dwóch gatunków różni się znacznie w kilku aspektach, np. tryb segmentacji21, a także tworzenie i degradacja błon pozaembrionalnych22. Ten ostatni aspekt został już szeroko przeanalizowany przy użyciu LSFM. Na przykład wykazano, że surowiczka, tkanka pozaembrionalna, która otacza i chroni zarodek Tribolium przed różnymi zagrożeniami przez większą część jego embriogenezy23,24, działa również jako morfogenetyczny "sterownik" dla własnego procesu wycofywania podczas zamknięcia grzbietowego25. Ponadto wykazano, że podczas gastrulacji określony obszar blastodermy pozostaje zakotwiczony w błonie witeliny w celu wytworzenia asymetrycznych ruchów tkanki26 i, zgodnie z tą obserwacją, że regionalizacja tkanek umożliwia komórkom sekwencyjne opuszczanie krawędzi surowiczej podczas zamykania okna surowiczego27.
We wszystkich badaniach związanych z Drosophila i Tribolium, cytowanych powyżej, użyto LSFM opartych na komorze próbnej. W większości przypadków zarodki rejestrowano w wielu kierunkach za pomocą funkcji rotacji próbki. Chociaż nie zostało to wyraźnie powiedziane, można założyć, że zostały one zarejestrowane indywidualnie, a tym samym niezależnie od siebie w sekwencyjnych testach obrazowania na żywo, podobnie jak w naszej poprzedniej pracy nad Tribolium20,28. W niektórych scenariuszach takie podejście jest dopuszczalne, ale szczególnie w ilościowych podejściach porównawczych wariancja otoczenia może zniekształcić wyniki. Na przykład od dawna wiadomo, że szybkość rozwoju owadów jest zależna od temperatury29, ale nowsze badania sugerują, że u Drosophila temperatura może również wpływać na stężenie morfogenów30. W rezultacie, jeśli pewne cechy embriogenezy, np. proporcje dynamiczne, tempo podziału i prędkości migracji komórek, mają być dokładnie określone ilościowo, wymagana jest wystarczająca liczba powtórzeń bez zmienności otoczenia. Minimalizuje to odchylenia standardowe i błędy standardowe, co z kolei ułatwia zestawienie z innymi, nawet tylko nieznacznie rozbieżnymi warunkami eksperymentalnymi.
Jednak LSFM oparte na komorze na próbki są przede wszystkim przeznaczone do testów o wysokiej zawartości, a nie o wysokiej przepustowości. W przeciwieństwie do mikroskopów konfokalnych, które są zwykle wyposażone w znormalizowane mechanizmy zaciskowe do szkiełek mikroskopowych, szalek Petriego i płytek studzienkowych, prawie wszystkie LSFM oparte na komorze na próbki wykorzystują cylindryczne mechanizmy zaciskowe. Mechanizmy te są przeznaczone dla niestandardowych uchwytów na próbki, które są kompatybilne z rotacją, a także nieinwazyjne10, ale zwykle nie są przeznaczone dla więcej niż jednej próbki20,31,32. Ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo dwóch lub więcej zarodków, w których zalety konfiguracji opartych na komorze próbki nie są zagrożone, rozwiązują problem wariancji otoczenia, zwiększając tym samym wartość LSFM w badaniach porównawczych.
