Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja złożonego tworzenia białek SNARE w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu błonowego, takie jak identyfikacja zestawów białek SNARE, które katalizują określone etapy transportu organelli. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji komórkowych, w których SNARE angażują się w złożone formowanie.

W tym eksperymencie do transfekcji wykorzystano 900 000 komórek HeLa podzielonych na trzy probówki Eppendorfa. Transfekuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym za pomocą następujących konstrukcji. Próbka numer jeden z konstruktem mCytryny syntaksynina-4, próbka numer dwa z syntaksyniną-4 mCytryną i VAMP3-mCherry oraz próbka numer trzy z syntaksyniną-3 połączoną zarówno z mCytryną, jak i mWiśnią.

Hodowla transfekowanych komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy zaopatrzonym w 10% FCS i 1% antybiotyk przeciwmikotyczny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych przez noc. Następnego dnia odessać pożywkę i przemyć komórki pożywką do obrazowania żywych komórek przez dwie minuty. Następnie umieść komórki na świeżym podłożu obrazowym.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść próbkę numer dwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, na podgrzewanym stoliku, pod mikroskopem konfokalnym do obrazowania fluorescencji w dziedzinie czasu z pulsacyjnym źródłem wzbudzenia dla fluoroforu dawcy i akwizycją danych z rozdzielczością czasową. Przed każdą mikroskopią obrazowania fluorescencji w czasie życia lub pomiarem FLIM wybierz komórkę z widoczną ekspresją białek SNARE znakowanych mCitrine i mCherry i zarejestruj obraz konfokalny o wymiarach 256 na 256 pikseli z jednoczesnym wzbudzeniem obu fluoroforów. Nagraj obraz FLIM, klikając przycisk Uruchom FLIM, gdy obraz FLIM zostanie zapisany z tymi samymi wymiarami i rozdzielczością przestrzenną, co obraz konfokalny zarejestrowany wcześniej.

Nagraj obraz z co najmniej 50 000 fotonów do analizy FLIM całej komórki lub co najmniej 400 fotonów na piksel. Ważne jest, aby rejestrować pomiary FLIM w odległości co najmniej jednego mikrometra od powierzchni szkła, aby uniknąć odbicia view. Powtórz obrazowanie z wielu komórek w próbce numer dwa oraz dla komórek w próbce numer jeden i próbce numer trzy.

Następnie umieść czyste szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu, aby zarejestrować funkcję odpowiedzi instrumentu lub IRF. Dostrój monochromator detektora emisji do długości fali wzbudzenia i kliknij przycisk uruchom FLIM, aby nagrać obraz FLIM z tylnym rozpraszaniem od szkiełka nakrywkowego. Nagrania fotograficzne zostaną przekonwertowane na obrazy FLIM za pomocą oprogramowania do konwersji PT32ICS.

Skonfiguruj oprogramowanie. Ustaw wyjście na ImageJ w celu generowania obrazów FLIM. Ustaw rozmiar obrazu na 256 na 256 pikseli, a kanał na dwa.

Naciśnij przycisk konwertuj i załaduj jeden lub więcej śladów fotonów. Przytrzymaj wciśnięty Control, aby wybrać wiele ścieżek fotonów. Obrazy FLIM powinny być generowane w tym samym folderze, w którym zapisywane są ślady fotonów.

Zacznij od otwarcia oprogramowania do analizy danych, które może pasować do dekonwolucji. Zaimportuj plik tekstowy zawierający histogram dla każdego śladu fotonu. Zreorganizuj tabelę w taki sposób, aby IRF znajdował się w drugiej kolumnie tabeli, obok wartości czasu w kolumnie A.Określ jakość zarejestrowanych śladów fotonów, zaznaczając wszystkie kolumny.

Nie należy analizować śladów fotonów o wysokim piku odbicia. Przykład jest pokazany tutaj. Użyj sterującego, aby wybrać wszystkie kolumny zawierające histogramy okresu życia o kontrolowanej jakości, które zostaną dopasowane, a także IRF w kolumnie B, a następnie załaduj łącznik nieliniowy.

Załaduj funkcję dopasowania zdekonwoluowanego, dodając ją do oprogramowania analitycznego. Wybierz plik funkcji pasowania. Ta funkcja pasuje do histogramów czasu życia fluorescencji z funkcją rozpadu mono wykładniczego zdekonwolucyjną za pomocą IRF.

Wykonaj skalowanie osi X dopasowanych krzywych. Dopasuj krzywe, naciskając dopasowanie. Spowoduje to przekonwertowanie dopasowania i wygenerowanie arkusza raportu w tablicy z tabelą zawierającą czasy życia fluorescencji, przesunięcia i amplitudy.

Wygeneruje również arkusz danych z dopasowanymi krzywymi i pozostałościami dopasowania. Pokazano reprezentatywne obrazy konfokalne helokomórek, które wyrażają tylko składnię czterech mCytryny, snytaksynę cztery mCytryny z VAMP3 mCherry lub składnię trzech mCitrine mCherry tandem. Na tych towarzyszących obrazach czasu życia fluorescencji kolor wskazuje średni pozorny czas życia fluorescencji.

Obrazy zostały następnie skonwojowane z intensywnością fluorescencji fluoroforu donora mCitrine. Dalej są te same obrazy z dopasowaniem z dwuwykładniczymi funkcjami zaniku. Kolory pikseli wskazują szacowane frakcje składni cztery w połączeniu z VAMP3.

Funkcja odpowiedzi instrumentu konfiguracji została zmierzona za pomocą rozpraszania wstecznego na granicy faz szklanej wody. Histogramy życia całej komórki są pokazane dla komórek wyrażających tylko składnię four mCitrine, współekspresję składni four mCitrine z VAMP3 mCherry i wyrażających składnię three mCitrine mCherry tandem. Panel E pokazuje nałożenie krzywych zaniku paneli B, C i D. Inkrustacje pokazują te same wykresy, ale z logarytmicznym skalowaniem osi Y.

Fluorescencyjny histogram czasu życia zarejestrowany zbyt blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu skutkował dużym szczytem odbicia, przedstawionym przez żółty zacieniony obszar. Na koniec pokazano histogram czasu życia z reprezentatywnym dopasowaniem z funkcją rozpadu dwuwykładniczego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o rejestrowaniu wielu komórek, podczas gdy poziom ekspresji dawcy i interceptora SNARES może wpływać na czas życia. Po tej procedurze komórki mogą być aktywowane w celu udzielenia odpowiedzi na pytania specyficzne dla typu komórek związane z ponownym zakorzenieniem transportu błonowego za pośrednictwem SNARE. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transportem błonowym do zbadania międzykomórkowych szlaków transportu organelli we wszystkich komórkach eukariotycznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nagrywać i analizować dane FLIM. Nie zapominaj, że praca z organizmami modyfikowanymi genetycznie i laserami o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna, a podczas próby wykonania tej procedury należy zawsze podjąć środki ostrożności, takie jak rękawice i ochrona oczu.