Name: Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji kompleksów białek SNARE w żywych komórkach HeLa przy użyciu mikroskopii FLIM. Technika ta pozwala bezpośrednio obserwować lokalizacje komórkowe, w których dochodzi do formowania się kompleksów SNARE.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez stypendium Hypatia z Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud, Nagrodę Rozwoju Kariery od Human Frontier Science Program, Program Grawitacji 2013 od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; ICI-024.002.009), grant VIDI z NWO (ALW VIDI 864.14.001) oraz grant na rozpoczęcie działalności od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (umowa o grant nr 336479).

1. Przygotowanie próbek do badania mikroskopowego
<ol>
	<li>Ekspresja Qa-SNARE syntaksyny 4 połączonej z mCitrine (syntaksyna 4-mCitrine; fluorofor donora) oraz R-SNARE VAMP3 połączonej z mCherry (VAMP3-mCherry) 
	UWAGA: Można również stosować inne białka SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast pary mCitrine-mCherry można zastosować inne pary donor-akceptor fluoroforów rozdzielonych spektralnie (np. CFP-YFP).
	<ol>
		<li>Hodować komórki HeLa i podzielić 90 0 komórek HeLa na trzy szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm, odpowiednie do mikroskopii. 
		UWAGA: W zasadzie protokół ten można dostosować do innych typów komórek eukariotycznych i szalek do mikroskopii.
		<ol>
			<li>Kultury komórek HeLa utrzymywać w kolbach T75 z 10 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% antybiotyku-antymykotyku (zawierającego amfoterycynę B, penicylinę i streptomycynę) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.</li>
			<li>Uzupełniać pożywkę dwa razy w tygodniu i pasażować komórki w stosunku 1:10 raz w tygodniu lub gdy komórki osiągną 85-90% konfluencji do nowych kolb T75 (średnio 50 00 komórek/kolba).</li>
			<li>Usunąć DMEM i dwukrotnie przemyć monowarstwy HeLa 8 mL sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przez 3 min.</li>
			<li>Usunąć PBS i dodać 2 mL PBS z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).</li>
			<li>Inkubować komórki przez 5 min w 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek, a następnie lekko potrząsnąć kolbą, aby oddzielić komórki HeLa od dna kolby.</li>
			<li>Wypłukać komórki 10 mL pożywki, przenieść zawiesinę do probówki 15 mL i pobrać 10 µL alikwotu do odliczania.</li>
			<li>Rozcieńczyć alikwot w stosunku 1:1 barwnikiem trypan blue 0,4% i odliczyć komórki za pomocą hemocytometru Bürkera9. 
			UWAGA: Odliczyć dwie kratki 4 x 4 i pomnożyć liczbę komórek przez 10 0, aby uzyskać liczbę komórek/mL.</li>
			<li>Po odliczeniu komórek pobrać 90 0 komórek z probówki 15 mL, rozdzielić je na 3 szalki z szklanym dnem (patrz krok 1.1.1) i przygotować do transfekcji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfekować komórki metodą elektroporacji10 (patrz Tabela materiałów) konstruktem syntaksyny 4-mCitrine (tylko donor, próbka nr 1), syntaksyną 4-mCitrine wraz z VAMP3-mCherry (próbka nr 2) oraz syntaksyną 3 połączoną zarówno z mCitrine, jak i mCherry (próbka nr 3). 
		UWAGA: Można zastosować inne metody transfekcji komórek11. Konstrukt tandemowy w próbce nr 3 służy jako kontrola pozytywna do oszacowania najkrótszego spodziewanego czasu życia (t.j. maksymalnego spodziewanego FRET).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować komórki przez noc w DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% FCS i 1% antybiotyku-antymykotyku w 37 °C przy 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.</li>
	<li>Odssać DMEM i przemyć komórki raz pożywką do obrazowania żywych komórek (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7,4, mOsm = 30; patrz Tabela materiałów) przez 2 min, a następnie umieścić komórki w świeżej pożywce do obrazowania.</li>
</ol>
2. Rejestracja danych FLIM
<ol>
	<li>Umieść Próbkę nr 2 pod konfokalnym mikroskopem FLIM w dziedzinie czasu z impulsowym źródłem wzbudzenia dla fluoroforu donora (t.j., mCitrine) oraz akwizycję danych w funkcji czasu. Przechowywać komórki w 37 °C z podgrzewanym stolikiem. 
	UWAGA: Mikroskop konfokalny użyty w tym protokole jest wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 63X 1,20 NA oraz impulsowy laser białego światła (częstotliwość impulsacji 80 MHz, &lt; czas trwania impulsu 100 ps), fotopowmnożnik (PMT) oraz system czasowo-skorelowanego liczenia pojedynczych fotonów (TCSPC) (patrz Tabela materiałów dla konkretnej zastosowanej konfiguracji). Można również użyć innych mikroskopów FLIM (np., fotodiody lawinowe pojedynczego fotonu (SPAD) zamiast PMT, impulsowe lasery jednofalowe zamiast impulsowych laserów białego światła).</li>
	<li>Należy wybrać komórkę z widoczną ekspresją białek SNARE znakowanych mCitrine i mCherry, a następnie przed każdym pomiarem FLIM zarejestrować obraz konfokalny o rozmiarze 256 × 256 pikseli przy jednoczesnym wzbudzeniu obu fluoroforów. Należy zastosować krok piksela około 2-krotnie mniejszy niż dyfrakcyjna rozdzielczość przestrzenna mikroskopu (~ 200 nm). W przypadku mCitrine należy wzbudzać przy 516 nm i zbierać emisję z zakresu 521–565 nm; w przypadku mCherry należy wzbudzać przy 610 nm i zbierać emisję z zakresu 613–68 nm. 