W naszym protokole prezentujemy eksperymentalne ramy do porównawczego obrazowania na żywo w próbkach LSFM opartych na komorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), w którym oś y jest używana jako opcja do "układania" zarodków. Po pierwsze, udostępniamy wytyczne dotyczące kalibracji opartej na mikrosferach fluorescencyjnych dla LSFM opartych na komorze na próbki, co jest szczególnie ważne w przypadku urządzeń, które nie mają asystenta kalibracji. Po drugie, opisujemy metodę mocowania wielu zarodków w oparciu o uchwyt pajęczyny28 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), która jest zgodna z rotacją próbek, a tym samym umożliwia jednoczesne obrazowanie wielu próbek w wielu kierunkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Kilka zarodków ustawia się na cienkiej warstwie agarozy, a po wprowadzeniu do komory na próbkę przesuwa się kolejno przez arkusz świetlny, aby uzyskać trójwymiarowe obrazy. Po trzecie, udostępniamy trzy przykładowe zestawy danych obrazowania na żywo dla Drosophila, a także dla Tribolium. W pierwszym przypadku zestawiamy linie transgeniczne z fluorescencyjnie znakowanymi jądrami. W przypadku tych ostatnich porównujemy wydajność podlinii transgenicznych, które przenoszą ten sam transgen, ale w różnych lokalizacjach genomowych. Na koniec omawiamy znaczenie równoległości w odniesieniu do porównawczego obrazowania na żywo i wariancji otoczenia33, dyskutujemy o limicie przepustowości naszej struktury eksperymentalnej i oceniamy adaptację naszego podejścia do innych organizmów modelowych.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td>&nbsp; </mocna></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Orange</td><td>Scientific 4430300</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium</td></tr><tr><td>35-mm i Oslash; Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila.</td></tr><tr><td>90 mm i Oslash; szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>L9004575</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Sitko do komórek o wielkości oczek</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>250 &mikro; m sito o rozmiarze oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-038</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium</td></tr><tr><td>300 &micro; m sito o rozmiarze oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-040</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium</td></tr><tr><td>710 i mikro; m sito o rozmiarze oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-050</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium</td></tr><tr><td>800 &micro; m Sito o rozmiarze oczek</td><td>VWR International</td><td>200.025.222-051</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem drobnej mąki pszennej Tribolium</td></tr><tr><td>405</td><td>Demeter e.V.</td><td>SP061006</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem pożywki Tribolium</td></tr> <tr><td>dostępnej w handlu</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-115</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila / Niestandardowe podłoże Drosophila mogą być również używane</td></tr><tr><td>mikrosfery fluorescencyjne, 1,0 i mikro; m i Oslash;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7282</td><td></td></tr><tr><td>nieaktywne suche drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-108</td><td></td></tr><tr><td>agaroza niskotopliwa</td><td>Carl Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>wąskie fiolki</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila</td></tr><tr><td>mały pędzel</td><td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr><tr><td>podchloryn sodu (NaOCl), ~12% aktywny Cl</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>Uwaga: podchloryn sodu jest</td></tr><tr><td>mąka pszenna pełnoziarnista</td><td>Demeter e.V.</td><td>SP061036</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium / Wielka Brytania:</td></tr><tr><td>fiolki o szerokości</td> mąki pełnoziarnistej <td>Genesee Scientific</td><td>32-110</td><td>Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila</td></tr></tbody></table>

jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych oferuje skuteczne rozwiązania do badania złożonych procesów w wielu biologicznie istotnych skalach. Konfiguracje oparte na komorze na próbki, które są specjalnie zaprojektowane w celu zachowania trójwymiarowej integralności próbki i zwykle charakteryzują się rotacją próbki, są najlepszym wyborem w biologii rozwoju. Na przykład wykorzystano je do udokumentowania całej morfogenezy embrionalnej muszki owocowej Drosophila melanogaster i chrząszcza mącznego Tribolium castaneum. Jednak wiele dostępnych protokołów obrazowania na żywo zapewnia tylko ramy eksperymentalne dla pojedynczych zarodków. Szczególnie w przypadku badań porównawczych takie podejścia są niewygodne, ponieważ na sekwencyjnie obrazowane próbki wpływa wariancja otoczenia. Co więcej, ogranicza to liczbę próbek, które można oznaczyć w danym czasie. Zapewniamy eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo, które zwiększają przepustowość w konfiguracjach opartych na komorze na próbki, a tym samym zapewniają podobne warunki otoczenia dla wszystkich próbek. Po pierwsze, zapewniamy wytyczne dotyczące kalibracji mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi. Po drugie, proponujemy metodę montowania wielu zarodków, która jest zgodna z rotacją próbek. Po trzecie, udostępniamy przykładowe trójwymiarowe zestawy danych obrazowania na żywo Drosophila, dla których zestawiamy trzy linie transgeniczne z fluorescencyjnie znakowanymi jądrami, a także Tribolium, dla których porównujemy wydajność trzech podlinii transgenicznych, które przenoszą ten sam transgen, ale w różnych lokalizacjach genomowych. Nasz protokół został specjalnie zaprojektowany do badań porównawczych, ponieważ proaktywnie zajmuje się wariancją otoczenia, która jest zawsze obecna w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo. Jest to szczególnie ważne dla analiz ilościowych i charakterystyki fenotypów aberracyjnych, które wynikają np. z eksperymentów z nokautem. Co więcej, zwiększa ogólną przepustowość, co jest bardzo wygodne, gdy dostęp do mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi jest ograniczony. Wreszcie, proponowana metoda montażu może być dostosowana do innych gatunków owadów i innych organizmów modelowych, np. danio pręgowanego, w zasadzie bez wysiłku optymalizacyjnego.

