Name: Elektrooporyzacja komórek uwidoczniona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Poznaj elektrooporową fuzję komórek melanoma myszy in vitro z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody przylegania. Technika ta umożliwia wizualizację i ocenę wydajności fuzji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Słowiańską Agencję Badawczą (projekt J2-9764 i program P2-0249). To wideo stanowi materiał uzupełniający dla warsztatów naukowych i kursu podyplomowego „Electroporation-based Technologies and Treatments”, zorganizowanych przez Wydział Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie w Słowenii.

I. Obciążanie komórek markerami komórkowymi CMFDA i CMRA
<ol>
 <li>Doświadczenia przeprowadzono na wcześniej przygotowanych komórkach linii czerniaka mysiego (B16-F1). Komórki hodowano w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych o powierzchni 25 cm2 (TPP, ZDA) do osiągnięcia 70-80 % konfluencji w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) uzupełnionej o 10 % płodowej surowicy bydlęcej, 0,15 mg/ml L-glutaminy, 16 mg/ml gentamycyny (wszystkie od Sigma-Aldrich, Niemcy) oraz 20 jednostek/ml krystacyliny (Pliva, Chorwacja), inkubując je w 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Przygotować dwa roztwory stokowe Cell trackers (Invitrogen, USA) o stężeniu 10 mM, dodając 10,76 μl oraz 9 μl (odpowiednio dla Green CMFDA i Orange CMRA) DMSO (Sigma-Aldrich, Niemcy) do 50 μg barwnika w oryginalnej fiolce Invitrogen. Roztwór stokowy można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy. Przed rozpoczęciem doświadczeń należy ogrzać roztwór do czasu rozpuszczenia kryształów DMSO.</li>
 <li>Przygotować bezwęglanowy bufor Krebsa-Hepesa (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 11,7 mM D-glukozy, 1,3 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4). W dwóch probówkach Eppendorf o pojemności 15 ml oddzielnie zmieszać 2,1 μl każdego roztworu stokowego (odpowiednio 10 mM CMFDA lub CMRA) w 3 ml bezwęglanowego buforu Krebsa-Hepesa. W ten sposób otrzymuje się „roztwór ładujący” zawierający około 7 μM CMFDA (lub CMRA).</li>
 <li>Przepłukać komórki dwukrotnie bezwęglanowym buforem Krebsa-Hepesa, a następnie wprowadzić roztwory ładujące do kolb. Inkubować komórki przez 30 minut w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Podczas tej pierwszej inkubacji odczynniki swobodnie przenikają przez błony komórkowe, lecz po dostaniu się do wnętrza komórki są przekształcane w nieprzenikające przez błony fluorescencyjne produkty reakcji.</li>
 <li>Po pierwszej inkubacji przepłukać komórki i inkubować je w pożywce hodowlanej przez kolejne dwie godziny w 5% CO2 w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Ztrypsynizować komórki w obu kolbach (załadowane CMFDA i CMRA) i zmieszać komórki czerwone i zielone w stosunku 1:1 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (TPP, ZDA). Dostosować stężenie komórek do 5 x 106 komórek/ml poprzez rozcieńczenie pożywką DMEM lub zagęszczenie za pomocą wirówki. Nanieść kroplę 20 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 24-dołkowej (TPP, ZDA). Inkubować komórki w 5 % CO2 w temperaturze 37 °C przez 20 min, aby pozwolić im lekko przytwierdzić się do powierzchni dołka i nawiązać kontakty międzykomórkowe.</li>
</ol>
II. Elektrofuzyjna
<ol>
 <li>Przygotować izoosmolarny bufor fosforanowo-potasowy (10 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 1mM MgCl2, 250 mM sacharozy) oraz hipoosmolarny bufor fosforanowo-potasowy (10 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 1mM MgCl2, 75 mM sacharozy).</li>
 <li>Umieścić wielodołek z komórkami na stole mikroskopu, wypozycjonować elektrody na dnie dołka i podłączyć je do generatora impulsów.</li>
 <li>Przemyć komórki 1 ml izoosmolarnego buforu fosforanowo-potasowego. Dodać 350 μl hipoosmolarnego buforu fosforanowo-potasowego w celu wywołania pęcznienia komórek. Bufor powinien zakrywać elektrody.</li>