	UWAGA: Nie należy ustawiać płaszczyzny obrazowania zbyt blisko dna naczynia (w odległości ok. 2 µm odległość), ponieważ spowoduje to pojawienie się piku refleksyjnego na histogramie czasu życia fluorescencji. Preferowane jest jednoczesne wzbudzanie fluoroforów donora i akceptora, gdyż pozwala to wyeliminować potencjalny problem przemieszczania się próbki. Można jednak zastosować również wzbudzanie sekwencyjne.</li>
	<li>Nagrać obraz FLIM, klikając Przeprowadź pomiar FLIM obraz FLIM należy zarejestrować z tymi samymi wymiarami i rozdzielczością przestrzenną, co obraz konfokalny zarejestrowany w kroku 2.2. Obraz należy rejestrować do uzyskania co najmniej 50 00 fotonów dla analizy FLIM całej komórki lub co najmniej 40 fotonów na piksel. Należy wzbudzać wyłącznie fluorofor donora mCitrine, a nie fluorofor akceptora mCherry; w związku z tym wzbudzanie należy przeprowadzić przy 516 nm, a emisję zbierać w zakresie 521–565 nm.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1–2.3 dla wielu komórek oraz dla drugiej Próbki nr 1 (tylko dawca) i Próbki nr 3 (tandemowy konstrukt mCitrine-mCherry).</li>
	<li>Zarejestruj funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF). Nastroj detektor emisji monochromatora na długość fali wzbudzenia (np., zarejestruj emisję z zakresu 510–50 nm), a następnie kliknij przycisk, aby zarejestrować obraz FLIM z rozproszenia wstecznego z czystego szkiełka przykrywkowego Przeprowadzenie pomiaru FLIMNależy zastosować tę samą długość fali wzbudzenia (516 nm) i moc lasera, które zostały użyte do rejestracji danych komórkowych w krokach 2.1-2.4. 
	UWAGA: Jeśli w IRF widocznych jest wiele pików lub jeśli monochromatory emisji nie mogą zostać nastrojone, IRF można również zmierzyć przy użyciu roztworu barwnika fluorescencyjnego o ultrakrótkim czasie życia, na przykład poprzez wygaszanie fluorescencji barwnika organicznego w nasyconym wodnym roztworze jodku potasu. Ponadto rejestracja IRF nie jest ściśle wymagana, ponieważ nachylenie spadku histogramów fluorescencji można dopasować również bez dekonwolucji IRF. Jednakże IRF umożliwia korektę charakterystyki czasowej zastosowanego detektora fotonów, a tym samym zwiększa dokładność dopasowań histogramów czasu życia.</li>
</ol>
3. Konwersja rejestracji fotonów na obrazy FLIM
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj oprogramowanie konwertujące PT32ICS5. 
	UWAGA: Dane dotyczące czasu życia mogą być analizowane również za pomocą innego oprogramowania, w tym programów dostarczonych przez kilku producentów mikroskopów.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie PT32ICS.
	<ol>
		<li>Ustawie Rozmiar do rozmiaru obrazu 256 × 256 pikseli poprzez Ustawienia | Rozmiar.</li>
		<li>Ustaw Kanał Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 2 poprzez Ustawienia | Rozmiar. 
		UWAGA: Kanał emisji mCitrine zależy wyłącznie od konfiguracji mikroskopu. Wybór niewłaściwego kanału spowoduje uzyskanie obrazu FLIM pozbawionego fotonów (tj., czarny obraz) i w rezultacie pusty plik „LifetimeTable.txt”. Właściwy kanał można zidentyfikować metodą prób i błędów.</li>
		<li>Zestaw Wynik Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. ImageJ (xyz) (lub TRI2 (xyt)) do generowania obrazów FLIM (krok 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciśnij Konwertuj i wczytaj jeden lub więcej śladów fotonowych (pliki .pt3). Aby wybrać wiele śladów fotonowych, należy przytrzymać Kontrola naciśnięto klawisz. 
	UWAGA: Nowszy 64-bitowy format .ptu może również zostać przekonwertowany.</li>
	<li>Należy upewnić się, że oprogramowanie PT32ICS generuje w tym samym folderze, w którym zapisano pliki .pt3, następujące pliki: jeden stos fotonów dla każdego śladu fotonowego .pt3 w standardowym formacie cytometrii obrazowej (.ics), jeden plik mapy bitowej dla każdego śladu fotonowego .pt3 (.bmp) oraz plik tekstowy dla każdej konwersji (_Report.txt) zawierający informacje o statystyce fotonów (t. j., całkowitą liczbę fotonów w każdym śladzie fotonowym .pt3, rozdzielczość czasową detektora) oraz drugi plik tekstowy dla każdej konwersji (_LifetimeTable.txt) zawierający całkowite histogramy czasu życia fluorescencji w formacie rozdzielonym tabulatorami dla każdego śladu fotonowego .pt3. 
	UWAGA: Plik .ics może być wykorzystany do dopasowania pojedynczego piksela w celu wygenerowania obrazów FLIM, na przykład za pomocą oprogramowania TRI212,13 lub bibliotekę dopasowania krzywych SLIM w programie FIJI ImageJ14,15Plik ten może być również wykorzystany do analizy fazorowej.16na przykład za pomocą wtyczki Time Gated Phasor dla FIJI od firmy Spechron. Plik mapy bitowej nie zawiera informacji o czasie życia. Drugi plik tekstowy jest wykorzystywany do analizy FLIM całych komórek w kroku 4.</li>
</ol>
4. Dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji dla analizy FLIM całych komórek
UWAGA: Ten krok (dopasowanie dekonwolucyjne IRF) wymaga oprogramowania umożliwiającego dopasowanie z dekonwolucją. Dopasowanie nachyleń histogramów fluorescencji bez dekonwolucji IRF można przeprowadzić również przy użyciu innego oprogramowania.