Nasz protokół opisuje ramy eksperymentalne dla porównawczego obrazowania fluorescencyjnego na żywo w mikroskopach LSFM opartych na komorach z próbkami. Na przykład, ramy te mogą być wykorzystane do zestawienia (i) embrionów dwóch lub więcej gatunków, (ii) embrionów linii z wyłączonym jednym lub większą liczbą genów wraz z kontrolami typu dzikiego, (iii) wielu embrionów tej samej linii transgenicznej, (iv) embrionów z różnych linii transgenicznych lub (v) embrionów z podlinii niosących ten sam transgen, ale w różnych loka...

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Mikroskopy fluorescencyjne z arkuszami świetlnymi opartymi na komorze na próbki są zaprojektowane z myślą o wysokiej zawartości, a nie o wysokiej przepustowości. Testy obrazowania na żywo muszą być zatem wykonywane sekwencyjnie, a tym samym w mniejszym stopniu zależne od zmienności otoczenia. Nasz uchwyt na pajęczynę umożliwia układanie w stosy i jednoczesne obrazowanie wielu zarodków, eliminując zmienność otoczenia i zwiększając przepustowość.Umieszczanie zarodków w uchwycie pajęczyny wymaga pewnej finezji. Film instruktażowy idealnie nadaje się do zilustrowania sekwencji wielu krótkich gestów dyrygencyjnych. Do kalibracji mikroskopu fluorescencyjnego opartego na komorze na próbkę z arkuszem świetlnym.Najpierw należy ponownie sformlizować podwielokrotność agarozy w suchym mieszalniku grzewczym w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Pozwól stopionej agarozie ostygnąć do 35 stopni Celsjusza i przenieś 50 mikrolitrów agarozy do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Zmieszać 0,5 mikrolitra roztworu mikrosfery fluorescencyjnej z agarozą z prędkością 1 400 obrotów na minutę przez jedną minutę i wypełnić szczelinowy otwór w uchwycie pajęczyny 10 mikrolitrami mieszaniny roztworu mikrosfery fluorescencyjnej agarozy.Odessać jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozy i pozwól agarozie zestalić się przez 30 do 60 sekund. Napełnij komorę na próbkę autoklawowaną wodą z kranu i powoli włóż uchwyt pajęczyny do komory na próbkę. Przesuń otwór podłużny przed soczewkę detekcyjną i obróć uchwyt do pozycji 45 stopni w stosunku do osi oświetlenia i wykrywania.Uchwyt pajęczyny nie powinien być widoczny w kanale światła transmisyjnego. Przełącz się na odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj moc lasera oraz czas naświetlania, tak aby mikrosfery fluorescencyjne dostarczały odpowiedni sygnał. Określ objętość widoku, która całkowicie pokrywa teraz poprzecznie zorientowaną folię agarozową i oblicz maksymalną możliwą rozdzielczość osiową dla odpowiedniej kombinacji soczewek oświetleniowych i detekcyjnych, aby zdefiniować odstęp Z.Następnie zapisz trójwymiarowy stos testowy Z mikrosfer fluorescencyjnych i porównaj maksymalne projekcje X, Y i Z z tabelą kalibracyjną. Jeśli mikrosfery wydają się rozmyte, rozmyte i/lub zniekształcone. Dostosuj położenie soczewek oświetlenia i/lub detekcji.W celu dechorionacji zarodka dodaj osiem mililitrów autoklawizowanej wody z kranu do studzienek A1, A2, A3 i B3 z jedną sześciodołkową płytką na linię. Następnie dodaj siedem mililitrów autoklalawowanej wody z kranu i jeden mililitr roztworu podchlorynu sodu do studzienek B1 i B2. Umieścić pierwszą płytkę pod mikroskopem stereoskopowym i wprowadzić pierwszy zarodek zawierający sitko do komórek do dołka A1.Myj zarodki pod delikatnym mieszaniem przez 30 do 60 sekund, zanim przeniesiesz sitko do dołka B1. Potrząsaj energicznie płytką przez 30 sekund, a następnie przenieś sitko do dołka A2. Myj zarodki przez jedną minutę pod delikatnym mieszaniem i przenieś sitko do studzienki B2 w celu energicznego potrząsania, aż większość zarodków całkowicie ulegnie dechorionacji.Następnie przenieść sitko do studzienki A3 na jedną minutę delikatnego mycia, a następnie przechowywać sitko z dekorionowanymi zarodkami w basenie B3 do czasu, aż zarodki innych linii zostaną potraktowane zgodnie z wykazanymi metodami. Aby zamontować zarodki na uchwycie pajęczyny, należy ponownie upłynnić kolejną porcję agarozy, jak pokazano. Gdy agaroza ostygnie, umieść uchwyt pajęczyny pod mikroskopem stereoskopowym i dodaj 10 