 <li>Pozostawić komórki w buforze hipoosmolarnym przez 2 minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. W tym czasie napływ cząsteczek wody do wnętrza komórek, wynikający z niezrównoważenia osmotycznego między wnętrzem a zewnętrzem komórek, powoduje zwiększenie ich objętości. Impulsy elektryczne należy zastosować, gdy komórki osiągną objętość bliską maksymalnej, przed rozpoczęciem regulacyjnego zmniejszenia objętości.</li>
 <li>Aby uzyskać optymalną elektrofuzję i zachować żywotność komórek, należy zastosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. Zależą one od użytej linii komórkowej [1]. W tym doświadczeniu do każdej próbki przyłożono serię 8 impulsów prostokątnych (każdy o czasie trwania 10 μs przy 1 Hz), korzystając z urządzenia do elektroporacji (w naszym przypadku Cliniporator, IGEA, Włochy). Impulsy są dostarczane do dwóch równoległych elektrod z drutu Pt/Ir o średnicy 0,8 mm i odległości 5 mm między nimi, co tworzy pole elektryczne o natężeniu około 1200 V/cm między elektrodami w każdym dołku, z wyjątkiem dołka kontrolnego.</li>
 <li>Pozostawić komórki w spokoju przez 10 minut po dostarczeniu impulsów. Ustalić wydajność fuzji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fazokontrastowej.</li>
</ol>
III. Pozyskiwanie obrazów i wyznaczanie wydajności fuzji
<ol>
 <li>Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss AxioVert 20, Zeiss, Niemcy) wyposażonego w obiektyw (x20) oraz chłodzoną kamerę CCD (VisiCam 1280, Visitron, Niemcy). Obrazy są pozyskiwane przy użyciu oprogramowania MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), lecz można zastosować inne podobne oprogramowanie do akwizycji. CMFDA jest wzbudzany monochromatorem (Polychrome IV, Visitron, Niemcy) przy 492 nm, a CMRA przy 548 nm. Fluorescencję CMFDA i CMRA rejestruje się za pomocą dwóch filtrów emisyjnych, jeden wycentrowany na 535 nm (HQ535/30m, dla CMFDA), a drugi na 510 nm (D605/5m, dla CMRA, oba Chroma, USA). Zastosowanie lustra dichroicznego (Q515LP) zapobiega przenikaniu sygnału między kanałami.</li>
 <li>Należy pozyskać trzy obrazy (kontrast fazowy, fluorescencja czerwona i zielona) dla pięciu losowo wybranych pól w każdej studience. Z każdej tripletu obrazów należy stworzyć obrazy trójkanałowe. Na takim obrazie można zaobserwować fluorescencyjną cytoplazmę wraz z błonami komórkowymi. Dzięki temu można łatwo zidentyfikować zfuzowane komórki [Rysunek 1].</li>
 <li>Należy policzyć wszystkie trzy typy komórek (czerwone, zielone i podwójnie fluorescencyjne) na każdym obrazie trójkanałowym. Procent komórek podwójnie fluorescencyjnych wyznacza się, dzieląc liczbę komórek podwójnie fluorescencyjnych przez całkowitą liczbę komórek na każdym obrazie. Wydajność fuzji definiuje się jako procent komórek podwójnie fluorescencyjnych pomnożony przez 2, ponieważ połowa zfuzowanych komórek nie jest wykrywana (w przypadku fuzji komórek o tym samym kolorze).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy komórek drożdży; fluorescencja uwidacznia białka czerwone i zielone wewnątrz komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Trójkanałowy obraz mikroskopowy komórek B16F1 po elektrofuzyjnym łączeniu: kontrast fazowy, fluorescencja CMRA (wzbudzenie przy 548 nm) oraz fluorescencja CMFDA (wzbudzenie przy 492 nm), powiększenie obiektywu 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zdolność błon komórkowych do nieswoistej fuzji, np. pod wpływem zewnętrznych pól elektrycznych, jest istotna dla biotechnologii, medycyny i badań biologicznych. Taka nieswoista fuzja umożliwia otrzymywanie niezwykle cennych hybryd komórkowych oraz ich produktów, takich jak przeciwciała monoklonalne, a także dostarcza informacji o fundamentalnych mechanizmach fuzji [2]. Elektrofuzja jest potencjalnie bardzo skuteczną metodą, ponieważ można ją odpowiednio dostosować do różnych typów komórek. Elektrofuzja zachodzi, gdy komórki w bliskim kontakcie fizycznym zostają wprowadzone w stan fusogenny (podatny na fuzję) za pomocą impulsów elektrycznych o wysokim napięciu. Efektywność elektrofuzji zależy od różnych parametrów wpływających na