<ol>
	<li>Otwórz program do analizy danych umożliwiający dopasowanie z dekonwolucją (Tabela materiałów) i zaimportuj plik tekstowy zawierający histogram dla każdego śladu fotonowego (_LifetimeTable.txt) za pomocą Plik | Importuj | Pojedynczy ASCII.</li>
	<li>Zreorganizuj tabelę w taki sposób, aby IRF znajdował się w drugiej kolumnie tabeli (korzystając z Kopia i Wklej). Umieść IRF w drugiej kolumnie B, obok wartości czasu w pierwszej kolumnie A.</li>
	<li>Określ jakość zarejestrowanych śladów fotonowych, zaznaczając wszystkie kolumny poprzez naciśnięcie Ctrl + A oraz wybieranie Wykres | Wielopanelowy | 9 paneliNie analizować śladów fotonowych z wysokim pikiem odbicia (Rysunek 4F).</li>
	<li>Wybierz wszystkie kolumny zawierające poddane kontroli jakości histogramy czasów życia, które zostaną dopasowane, a także IRF w kolumnie B, używając Kontrola klucz i wczytaj dopasowanie nieliniowe za pomocą Analiza | Dopasowanie | Niedopasowanie krzywej | Otwórz okno dialogowe.</li>
	<li>Wczytaj funkcję dopasowania z dekonwolucją (dostępną w Plik uzupełniający 1) poprzez dodanie tej funkcji do oprogramowania analitycznego (za pomocą Kategoria | Zdefiniowana przez użytkownika | Funkcja | Dodaj). Wybierz plik funkcji dopasowania „FLIM_convoluted_IRF.fdf”. Funkcja ta dopasowuje histogramy czasu życia fluorescencji za pomocą funkcji rozpadu mono-wykładniczego po dekonwolucji z IRF (t.j., druga kolumna B w tabeli) (Równanie 1): 
	<img alt="Wzór całkowy zaniku wykładniczego dla analizy spektroskopii przejściowej absorpcji." src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">        (Równanie 1) 
	z t czas, τ pozorny czas życia fluorescencji, A amplituda i y0 przesunięcie. 
	UWAGA: Inną opcją jest dopasowanie histogramów czasu życia za pomocą funkcji dopasowania bieksponecyjnego (Równanie 2): 
	<img alt="Równanie wykładniczego zaniku ze splotem funkcji odpowiedzi impulsowej (IRF), analityczna metoda analizy danych." src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">        (Równanie 2) 
	Poprzez ustalenie czasu życia komponentu wolnego (τ1) do warunku wyłącznie dawcy (krok 1.1.2: próbka nr 1) oraz komponentu szybkiego (τ2) do konstrukcji tandemowej (próbka nr 3), co pozwala na oszacowanie frakcji białek SNARE w kompleksie (F) z amplitud fal wolnych (A1) i komponentów szybkich (A2; patrz Dyskusja; Równanie 3): 
	<img alt="Wzór na frakcję sygnału; wyrażenie matematyczne dla stosunku w analizie optycznej." src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3">        (Równanie 3) 
	Plik funkcji dopasowania dla bi-wykładniczego dopasowania z dekonwolucją „FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf” jest dostępny w Plik uzupełniający 2.</li>
	<li>Wybierz Krzywe dopasowane | Typ danych X jako Taka sama jak dane wejściowe. 
	UWAGA: Doprowadzi to do uzyskania odpowiedniego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.skalowanie osi dopasowanych krzywych.</li>
	<li>Dopasuj krzywe, naciskając Dopasowanie. 
	UWAGA: Operacja ta przekształci dopasowanie i wygeneruje w tablicy „arkusz raportu” z tabelą zawierającą czasy życia fluorescencji, przesunięcia oraz amplitudy. Zostanie również wygenerowany arkusz danych z dopasowanymi krzywymi i residuami dopasowania.</li>
</ol>

<ol><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li>
<li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488905000571">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li>
<li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li>
<li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).</li>
<li>Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dance+of+the+SNAREs%3A+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/cell-culture/neon-protocols.par.0780.file.dat/hela-cervix.pdf">NEON transfection system cell protocols HeLa</a>. , (2017).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://spie.org/Publications/Proceedings/Paper/10.1117/12.590510">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171(2005).</li>
<li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://rsif.royalsocietypublishing.org/content/6/Suppl_1/S93">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li>
<li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li>
<li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li>
<li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li>
<li>Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4%2FSNAP23+mediates+adhesion%2C+cell+spreading+and+persistent+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li>
<li>Gómez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten demonstruje zastosowanie FRET-FLIM do wizualizacji interakcji SNARE między składnią 4 i VAMP3 w żywych komórkach HeLa. Syntaksyna 4 jest białkiem Qa-SNARE zlokalizowanym głównie w błonie plazmatycznej, gdzie pośredniczy w egzocytozie 1,2,20,21. VAMP3 jest R-SNARE, który jest głównie opisywany do lokalizacji w recyklingu przedziałów endosomalnych i pośredniczy w transporcie do innych endosomów, a także do błony komórkowej 1,2,20. Jednak test FRET-FLIM można łatwo dostosować do badania innych białek SNARE. Jedynym warunkiem jest to, że te SNARE zawierają C-końcową transbłonową helisę, co ma miejsce w przypadku większości białek SNARE zdecydowanie 1,2. Ponadto opisany tutaj protokół można dostosować do wizualizacji kompleksów SNARE w dowolnym typie komórek eukariotycznych, w tym w roślinach i drożdżach. W tym protokole wykorzystaliśmy skrócenie czasu życia fluorescencji fluoroforu dawcy jako miarę FRET. Jako podejście uzupełniające można zbadać czas życia fluoroforu akceptorowego, ponieważ uczulona emisja powoduje wyraźną fazę narastania, która dostarcza jednoznacznego dowodu na to, że zachodzi rezonansowy transfer energii.
Obecnie technika FRET-FLIM może nie być w stanie uwidocznić kompleksów SNARE w przedziałach lizosomalnych. W przypadku konstruktu tandemowego składniowego 3-mCitrine-mCherry fluorescencja mCherry często jest bardziej skumulowana w obszarze przyjądrowym, który prawdopodobnie odpowiada przedziałom lizosomalnym, podczas gdy sygnał mCitrine jest bardziej obfity na obrzeżach komórkowych5. Zaobserwowano podobną akumulację mCherry w porównaniu z mCytryną, gdy te same białka SNARE połączone z tymi białkami fluorescencyjnymi ulegały koekspresji5. Lizosomy charakteryzują się wyjątkowo niskim pH (< 4) i wysoką aktywnością enzymów proteolitycznych. Akumulacja mCherry jest prawdopodobnie spowodowana wyższą odpornością fluoroforu mCherry na degradację lizosomalną w porównaniu z fluoroforem mCitrine. Nie jest to spowodowane wygaszaniem pH mCytryny, ponieważ akumulacja mCherry w zestawieniach zachodzi również po utrwaleniu komórek5. W związku z tym technika FRET-FLIM zaniża ilość FRET w przyjądrowych (lizosomalnych) regionach, a to wymagałoby innych fluorescencyjnych białek reporterowych, które przetrwają trudne warunki w świetle lizosomów.