mikrolitrów agarozy na szczelinowy otwór.Użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić agarozę po szczelinowym otworze, a następnie zassaj jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozy. Gdy agaroza zastygnie, użyj pędzla, aby ostrożnie wybrać i przenieść zarodki na folię agarozową. Ułóż je wzdłuż długiej osi otworu szczelinowego, tak aby ich oś przednio-tylna była wyrównana z długą osią otworu podłużnego.Aby ustabilizować zarodki, ostrożnie odpipetuj od jednego do dwóch mikrolitrów agarozy w szczelinę między zarodkami a folią agarozową. Gdy agaroza zastygnie, powoli włóż uchwyt pajęczyny z zamontowanymi zarodkami do komory na próbki wypełnionej buforem obrazu. Aby zobrazować zarodki, upewnij się, że uchwyt pajęczyny znajduje się w pozycji 45 stopni względem osi oświetlenia i detekcji, a w kanale światła transmisyjnego przesuń zarodek do środka pola widzenia.Uchwyt na pajęczynę nie powinien być widoczny. Następnie przesuwaj zarodek ze stopniem mikrotranslacji w Z, aż środkowa płaszczyzna zarodka nałoży się na płaszczyznę ogniskową, a kontur stanie się ostry. Nie przełączając się na kanał fluorescencyjny, przesuń zarodek o 250 mikronów w obu kierunkach, aby określić objętość widzenia.Jeśli wymagane jest obrazowanie w wielu kierunkach, należy odpowiednio obrócić zarodek, ustawić ostrość zarodka i określić objętość widzenia, jak właśnie pokazano. Następnie powtórz tę procedurę dla wszystkich pozostałych zamontowanych zarodków. Po określeniu objętości widzenia dla wszystkich zarodków należy określić parametry kanału fluorescencji i filmu poklatkowego, a następnie rozpocząć proces obrazowania.W przypadku testów trwających kilka dni należy rozważyć przynajmniej częściowe zakrycie otworu komory próbki, aby zmniejszyć parowanie. Po zakończeniu badania obrazowego ostrożnie wyjmij uchwyt pajęczyny z komory na próbkę i za pomocą małego pędzla oderwij zarodki od filmu agarozowego i umieść zarodki na odpowiednio oznakowanym szkiełku mikroskopowym. Umieścić szkiełko w naczyniu do pobierania w celu inkubacji w odpowiednich standardowych warunkach chowu.W miarę zbliżania się punktu wylęgu należy często sprawdzać szalki do pobierania i przenosić wyklute larwy do indywidualnych dołków na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki do połowy odpowiednią pożywką wzrostową, a następnie wysiaduj larwy w odpowiednich standardowych warunkach chowu. Gdy obserwowane osobniki osiągną dorosłość, należy zapewnić odpowiednich partnerów do krycia i po kilku dniach sprawdzić potomstwo.Na tym filmie można zaobserwować dynamikę sygnału fluorescencyjnego trzech zarodków pochodzących z różnych transgenicznych linii Drosophila w okresie około jednego dnia. Spodziewano się podobnego wzorca fluorescencji, ponieważ wszystkie linie wyrażały zlokalizowany jądrowo EGFP pod kontrolą przypuszczalnie wszechobecnych i składnikowo aktywnych promotorów. Porównawcze wyniki obrazowania na żywo ujawniły jednak silne przestrzenne różnice czasowe we wzorcach ekspresji, które nie były efektami wtórnymi wynikającymi z wariancji otoczenia.W tej analizie trzech zarodków Tribolium zawierających ten sam transgen oparty na piggybacku. Porównawcze wyniki obrazowania na żywo procesu zamykania okna surowiczego podczas gastrulacji sugerują, że druga podlinia zapewnia znacznie silniejszy ogólny sygnał niż pozostałe dwie podlinie. Jak wskazują te dane, kontekst genomiczny może mieć również silny wpływ na poziom ekspresji transgenów w Tribolium.Nasze podejście doskonale nadaje się do analizy fenotypów knockdown i knockout, ponieważ pozwala na jednoczesne obrazowanie zarodków kontrolnych typu dzikiego. Nasz protokół może być również wykorzystany do porównania morfogenezy dwóch lub więcej gatunków owadów. W ten sposób uzyskasz głębszy wgląd w ewolucję rozwoju.

simultaneous-live-imaging-multiple-insect-embryos-sample-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila w mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi. Protokół z uchwytem typu pajęczyna eliminuje wariancję otoczenia i zwiększa przepustowość badań w biologii rozwoju.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Przeglądaj więcej filmów