Elektrooporyzacja komórek uwidoczniona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
1 lipca 2010
W tym filmie demonstrujemy efektywną elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody adherencji z wykorzystaniem elektroporacji i późniejszej wizualizacji zrośniętych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Elektrofuzja polega na zastosowaniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do ogniw w bliskim kontekście. W tym filmie demonstrujemy elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody Adherence. Eksperymenty przeprowadzono na mysich komórkach czerniaka, BF jeden.
Na potrzeby eksperymentu wykonaj następujące kroki. Hoduj komórki w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych do 80% konfluencji. Oddzielnie dodać 2,1 mikrolitra każdego roztworu podstawowego.
10 milimolowych C-M-F-D-A lub CMRA odpowiednio do trzech mililitrów buforu Krebs Hess w probówce wirówkowej. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem Krebsa Hessa, a następnie włożyć roztwory ładujące do kolb. Roztwory obciążeniowe zawierają odpowiednio około siedmiu mikromolowych C-M-F-D-A lub CMRA.
Inkubować komórki przez 30 minut w kontrolowanej atmosferze. Podczas tej pierwszej inkubacji regiony swobodnie przechodzą przez błony komórkowe do cytozolu, gdzie są przekształcane w produkty reakcji przenikające błonę IMP. Po tej pierwszej inkubacji przepłukać, a następnie inkubować komórki z pożywką hodowlaną przez kolejne dwie godziny.
Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD w oprogramowaniu akwizycyjnym. Ustaw długość fali wzbudzenia na 548 nanometrów i wybierz odpowiedni obraz fluorescencji zagrożenia filtrem pasmowo-przepustowym komórek załadowanych CMRA dla komórek załadowanych C-M-F-D-A. Ustaw długość fali wzbudzenia na 492 nanometry i wybierz filtr pasmowo-przepustowy dla zielonego obrazu fluorescencji oczu trypsyny, policz komórki w obu kolbach i wymieszaj ze sobą czerwone i zielone komórki W stosunku jeden do jednego dostosuj stężenie komórek do 5 milionów komórek na mililitr.
Umieść kroplę zawiesiny komórek o pojemności 20 mikrolitrów na środku każdej studzienki. Na 24 płytkach wielodołkowych inkubować komórki w kontrolowanej atmosferze przez 20 minut, aby umożliwić komórkom lekkie przyczepienie się do powierzchni studzienki w monowarstwie i nawiązanie kontaktów komórkowych między sobą. Umieść studzienkę wielostudzienkową z komórkami na stoliku mikroskopu.
Umieść elektrody na dnie studni i podłącz je do generatora impulsów Aby osiągnąć optymalną elektrofuzję i utrzymać żywotność ogniw, należy stosować odpowiednie parametry impulsów elektrycznych. Parametry te zależą od linii komórkowej i powinny być określone we wstępnych eksperymentach. Usunąć pożywkę hodowlaną i umyć komórki jednym mililitrem buforu fosforanu potasu ISO omu o pojemności 350 mikrolitrów buforu fosforanu potasu hypos Millera w celu wywołania obrzęku komórek.
Pozostaw komórki w hiperosmatycznym buforze na dwie minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. Impulsy elektryczne powinny być stosowane, gdy ogniwa są bliskie swojej maksymalnej objętości. To znaczy, zanim rozpoczną regulację głośności.
Spadek w naszym eksperymencie. Zastosowano ciąg ośmiu prostokątnych impulsów o czasie trwania 100 mikrosekund w jednym hercu. Po podaniu impulsowym.
Pozostaw komórki w spokoju na 10 minut po 10 minutach. Określona wydajność dyfuzji za pomocą kontrastu czołowego i mikroskopu fluorescencyjnego. E uzyskuje trzy obrazy, kontrast twarzy, czerwoną i zieloną fluorescencję w pięciu losowo wybranych polach widzenia.
W każdym z nich utwórz trzy obrazy kanałów z każdej trójki obrazu w oprogramowaniu J w celu poprawy jakości wizualnej obrazów, aby kroki wstępnego przetwarzania można zastosować do oryginalnych obrazów, tła, odejmowania i kontrastu z domyślnymi zestawami parametrów. Na koniec obrazy trzech kanałów są komponowane za pomocą wtyczki RGB do szarego obrazu J. Na takim obrazie można zobaczyć spoczynkową cytoplazmę wraz z błonami komórkowymi.
W ten sposób niewiele komórek można łatwo określić w trzykanałowej liczbie obrazów wszystkich trzech typów komórek, czerwonych, zielonych i podwójnie fluorescencyjnych. Określ procent komórek dwufluorescencyjnych, dzieląc liczbę komórek dwufluorescencyjnych przez liczbę wszystkich komórek na każdym obrazie. Wydajność fuzji jest następnie definiowana jako procent podwójnie fluorescencyjnych komórek pomnożony przez dwa.
Ponieważ połowa komórek widoku nie jest wykrywana, gdy wyświetlane są komórki tego samego koloru.
Przegląd
To wideo demonstruje efektywną elektrofuzję komórek in vitro przy użyciu zmodyfikowanej metody adhezji w połączeniu z elektroporacją. Proces obejmuje wykrywanie stopnionych komórek za pomocą mikroskopi fluorescencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Techniki fuzji komórek
- Metody elektroporacji
- Zastosowania mikroskopi fluorescencyjnej
Tło
- Elektrofuzja to technika, która stosuje impulsy elektryczne, aby ułatwić fuzję komórek.
- Metoda może zwiększyć efektywność tworzenia komórek hybrydowych.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację stopnionych komórek.
- Zrozumienie fuzji komórek jest kluczowe dla różnych zastosowań biologicznych.
Cel badania
- Aby zademonstrować niezawodną metodę elektrofuzji komórek.
- Aby wizualizować i ilościowo określić efektywność fuzji komórek.
- Aby dostarczyć protokół, który można zastosować w innych laboratoriach.
Stosowane metody
- Komórki ludzkiego czerniaka zostały hodowane i przygotowane do fuzji.
- Za pomocą barwników fluorescencyjnych oznakowano komórki przed fuzją.
- Zastosowano impulsy elektryczne, aby wywołać fuzję komórek.
- Mikroskopi fluorescencyjnej zastosowano do analizy wyników fuzji.
Główne wyniki
- Udało się osiągnąć fuzję komórek, co wskazano poprzez fluorescencję.
- Obliczono odsetek podwójnie fluorescencyjnych komórek, aby określić wydajność fuzji.
- Zidentyfikowano optymalne parametry impulsów elektrycznych dla żywotności komórek.
- Jakość wizualną obrazów poprawiono dzięki technikom przetwarzania obrazów.
Wnioski
- Zmodyfikowana metoda adhezji jest skuteczna w elektrofuzji komórek.
- Mikroskopia fluorescencyjna jest cennym narzędziem do oceny efektywności fuzji.
- Ten protokół można zastosować do różnych typów komórek w badaniach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