FRET-FLIM w zasadzie pozwala na uzyskanie (pół)ilościowego oszacowania frakcji SNARE w kompleksie5. Jak wyjaśniliśmy w tym protokole, wymaga to dopasowania histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu podwójnie wykładniczego (równanie 2), gdzie amplituda szybkiej składowej jest proporcjonalna do frakcji SNARE w kompleksie (równanie 3). Jednak takie dopasowanie do modelu dwukomponentowego jest technicznie trudne. Dopasowanie z wieloma parametrami swobodnego dopasowania (dwa czasy życia fluorescencji i dwie amplitudy) wymaga bardzo dużej liczby fotonów, zwłaszcza, że parametry będą na siebie wpływać, a małe błędy w czasie życia będą wpływać na amplitudy i odwrotnie. Aby przezwyciężyć te problemy z dopasowaniem, czasy życia fluorescencji składnika powolnego można ustalić na czas życia warunku tylko dawcy (tj. brak FRET; obecna jest tylko mCytryna), a czas życia składnika szybkiego na czas życia konstruktu tandemowego (maksymalny oczekiwany FRET). Należy to jednak również interpretować z ostrożnością, ponieważ czas życia fluorescencji może nie być taki sam jak w tych stanach kontrolnych i może się różnić z wielu powodów (samowygaszanie, orientacja dipolowa, zmiany w mikrośrodowisku). Wiele kompleksów SNARE w bliskiej odległości (< 10 nm) może powodować FRET zależny od odległości, tę samą zasadę, która pozwala na użycie FRET jako "linijki molekularnej", ale w tym przypadku zaciemnia kwantyfikację kompleksów SNARE. Co więcej, oszacowanie ilościowe nie zawsze jest miarodajne, ponieważ oznaczone SNARE konkurują z endogennymi (nieoznakowanymi) SNARE. W związku z tym poziom ekspresji SNARE znakowanego mCherry jest głównym wyznacznikiem procentowej zawartości FRET5. Ze względu na wszystkie te zastrzeżenia zaleca się dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu monowykładniczego (równanie 1). Ma to tę zaletę, że nie wymaga żadnej wiedzy a priori na temat czasów życia, a wynikający z tego pozorny średni czas życia fluorescencji stanowi solidną miarę dla kompleksowania SNARE5.
Niemniej jednak oczekuje się, że ilościowe obrazowanie FRET-FLIM za pomocą dwuskładnikowych modeli dopasowania będzie miało w przyszłości potężne zastosowania. Geny kodujące SNARE w chromosomie mogą być łączone z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, na przykład za pomocą CRISPR/CAS9. Powoduje to fluorescencyjne znakowanie endogennych białek SNARE, z endogennymi poziomami białek i bez tła nieznakowanych SNARE, a tym samym pozwala na miarodajne ilościowe oszacowanie frakcji kompleksów SNARE przez FRET-FLIM. Podczas gdy poziomy ekspresji endogennych SNARE mogą być dość niskie i dawać stosunkowo niskie sygnały fluorescencyjne, oczekuje się, że można uzyskać wystarczającą liczbę fotonów, szczególnie dla całej komórki FLIM (która wymaga tylko kilku 1000 fotonów). Co więcej, te pomiary FRET-FLIM mogą być wykonywane za pomocą bardziej czułych detektorów fotodiod lawinowych, co również spowoduje wyższe sygnały fluorescencji i lepsze statystyki fotonów.

Transportowanie błonowe jest główną cechą komórek eukariotycznych, gdzie pęcherzyki błonowe wyrastają z organelli dawcy, a następnie przemieszczają się do organelli docelowej i łączą się z nią1,2. Z wyjątkiem mitochondriów, wszystkie te etapy fuzji błonowej są katalizowane przez członków rodziny białek SNARE1,2. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 członków w komórkach ssaków i około 20 członków w drożdżach2. Białka SNARE zawierają jeden lub dwa ~52 reszty, natywnie nieustrukturyzowane regiony, zwane motywami SNARE. Białka SNARE są często przywiązane do błon przez transbłonową helisę C-końcową1,2. SNARE można podzielić na kategorie na podstawie centralnych reszt, które wnoszą do kompleksu SNARE, na argininę (R) i glutaminę (Q) SNAREs1,2. Fuzja błonowa jest napędzana przez interakcję 3 lub 4 pokrewnych SNARE, które razem tworzą 4 motywy SNARE i są rozprowadzane zarówno na błonie donorowej, jak i akceptorowej1,2. Kompleks SNARE składa się z jednego motywu R-SNARE i trzech motywów Q-SNARE (określanych jako Qa, Qb i Qc). Tworzenie kompleksu rozpoczyna się na N-końcach motywów SNARE, tworząc tak zwany kompleks trans-SNARE, i postępuje w kierunku C-końców, tworząc ciasną α-spiralną wiązkę zwiniętą cewki zwaną kompleksem cis-SNARE. Złożone tworzenie nawet pojedynczego kompleksu SNARE ciągnie do siebie błony donorową i akceptorową i pokonuje barierę energetyczną dla fuzji membranowej3.