dwie etapy procesu. Pierwszym etapem procesu elektrofuzji jest uzyskanie bliskiego kontaktu fizycznego między komórkami, co można osiągnąć różnymi metodami [3-8]. Metodę adhezyjną (hodowlę komórek do osiągnięcia konfluencji) można stosować efektywnie dzięki spontanicznemu nawiązywaniu kontaktów komórkowych w rozległych strefach między komórkami; prowadzi ona jednak do powstania bardzo dużych fuzowanych komórek z wieloma jądrami. Stosujemy zmodyfikowaną metodę adhezyjną, w której otrzymuje się mniejsze komórki (z 2 do 5 jąder), które mają większą szansę na przeżycie i proliferację (Rycina 1). Kontakt między komórkami jest dodatkowo wspomagany przez osmotyczne pęcznienie komórek, wynikające z zastosowanej w eksperymencie obróbki osmotycznej [9]. Drugim etapem procesu elektrofuzji jest wprowadzenie błon komórkowych w stan fusogenny. Stan fusogenny ściśle koreluje ze stanem elektroprepermeabilizacji błony (komórki stają się nieswoiście przepuszczalne dla cząsteczek, które normalnie nie mogą przenikać przez nienaruszoną błonę) i jest sterowany przez te same parametry impulsów elektrycznych (amplitudę, czas trwania, liczbę i częstotliwość) [10]. Wartości parametrów elektrycznych niezbędne do optymalnej elektroporacji [1] i elektrofuzji różnią się w zależności od rodzaju komórek oraz zależą od ich wielkości i właściwości biologicznych. Parametry elektryczne muszą zatem zostać zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych wykorzystywanych jako partnerzy fuzji, aby uzyskać skuteczną fuzję.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Cytosolowy barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Cytosolowy barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Pożywka Eagle modyfikowana przez Dulbecco&amp;rsquo;&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>krystacylina</td><td>Odczynnik</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Odczynnik</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sukroza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów elektrycznych</td><td>Narzędzie</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa</td><td>Narzędzie</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Probetka wirówkowa 50 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Probetka wirówkowa 15 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Narzędzie</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody</td><td>Narzędzie</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Elektrofuzja komórek jest bezpieczną, niewirusową i niechemiczną metodą, która może być stosowana do przygotowywania komórek hybrydalnych do terapii ludzi. Elektrofuzja polega na przyłożeniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do komórek znajdujących się w bliskim kontakcie. Zastosowanie krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu powoduje destabilizację błon plazmatycznych komórek. Zdestabilizowane błony stają się bardziej przepuszczalne dla różnych cząsteczek, a także bardziej podatne na fuzję z sąsiednimi, zdestabilizowanymi błonami. Elektrofuzja jest zatem wygodną metodą umożliwiającą niespecyficzną fuzję bardzo różnych typów komórek.in vitroAby uzyskać fuzję, błony komórkowe, zdestabilizowane przez pole elektryczne, muszą znajdować się w bliskim kontakcie, co umożliwia połączenie ich dwuwarstw lipidowych, a w konsekwencji ich cytoplazmy. W tym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórekin vitroza pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej. W tej metodzie komórkom pozwala się jedynie na słabsze przytwierdzenie do powierzchni dołka, tak aby możliwe było wymienienie medium przy jednoczesnym zachowaniu przez komórki ich sferycznego kształtu. Wizualizację fuzji ocenia się poprzez wstępne znakowanie cytoplazmy komórek różnymi fluorescencyjnymi barwnikami typu cell tracker; połowę komórek znakuje się pomarańczowym CMRA, a drugą połowę zielonym CMFDA. Wydajność fuzji określa się jako liczbę komórek dwubarwnych podzieloną przez całkowitą liczbę komórek i pomnożoną przez dwa.

