Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Protokół ten pokazuje, jak hodować sferoidy o wysokiej powtarzalności i pokazuje, w jaki sposób można przeprowadzić eksperymenty proteomiczne w celu scharakteryzowania biologicznej funkcji struktur 3D. Nasza kultura 3D może jednocześnie wyprodukować setki powtórzeń biologicznych w tym samym bioreaktorze, a podejście LC-MS może zmierzyć obfitość tysięcy białek w jednym eksperymencie. Procedurę zademonstruje Stephanie Stransky, doktor habilitowany z laboratorium.

Na początek weź zawiesinę komórek HepG2 / C3A i THLE-3. Policz liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek w kompletnej pożywce wzrostowej, aby uzyskać 1 milion komórek w maksymalnej objętości 1,5 mililitra. Umyj studzienki 24-dołkowej okrągłej płytki dolnej o bardzo niskim nasadce z 0,5 mililitra pożywki wzrostowej i odwiruj przy 3 000 g przez pięć minut.

Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę i odwirować ją przez trzy minuty w temperaturze 120 g. Następnie inkubuj płytkę, aby zainicjować tworzenie sferoidów. Następnie zrównoważ bioreaktor na 24 godziny przed przeniesieniem sferoid, wypełniając komorę wilgotnościową 25 mililitrami sterylnej wody, a komorę komórkową dziewięcioma mililitrami pożywki wzrostowej za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z długą igłą.

Następnie umieść bioreaktor w inkubatorze 3D na 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Delikatnie pipetuj sferoidy w górę iw dół za pomocą końcówek o szerokości jednego mililitra, aby odłączyć je od bardzo niskiej płytki mocującej i przenieść do naczynia do hodowli tkankowej. Aby uchwycić pozostałe sferoidy, umyj płytkę 0,5 mililitra podgrzanej pożywki wzrostowej i przenieś ją do naczynia hodowlanego.

Za pomocą mikroskopu świetlnego oceń rozmiar, zwartość i okrągłość sferoid, aby wybrać te, które są odpowiednio uformowane. Przenieś wybraną sferoidę do bioreaktora równoważącego wypełnionego pięcioma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. Następnie napełnij cały bioreaktor świeżą pożywką wzrostową.

Umieść bioreaktor w inkubatorze 3D i wyreguluj prędkość obrotową za pomocą jednostki sterującej. Zastąp 10 mililitrów starej pożywki 10 mililitrami świeżej pożywki co dwa do trzech dni. Zmieniaj prędkość obrotową za każdym razem po wymianie nośnika.

Hoduj sferoidy przez 15 dni i podziel je między dwa świeże bioreaktory. Otwórz aplikację 3D zainstalowaną na tablecie, wybierz bioreaktor i uchwyć obraz. Alternatywnie umieść czarne tło za bioreaktorem i upewnij się, że żadne światło nie odbija się od komory ogniw.

Uchwyć obraz jak najbliżej bioreaktora. Następnie zbierz sferoidy, usuwając pięć mililitrów pożywki z bioreaktora za pomocą strzykawki przymocowanej do długiej igły przez górny port. Upewnij się, że sferoidy opadają do dolnej środkowej części bioreaktora.

Teraz otwórz przedni port i zbierz sferoidy za pomocą końcówki o szerokości jednego mililitra. Przenieś te sferoidy do mikroprobówek wirówek, odwiruj z prędkością 500 g przez pięć minut i wyrzuć pożywkę. Umyj sferoidę, dodając 200 mikrolitrów HBSS w celu usunięcia FBS.

Następnie przeprowadzić wirowanie przy 500 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie szybko zanurz sferoidalny osad w ciekłym azocie, aby go zamrozić i przechowuj ten zamrożony granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki. Aby zlizować komórki, weź probówkę z zebranymi sferoidami i zawieś je ponownie w 25 mikrolitrach 5% SDS.

Homogenizować granulki, pipetując w górę i w dół. Następnie rozpuść jeden mikrogram próbek i 10 mikrolitrów 0,1% kwasu trójchlorooctowego. Po wyekstrahowaniu białka i oczyszczeniu próbek, skonfiguruj metodę akwizycji MS, aby wygenerować widma MS/MS ze zidentyfikowanych sygnałów peptydowych.

Następnie przenieś płytkę do automatycznego podajnika próbek do chromatografii cieczowej w postaci nanolitrów. Ustaw pełny skan MS na stosunek masy do ładunku 300 do 1, 100 w Orbitrapie. Dostosuj rozdzielczość do 120000 i ustaw cel automatycznej kontroli wzmocnienia na 125.

Następnie ustaw MS/MS w Orbitrap z sekwencyjnym oknem izolacyjnym o stosunku masy do ładunku 50. Wyceluj w cel automatycznej kontroli wzmocnienia na 400 i ustaw energię dysocjacji zderzeniowej o wyższej energii na 30. Zgodnie z analizą żywotności sferoidów, poziomy kinazy adenylanowej wzrastają do 17 dnia, co powoduje około 7% śmierci komórki.

Następnie śmiertelność spada poniżej 5%Ponadto analiza pierwszego głównego składnika ujawnia wyraźne rozróżnienie między próbkami sferoidalnymi a płaskimi hodowlami komórkowymi. Analiza proteomiczna wykazała, że sferoidy THLE-3 i HepG2/C3A mają podobne profile, które odzwierciedlają czynność wątroby. Dodatkowo sferoidy wykazywały nadekspresję dwóch izoform metalotionein w porównaniu z komórkami płaskimi.

Funkcjonalnie pogrupowane sieci wykazały wzbogacenie ontologii genów w procesie metabolizmu węglowodanów w sferach HepG2/C3A i THLE-3. Aby uniknąć rozlania pożywki wzrostowej, nie otwieraj ani nie zamykaj przedniego portu, gdy komora ogniwa jest całkowicie wypełniona płynem. Przygotowanie i analiza próbek opisana w tym protokole może być wykorzystana do zbadania proteomu hodowli komórek za pomocą metod 2D i 3D, a także próbek tkanek.