Przypisywanie odrębnych kompleksów SNARE do konkretnych tras transportowych w komórkach jest często technicznie trudne. Chociaż SNARE wyraźnie przyczyniają się do specyfiki transportu błonowego, są one rozwiązłe, funkcjonalnie nadmiarowe, a ich funkcje nakładają się na siebie1,2. Z tego powodu eksperymenty perturbacyjne ukierunkowane na SNARE, takie jak nokaut genów, interferencja RNA, wprowadzenie przeciwciał blokujących lub rozpuszczalne fragmenty SNARE działające jako dominujące wartości ujemne, często nie prowadzą do uzyskania czystych fenotypów, ponieważ inne SNARE kompensują2,4. Co więcej, trudno jest odróżnić konkretne etapy fuzji membranowej od zdarzeń związanych z transportem poprzedzającym, ponieważ SNARE mogą być zaangażowane w wiele tras transportowych2. Badania lokalizacyjne SNARE za pomocą metod mikroskopowych, wykorzystujących znakowanie immunologiczne lub fuzję genetyczną z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, cierpią na problemy, które: (i) SNARE lokalizują się w wielu organellach, ponieważ często pośredniczą w wielu etapach transportu, oraz (ii) ich lokalizacje nie oznaczają automatycznie, że są funkcjonalnie zaangażowane w tworzenie kompleksu SNARE. Wreszcie, kompleksy SNARE można zidentyfikować za pomocą eksperymentów immunoprecypitacyjnych z użyciem jednego z SNARE jako przynęty, a innych SNARE jako celów, ale nie pozwala to na przypisanie tych kompleksów do określonych organelli lub szlaków transportowych. W związku z tym obecnie nie ma alternatywnej techniki wizualizacji kompleksów SNARE z rozdzielczością organellarną. Immunofluorescencja nie jest w stanie udowodnić interakcji SNARE, ale może wykazać tylko obecność lub brak kolokalizacji, podczas gdy immunoprecypitacja może tylko wykazać interakcje SNARE w całej populacji komórek, ale nie przypisać organelli, w których te interakcje występują.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, Verboogen et al. opracowali niedawno nowatorską metodę pozwalającą na ilościową wizualizację kompleksów SNARE w żywych komórkach z rozdzielczością organellar.5 Ta metoda opiera się na ekspresji par SNARE z widmowo przesuniętymi białkami fluorescencyjnymi połączonymi C-końcowymi z ich transbłonowymi helisami. Po zakończeniu fuzji błonowej i utworzeniu kompleksu cis-SNARE, te fluorofory na C-końcach helis transbłonowych są natychmiast zestawiane ze sobą. Fluorofory znajdują się wtedy w odległości Förstera (zwykle <5 nm), co skutkuje FRET od fluoroforu donorowego przesuniętego na zielono do fluoroforu akceptora przesuniętego ku czerwieni klasy akceptora 5,< klasa sup = "xref">6. FRET powoduje wygaszanie fluoroforu donorowego i zwiększoną emisję fluoroforu akceptorowego, którą można zmierzyć na podstawie stosunków emisji donora i akceptora (ratiometryczny FRET). Jednak ratiometryczny FRET między dwiema różnymi cząsteczkami jest trudny ze względu na przesłuch fluorescencyjny i różne poziomy SNARE donorowych i akceptorowych w różnych organellach i między komórkami7,8. FRET można również zmierzyć na podstawie czasu życia fluorescencji, który jest czasem między wzbudzeniem a emisją fotonu. Jeśli fluorofor dawcy może uwolnić swoją energię przez FRET, ten konkurencyjny proces powoduje pozorne skrócenie czasu życia fluorescencji. Można to zmierzyć za pomocą FLIM7,8. Żywotność FRET jest znacznie bardziej wytrzymała niż ratiometryczna FRET do pomiaru interakcji między dwiema różnymi cząsteczkami, ponieważ czas trwania fluorescencji jest wewnętrzną właściwością fluoroforu i jest niewrażliwy na jego stężenie. Co więcej, FRET jest w przybliżeniu ilościowy, ponieważ wydajność FRET jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (zasadniczo funkcja krokowa). W związku z tym, dopasowując histogramy czasu życia fluorescencji zarejestrowane przez FLIM do modelu rozpadu dwuskładnikowego, FRET-FLIM pozwala na (pół)ilościowe oszacowanie frakcji cząsteczek SNARE zaangażowanych w tworzenie kompleksu SNARE5.
Ostatnio ta metoda FRET-FLIM została użyta przez Verboogen et al. do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w pierwotnych komórkach dendrytycznych układu odpornościowego5. Wykazano, że po napotkaniu bodźca patogennego komórki dendrytyczne przekierowują transport błonowy, czemu towarzyszy zwiększone kompleksowanie białka błonowego związanego z pęcherzykami R-SNARE (VAMP) 3 ze składtaksyną Qa-SNARE 4 specyficznie na błonie plazmatycznej. To zwiększone tworzenie kompleksu SNARE jest prawdopodobnie wymagane, aby sprostać zwiększonej zdolności wydzielniczej do wydzielania cytokin zapalnych, takich jak interleukina-65. Protokół ten opisuje etapy eksperymentalne potrzebne do pozyskania danych FRET-FLIM do wizualizacji i (pół)ilościowego pomiaru kompleksów SNARE. Wyjaśniono, w jaki sposób dopasować histogramy czasu życia fluorescencji całej komórki do funkcji rozpadu mono- i dwuwykładniczego, co skutkuje pozornym czasem życia fluorescencji jako ilościowym oszacowaniem oddziaływań SNARE. W tym protokole jako przykład użyto szeroko stosowanej linii komórkowej HeLa, ale metodę można łatwo rozszerzyć o badanie kompleksów SNARE w innych komórkach eukariotycznych.