W niniejszym filmie prezentujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adhezyjnej z wykorzystaniem elektroporacji oraz późniejszą detekcję i wizualizację sfuzowanych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Elektrofuzja komórek to bezpieczna, niewirusowa i niechemiczna metoda, która może być stosowana do przygotowywania komórek hybrydowych do terapii ludzi. Elektrofuzja polega na...

Elektrofuzja polega na przykładaniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do komórek znajdujących się w bliskim kontakcie. W tym filmie prezentujemy elektrofuzję komórek in vitro z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody adhezyjnej (Adherence Method). Eksperymenty przeprowadzono na liniach komórkowych czerniaka mysiego, BF1.W celu przeprowadzenia eksperymentu należy wykonać następujące kroki. Hodować komórki w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych do osiągnięcia 80% konfluencji. Następnie dodać oddzielnie 2.1 µL każdego z roztworów stokowych.10 milimolarne C-M-F-D-A lub odpowiednio CMRA do trzech mililitrów buforu Krebsa-Hessa w probówce wirówkowej. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem Krebsa-Hessa, a następnie wprowadzić roztwory ładujące do kolb. Roztwory ładujące zawierają odpowiednio około siedem mikromolarne C-M-F-D-A lub CMRA.Inkubować komórki przez 30 minut w kontrolowanej atmosferze. Podczas tej pierwszej inkubacji regiony swobodnie przenikają przez błony komórkowe do cytozolu, gdzie przekształcają się w produkty reakcji przenikające przez błonę IMP. Po tej pierwszej inkubacji wypłukać, a następnie inkubować komórki w pożywce hodowlanej przez kolejne dwie godziny.Komórki obserwuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Należy ustawić długość fali wzbudzenia na 548 nanometrów i wybrać odpowiedni filtr pasmowy dla obrazu fluorescencji komórek obciążonych CMRA; dla komórek obciążonych C-M-F-D-A należy ustawić długość fali wzbudzenia na 492 nanometrów i wybrać filtr pasmowy dla zielonej fluorescencji. Należy zliczyć komórki w obu kolbach, a następnie zmieszać komórki czerwone i zielone w stosunku 1:1, dostosowując stężenie komórek do 5 milionów komórek per mililitr.Nanieś kroplę 20 µL zawiesiny komórek na środek każdego dołka. W 24-dołkowej płytce inkubuj komórki w kontrolowanej atmosferze przez 20 minut, aby umożliwić im lekkie przytwierdzenie do powierzchni dołka w formie monowarstwy i nawiązanie kontaktów międzykomórkowych. Umieść płytkę z komórkami na stoliku mikroskopu.Umieść elektrody na dnie studzienki i podłącz je do generatora impulsów. Aby uzyskać optymalną elektrofuzję i zachować żywotność komórek, należy zastosować odpowiednie parametry impulsów elektrycznych. Parametry te zależą od linii komórkowej i powinny zostać określone w eksperymentach wstępnych. Usuń medium hodowlane i przemyj komórki jednym mililitrem buforu fosforanowego ISO omu, a następnie 350 µL buforu fosforanowego hypos Miller, aby wywołać obrzęk komórek.Pozostaw komórki w buforze hiperosmolarnym przez dwie minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. Impulsy elektryczne powinny zostać przyłożone, gdy komórki osiągną objętość bliską maksymalnej, tj. zanim rozpocznie się regulacja objętości.Spadek w naszym eksperymencie. Zastosowano serię ośmiu impulsów prostokątnych o czasie trwania 100 mikrosekund przy częstotliwości 1 herca. Po podaniu impulsów.Pozostaw komórki w spokoju na 10 minut. Wyznacz wydajność dyfuzji za pomocą mikroskopu kontrastowego i fluorescencyjnego. Należy wykonać trzy obrazy: w kontraście fazowym oraz w fluorescencji czerwonej i zielonej w pięciu losowo wybranych polach widzenia.W każdym przypadku, przy użyciu oprogramowania ImageJ, z każdej triplety obrazów utworzono obrazy trójekanałowe, aby poprawić ich jakość wizualną. Do oryginalnych obrazów zastosowano etapy wstępnego przetwarzania: odejmowanie tła oraz poprawę kontrastu z wykorzystaniem domyślnych zestawów parametrów. Na koniec, za pomocą wtyczki RGB to Gray w ImageJ, stworzono obrazy trójekanałowe. Na tak przygotowanym obrazie widoczna jest cytoplazma w stanie spoczynku wraz z błonami komórkowymi.W ten sposób można łatwo określić liczbę niewielkiej ilości komórek w obrazie trójątkowym, zliczając wszystkie trzy typy komórek: czerwone, zielone oraz dwukrotnie fluorescencyjne. Wyznacz procent komórek dwukrotnie fluorescencyjnych, dzieląc ich liczbę przez całkowitą liczbę komórek w każdym obrazie. Wydajność fuzji definiuje się następnie jako procent komórek dwukrotnie fluorescencyjnych pomnożony przez dwa.Ponieważ połowa komórek widzenia nie jest wykrywana, gdy komórki mają widoki tego samego koloru.

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektrofuzja komórkowa wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Źródło: Aigrain, L. i in. Internalizacja i obserwacja fluorescencyjnych biomolekuł w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji.  J. Vis. Exp. (2015)Film pokazuje dostarczanie fluorescencyjnych biomolekuł do elektrokompetentnych komórek mikrobiologicznych za pomocą elektroporacji. Proces rozpoczyna się od wprowadzenia DNA lub białek oznaczonych fluoroforem do schłodzonej zawiesiny komórkowej. Następnie stosuje się impuls wysokiego napięcia, aby utworzyć tymczasowe pory błonowe,...

Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Celem tego protokołu jest połączenie dwóch różnych typów komórek w celu stworzenia komórek hybrydowych. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej połączonych komórek służy do śledzenia komórki pochodzenia organelli komórkowych. Test ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób struktura i funkcja komórkowa reagują na zakłócenia spowodowane fuzją komórek.

Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

Poznaj elektrooporową fuzję komórek melanoma myszy in vitro z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody przylegania. Technika ta umożliwia wizualizację i ocenę wydajności fuzji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja elektrofuzyjnej fuzji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów