Elektrooporyzacja komórek uwidoczniona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Elektrofuzja polega na zastosowaniu krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu do ogniw w bliskim kontekście. W tym filmie demonstrujemy elektrofuzję komórek in vitro za pomocą zmodyfikowanej metody Adherence. Eksperymenty przeprowadzono na mysich komórkach czerniaka, BF jeden.

Na potrzeby eksperymentu wykonaj następujące kroki. Hoduj komórki w dwóch oddzielnych kolbach hodowlanych do 80% konfluencji. Oddzielnie dodać 2,1 mikrolitra każdego roztworu podstawowego.

10 milimolowych C-M-F-D-A lub CMRA odpowiednio do trzech mililitrów buforu Krebs Hess w probówce wirówkowej. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem Krebsa Hessa, a następnie włożyć roztwory ładujące do kolb. Roztwory obciążeniowe zawierają odpowiednio około siedmiu mikromolowych C-M-F-D-A lub CMRA.

Inkubować komórki przez 30 minut w kontrolowanej atmosferze. Podczas tej pierwszej inkubacji regiony swobodnie przechodzą przez błony komórkowe do cytozolu, gdzie są przekształcane w produkty reakcji przenikające błonę IMP. Po tej pierwszej inkubacji przepłukać, a następnie inkubować komórki z pożywką hodowlaną przez kolejne dwie godziny.

Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD w oprogramowaniu akwizycyjnym. Ustaw długość fali wzbudzenia na 548 nanometrów i wybierz odpowiedni obraz fluorescencji zagrożenia filtrem pasmowo-przepustowym komórek załadowanych CMRA dla komórek załadowanych C-M-F-D-A. Ustaw długość fali wzbudzenia na 492 nanometry i wybierz filtr pasmowo-przepustowy dla zielonego obrazu fluorescencji oczu trypsyny, policz komórki w obu kolbach i wymieszaj ze sobą czerwone i zielone komórki W stosunku jeden do jednego dostosuj stężenie komórek do 5 milionów komórek na mililitr.

Umieść kroplę zawiesiny komórek o pojemności 20 mikrolitrów na środku każdej studzienki. Na 24 płytkach wielodołkowych inkubować komórki w kontrolowanej atmosferze przez 20 minut, aby umożliwić komórkom lekkie przyczepienie się do powierzchni studzienki w monowarstwie i nawiązanie kontaktów komórkowych między sobą. Umieść studzienkę wielostudzienkową z komórkami na stoliku mikroskopu.

Umieść elektrody na dnie studni i podłącz je do generatora impulsów Aby osiągnąć optymalną elektrofuzję i utrzymać żywotność ogniw, należy stosować odpowiednie parametry impulsów elektrycznych. Parametry te zależą od linii komórkowej i powinny być określone we wstępnych eksperymentach. Usunąć pożywkę hodowlaną i umyć komórki jednym mililitrem buforu fosforanu potasu ISO omu o pojemności 350 mikrolitrów buforu fosforanu potasu hypos Millera w celu wywołania obrzęku komórek.

Pozostaw komórki w hiperosmatycznym buforze na dwie minuty przed zastosowaniem impulsów elektrycznych. Impulsy elektryczne powinny być stosowane, gdy ogniwa są bliskie swojej maksymalnej objętości. To znaczy, zanim rozpoczną regulację głośności.

Spadek w naszym eksperymencie. Zastosowano ciąg ośmiu prostokątnych impulsów o czasie trwania 100 mikrosekund w jednym hercu. Po podaniu impulsowym.

Pozostaw komórki w spokoju na 10 minut po 10 minutach. Określona wydajność dyfuzji za pomocą kontrastu czołowego i mikroskopu fluorescencyjnego. E uzyskuje trzy obrazy, kontrast twarzy, czerwoną i zieloną fluorescencję w pięciu losowo wybranych polach widzenia.

W każdym z nich utwórz trzy obrazy kanałów z każdej trójki obrazu w oprogramowaniu J w celu poprawy jakości wizualnej obrazów, aby kroki wstępnego przetwarzania można zastosować do oryginalnych obrazów, tła, odejmowania i kontrastu z domyślnymi zestawami parametrów. Na koniec obrazy trzech kanałów są komponowane za pomocą wtyczki RGB do szarego obrazu J. Na takim obrazie można zobaczyć spoczynkową cytoplazmę wraz z błonami komórkowymi.

W ten sposób niewiele komórek można łatwo określić w trzykanałowej liczbie obrazów wszystkich trzech typów komórek, czerwonych, zielonych i podwójnie fluorescencyjnych. Określ procent komórek dwufluorescencyjnych, dzieląc liczbę komórek dwufluorescencyjnych przez liczbę wszystkich komórek na każdym obrazie. Wydajność fuzji jest następnie definiowana jako procent podwójnie fluorescencyjnych komórek pomnożony przez dwa.

Ponieważ połowa komórek widoku nie jest wykrywana, gdy wyświetlane są komórki tego samego koloru.