<table><tbody><tr><td>Plazmidowa "syntaksyna 4-mCytryny"</td> <td>Addgene</td><td>ID 92422</td><td>Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plazmidowe DNA 'VAMP3-mCherry'Addgene</td><td></td> <td>ID 92423</td><td>Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plazmidowa DNA "syntaksyna 3-mCitrine-mCherry"</td><td>Addgene</td><td>ID 92426</td><td>Kontrola pozytywna dla maksymalnego osiągalnego FRET.</td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynia ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>Inne komory do obrazowania żywych komórek będą działać jako substytut</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep będzie działać jako substytut</td></tr><tr><td>Obrazowanie żywych komórek średni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>Każde inne rozwiązanie do obrazowania żywych komórek będzie działać, o ile uniemożliwi się fluorescencję z pożywki</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica SP8 z obiektywem 63x 1.20 NA do zanurzenia w wodzie</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Można również stosować inne mikroskopy konfokalne z technologią FLIM w dziedzinie czasu</td></tr><tr><td>Laser pulsacyjny ze światłem białym</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Można również zastosować</td></tr> <tr>inne impulsowe źródła lasera<td>System zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC)</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> do konwersji PT32ICS PicoQuant PicoHarp 300 <td></td></tr><tr><td></td><td>Dostępne w sekcji "Oprogramowanie" www.membranetrafficking.com</td>program do analizy danych zdolny do dekonwolucji Originlabs OriginPro 2016 Fiji ImageJ <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wykonane na zamówienie makro Fiji ImageJ do konwolucji obrazu FLIM z intensywnością</td><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td>Dostępne w sekcji "Oprogramowanie" w www.membranetrafficking.com</td></tr><tr><td>B&uuml; rker Hemocytometr</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun Melsungen&nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroporacji ogniw neonowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu snare za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Rozpuszczalne białka infuzyjne wrażliwe na N-etylomaleimid (NSF) są kluczowe dla transportu błonowego, ponieważ katalizują fuzję błon w komórkach eukariotycznych. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 różnych członków. Określone wewnątrzkomórkowe drogi transportowe są katalizowane przez określone zestawy 3 lub 4 białek SNARE, które w ten sposób przyczyniają się do specyficzności i wierności transportu błonowego. Jednak badanie dokładnej funkcji białek SNARE jest technicznie trudne, ponieważ SNARE są bardzo obfite i funkcjonalnie redundantne, przy czym większość SNARE ma wiele i nakładające się na siebie funkcje. W protokole tym opisano nową metodę wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na ekspresji białek SNARE C-końcowych połączonych z białkami fluorescencyjnymi i pomiarze ich interakcji za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM). Poprzez dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do wieloskładnikowego modelu rozpadu, FRET-FLIM umożliwia (pół)ilościowe oszacowanie frakcji tworzenia kompleksu SNARE w różnych pęcherzykach. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE na błonie plazmatycznej i w endosomalnych przedziałach w liniach komórkowych ssaków i pierwotnych komórkach odpornościowych, i może być łatwo rozszerzony do badania funkcji SNARE w innych organellach w komórkach zwierzęcych, roślinnych i grzybowych.

Uzasadnienie metody pomiaru oddziaływań białek SNARE za pomocą techniki FRET-FLIM przedstawiono na Ryc. 1. Końce C-końcowe helis transbłonowych pokrewnych białek SNARE są połączone z parą białek fluorescencyjnych o przesuniętym widmie (np. mCitrine i mCherry). Powstanie kompleksu cis-SNARE podczas fuzji błon prowadzi do bezpośredniego zbliżenia tych białek fluorescencyjnych i wystąpienia zjawiska FRET. Ryc. 2 przedstawia reprezentatywne obrazy konfokalne komórek HeLa wykazujących ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek SNARE. Przedstawiono komórkę wykazującą ekspresję syntaxyny 4-mCitrine (fluorofor donora) z VAMP3-mCherry (fluorofor akceptora), a także warunki kontrolne komórek wykazujących ekspresję tylko konstruktu syntaxyny 4-mCitrine (sam donor; brak FRET) oraz syntaxyny 3 połączonej tandemowo z mCitrine i mCherry (maksymalny oczekiwany FRET). Ryc. 3 przedstawia towarzyszące im obrazy czasu życia fluorescencji oraz obrazy FLIM, wygenerowane poprzez dopasowanie histogramów czasu życia każdego piksela za pomocą funkcji zaniku monoeksponencjalnego (Ryc. 3A-B) i funkcji zaniku biekspo-nencjalnego (Ryc. 3C-D). Ryc. 4A przedstawia IRF naszego układu, zmierzoną poprzez rozproszenie wsteczne od szkiełka podstawowego mikroskopu. Na Ryc. 4B-E przedstawiono reprezentatywne histogramy czasu życia fluorescencji z analizy FLIM całej komórki wraz z towarzyszącymi krzywymi dopasowania dla funkcji zaniku monoeksponencjalnego. Ryc. 4F przedstawia histogram czasu życia fluorescencji z eksperymentu obrazowanego zbyt blisko powierzchni szkiełka podstawowego mikroskopu, co skutkuje pojawieniem się wyraźnego piku refleksyjnego. Ryc. 4G przedstawia histogram czasu życia z reprezentatywnym dopasowaniem za pomocą funkcji zaniku biekspo-nencjalnego.
<img alt="Fuzja błon pośredniczona przez białka SNARE, schemat metody opartej na FRET, znakowanie mCherry i mCitrine, oddziaływanie pęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat zasady wizualizacji kompleksów SNARE za pomocą FRET. (A) Model strukturalny neuronalnych białek SNARE (baza danych białek 3HD717): białka błonowego stowarzyszonego z pęcherzykami (VAMP) 2 (niebieski; R), syntaksyny 1 (czerwony; Qa-SNARE) oraz SNAP25 (zielony; zawiera motywy Qb- i Qc-SNARE). Koniec C-końcowy helisy transbłonowej syntaksyny-1 jest sprzężony z mCitrine (fluorofor donora; baza danych białek 3DQ118). Koniec C-końcowy helisy transbłonowej VAMP2 jest sprzężony z mCherry (fluorofor akceptora; baza danych białek 2H5Q19). (B) Schemat fuzji błon pośredniczonej przez SNARE prowadzącej do FRET. Po fuzji błon poprzez utworzenie kompleksu cis-SNARE, białka SNARE znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie, co prowadzi do wystąpienia FRET. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna oddziaływań białek, Stx4-mCitrine, VAMP3-mCherry, nałożenie obrazów, obrazy BF." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspresja białek SNARE połączonych z białkami fluorescencyjnymi. Pierwsza kolumna: fluorofor donora, pobudzenie przy 516 nm. Druga kolumna: fluorofor akceptora, pobudzenie przy 610 nm. (A) Warunek tylko z donorem. Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję syntaksyny 4-mCitrine (fluorofor donora; kolor zielony na nałożeniu obrazów). Kanał akceptora (druga kolumna) pokazuje przesłuchy fluorescencyjne. (B) Kontrola negatywna (brak FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję zarówno syntaksyny 4-mCitrine, jak i VAMP3-mCherry (fluorofor akceptora; kolor magenta na nałożeniu obrazów). (C) Kontrola pozytywna (maksymalny oczekiwany FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję tandemowej konstrukcji syntaksyny 3-mCitrine-mCherry. Należy zauważyć, że sygnały fluorescencyjne mCitrine i mCherry nie nakładają się całkowicie, prawdopodobnie ze względu na niższą odporność mCitrine na degradację lizosomalną w porównaniu z mCherry (patrz sekcja Dyskusja). BF: jasne pole. Paski skali, 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) białek SNARE, schemat przedstawiający czas życia i intensywność." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazy FLIM formowania się kompleksu SNARE. (A) Reprezentatywne obrazy czasu życia fluorescencji komórek przedstawionych na Rycini 2. Obrazy zostały wygenerowane poprzez najpierw przekonwertowanie śladów fotonów zarejestrowanych przez system TCSPC (.pt3) na standard cytometrii obrazowej (.ics) przy użyciu oprogramowania PT32ICS. Następnie wygenerowano obrazy czasu życia fluorescencji dopasowane dla pojedynczych pikseli przy użyciu oprogramowania TRI212,13 z progiem intensywności od 15-100%, kołowym binowaniem 7 pikseli i monoeksponencjalnym algorytmem dopasowania (Marquardt). Kolor wskazuje średni pozorny czas życia fluorescencji. (B) Obrazy FLIM, w których obrazy czasu życia fluorescencji (pokazane w panelu A) zostały splotowane z intensywnościami fluorescencji fluoroforu donora mCitrine (pokazane na Rycini 2). Splot został wykonany w programie FIJI ImageJ przy użyciu niestandardowego makra (patrz Tabela materiałów). (C) Czas życia fluorescencji i obrazy FLIM komórki HeLa wykazującej ekspresję zarówno syntaxin 4-mCitrine, jak i VAMP3-mCherry z paneli A-B, ale tym razem z dopasowaniem do bi-eksponencjalnych krzywych zaniku (z czasami życia ustalonymi zgodnie z warunkami kontrolnymi; patrz krok 4.4 w protokole). Kolory pikseli wskazują szacowane frakcje F syntaxin 4 w kompleksie z VAMP3 (Równanie 3). (D) Tak samo jak w panelu B, ale dla dopasowania bi-eksponencjalnego. Splot został wykonany w programie FIJI ImageJ przy użyciu niestandardowego makra (patrz Tabela materiałów). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywe zaniku zliczania fotonów; analiza czasu życia fluorescencji; wykres spektroskopii czasowo rozdzielczej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza FLIM całych komórek. (A) Funkcja odpowiedzi przyrządu (IRF) układu. IRF zmierzono za pomocą rozpraszania wstecznego na granicy szkło-woda (używając czystej szklanej szalki mikroskopowej zawierającej wodę). (B-E) Histogramy czasu życia całych komórek dla komórek przedstawionych na Rysunku 2 i Rysunku 3. Wszystkie fotony obecne na obrazach zostały połączone. Krzywe poddano dekonwolucji z IRF i dopasowano do funkcji zaniku mono-wykładniczego (Równanie 1). Dla tych komórek uzyskano czasy życia fluorescencji wynoszące 2,82 ns (komórki wykazujące ekspresję tylko syntaxyny 4-mCitrine; sam donator; panel B), 2,09 ns (komórki ko-ekspresujące syntaxynę 4-mCitrine z VAMP3-mCherry; panel C) oraz 2,08 ns (komórki wykazujące ekspresję tandemowej konstrukcji syntaxyny 3-mCitrine-mCherry; kontrola maksymalnego oczekiwanego FRET; panel D). Wstawki przedstawiają te same wykresy, ale z logarytmiczną skalą osi y. Panel E pokazuje nałożenie krzywych zaniku z paneli B-D. (F) Przykład histogramu czasu życia fluorescencji zarejestrowanego zbyt blisko powierzchni szkiełka podstawowego mikroskopu. Skutkuje to dużym pikiem odbicia (przedstawionym przez żółty obszar zacieniony). (G) Analogicznie jak w panelu C, ale z dopasowaniem do krzywej zaniku bi-wykładniczego z czasami życia ustalonymi zgodnie z warunkami kontrolnymi (patrz krok 4.4 w protokole). Amplitudy komponentów szybkiego (A1) i wolnego (A2) wynosiły odpowiednio 14,42 i 0,01, co dało szacunkową frakcję SNARE w kompleksie F wynoszącą 0,99 (Równanie 3). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1. Plik funkcji FLIM_convoluted_IRF <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2. Plik funkcji FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja złożonego tworzenia białek SNARE w żywych komórkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu błonowego, takie jak identyfikacja zestawów białek SNARE, które katalizują określone etapy transportu organelli. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia bezpośrednią wizualizację lokalizacji komórkowych, w których SNARE angażują się w złożone formowanie.W tym eksperymencie do transfekcji wykorzystano 900 000 komórek HeLa podzielonych na trzy probówki Eppendorfa. Transfekuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym za pomocą następujących konstrukcji. Próbka numer jeden z konstruktem mCytryny syntaksynina-4, próbka numer dwa z syntaksyniną-4 mCytryną i VAMP3-mCherry oraz próbka numer trzy z syntaksyniną-3 połączoną zarówno z mCytryną, jak i mWiśnią.Hodowla transfekowanych komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy zaopatrzonym w 10% FCS i 1% antybiotyk przeciwmikotyczny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych przez noc. Następnego dnia odessać pożywkę i przemyć komórki pożywką do obrazowania żywych komórek przez dwie minuty. Następnie umieść komórki na świeżym podłożu obrazowym.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść próbkę numer dwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza, na podgrzewanym stoliku, pod mikroskopem konfokalnym do obrazowania fluorescencji w dziedzinie czasu z pulsacyjnym źródłem wzbudzenia dla fluoroforu dawcy i akwizycją danych z rozdzielczością czasową. Przed każdą mikroskopią obrazowania fluorescencji w czasie życia lub pomiarem FLIM wybierz komórkę z widoczną ekspresją białek SNARE znakowanych mCitrine i mCherry i zarejestruj obraz konfokalny o wymiarach 256 na 256 pikseli z jednoczesnym wzbudzeniem obu fluoroforów. Nagraj obraz FLIM, klikając przycisk Uruchom FLIM, gdy obraz FLIM zostanie zapisany z tymi samymi wymiarami i rozdzielczością przestrzenną, co obraz konfokalny zarejestrowany wcześniej.Nagraj obraz z co najmniej 50 000 fotonów do analizy FLIM całej komórki lub co najmniej 400 fotonów na piksel. Ważne jest, aby rejestrować pomiary FLIM w odległości co najmniej jednego mikrometra od powierzchni szkła, aby uniknąć odbicia view. Powtórz obrazowanie z wielu komórek w próbce numer dwa oraz dla komórek w próbce numer jeden i próbce numer trzy.Następnie umieść czyste szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu, aby zarejestrować funkcję odpowiedzi instrumentu lub IRF. Dostrój monochromator detektora emisji do długości fali wzbudzenia i kliknij przycisk uruchom FLIM, aby nagrać obraz FLIM z tylnym rozpraszaniem od szkiełka nakrywkowego. Nagrania fotograficzne zostaną przekonwertowane na obrazy FLIM za pomocą oprogramowania do konwersji PT32ICS.Skonfiguruj oprogramowanie. Ustaw wyjście na ImageJ w celu generowania obrazów FLIM. Ustaw rozmiar obrazu na 256 na 256 pikseli, a kanał na dwa.Naciśnij przycisk konwertuj i załaduj jeden lub więcej śladów fotonów. Przytrzymaj wciśnięty Control, aby wybrać wiele ścieżek fotonów. Obrazy FLIM powinny być generowane w tym samym folderze, w którym zapisywane są ślady fotonów.Zacznij od otwarcia oprogramowania do analizy danych, które może pasować do dekonwolucji. Zaimportuj plik tekstowy zawierający histogram dla każdego śladu fotonu. Zreorganizuj tabelę w taki sposób, aby IRF znajdował się w drugiej kolumnie tabeli, obok wartości czasu w kolumnie A.Określ jakość zarejestrowanych śladów fotonów, zaznaczając wszystkie kolumny.Nie należy analizować śladów fotonów o wysokim piku odbicia. Przykład jest pokazany tutaj. Użyj sterującego, aby wybrać wszystkie kolumny zawierające histogramy okresu życia o kontrolowanej jakości, które zostaną dopasowane, a także IRF w kolumnie B, a następnie załaduj łącznik nieliniowy.Załaduj funkcję dopasowania zdekonwoluowanego, dodając ją do oprogramowania analitycznego. Wybierz plik funkcji pasowania. Ta funkcja pasuje do histogramów czasu życia fluorescencji z funkcją rozpadu mono wykładniczego zdekonwolucyjną za pomocą IRF.Wykonaj skalowanie osi X dopasowanych krzywych. Dopasuj krzywe, naciskając dopasowanie. Spowoduje to przekonwertowanie dopasowania i wygenerowanie arkusza raportu w tablicy z tabelą zawierającą czasy życia fluorescencji, przesunięcia i amplitudy.Wygeneruje również arkusz danych z dopasowanymi krzywymi i pozostałościami dopasowania. Pokazano reprezentatywne obrazy konfokalne helokomórek, które wyrażają tylko składnię czterech mCytryny, snytaksynę cztery mCytryny z VAMP3 mCherry lub składnię trzech mCitrine mCherry tandem. Na tych towarzyszących obrazach czasu życia fluorescencji kolor wskazuje średni pozorny czas życia fluorescencji.Obrazy zostały następnie skonwojowane z intensywnością fluorescencji fluoroforu donora mCitrine. Dalej są te same obrazy z dopasowaniem z dwuwykładniczymi funkcjami zaniku. Kolory pikseli wskazują szacowane frakcje składni cztery w połączeniu z VAMP3.Funkcja odpowiedzi instrumentu konfiguracji została zmierzona za pomocą rozpraszania wstecznego na granicy faz szklanej wody. Histogramy życia całej komórki są pokazane dla komórek wyrażających tylko składnię four mCitrine, współekspresję składni four mCitrine z VAMP3 mCherry i wyrażających składnię three mCitrine mCherry tandem. Panel E pokazuje nałożenie krzywych zaniku paneli B, C i D. Inkrustacje pokazują te same wykresy, ale z logarytmicznym skalowaniem osi Y.Fluorescencyjny histogram czasu życia zarejestrowany zbyt blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu skutkował dużym szczytem odbicia, przedstawionym przez żółty zacieniony obszar. Na koniec pokazano histogram czasu życia z reprezentatywnym dopasowaniem z funkcją rozpadu dwuwykładniczego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o rejestrowaniu wielu komórek, podczas gdy poziom ekspresji dawcy i interceptora SNARES może wpływać na czas życia. Po tej procedurze komórki mogą być aktywowane w celu udzielenia odpowiedzi na pytania specyficzne dla typu komórek związane z ponownym zakorzenieniem transportu błonowego za pośrednictwem SNARE. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transportem błonowym do zbadania międzykomórkowych szlaków transportu organelli we wszystkich komórkach eukariotycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nagrywać i analizować dane FLIM. Nie zapominaj, że praca z organizmami modyfikowanymi genetycznie i laserami o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna, a podczas próby wykonania tej procedury należy zawsze podjąć środki ostrożności, takie jak rękawice i ochrona oczu.

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę wizualizacji kompleksów białek SNARE w żywych komórkach HeLa przy użyciu mikroskopii FLIM. Technika ta pozwala bezpośrednio obserwować lokalizacje komórkowe, w których dochodzi do formowania się kompleksów SNARE.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów