Name: Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj półautomatyczną analizę fenotypową sferoidów 3D przy użyciu spektrometrii mas LC-MS. Ta metoda umożliwia charakteryzację białek w hodowlach komórek HepG2/C3A i THLE-3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Sidoli z wdzięcznością dziękuje Fundacji Badań nad Białaczką (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (nagroda Sagol Network GerOmics), Deerfield (nagroda Xseed), Relay Therapeutics, Merck, oraz Biuru Dyrektora NIH (1S10OD030286-01).

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li>
<li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li>
<li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+%28LPS%29+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li>
<li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+cell+culture%3A+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243(2022).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer%3A+Translating+%27-omics%27+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li>
<li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatospheres%3A+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+The+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%3A+AMS%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinostat+3D+cell+culture%3A+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible%2C+large%2C+uniform+spheroids+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li>
<li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606(2022).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+trypsinisation%2C+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClueGO%3A+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li>
<li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomics%3A+The+next+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li>
<li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
<li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture%3A+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li>
<li>Chiang, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChiang%2C+J+%22Liver+physiology%3A+Metabolism+and+Detoxification.+Pathobiology+of+Human+Disease%22">Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease</a>. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).</li>
<li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism%3A+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li>
<li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids%3A+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li>
</ol>

Helle Sedighi Frandsen jest zatrudniona jako pracownik naukowy w firmie CelVivo ApS, produkującej system ClinoStar. Karoline Mikkelsen jest doktorantką przemysłową zatrudnioną w CelVivo ApS i odbywającą studia doktoranckie na SDU w Odense w Danii. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zrozumienie biologii stojącej za trójwymiarowymi (3D) strukturami komórkowymi jest niezwykle ważne dla bardziej wszechstronnej wiedzy na temat ich funkcjonalności. Rośnie zainteresowanie wykorzystaniem modeli 3D do badania złożonej biologii i przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności. Podczas hodowli komórek w 3D należy wziąć pod uwagę wiele czynników, w tym ocenę fenotypową systemu modelowego. Fenotyp definiuje się jako grupę obserwowalnych cech określonego organizmu, takich jak morfologia, zachowanie, właściwości fizjologiczne i biochemiczne20.
W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób eksperymenty proteomiczne mogą być przeprowadzane na podstawie kilku sferoid i mogą być wykorzystywane do monitorowania typowego fenotypu wątroby. Spektrometria mas stała się szeroko stosowaną metodą charakterystyki komórek 3D, umożliwiając badanie różnych zagadnień biologicznych 12,16,21,22. Do kompleksowej analizy proteomu zaleca się użycie co najmniej 20 μg białkowego materiału wyjściowego, z którego 1 μg wstrzykuje się do spektrometru mas. Należy wspomnieć, że dodanie mniejszej ilości próbki może prowadzić do utraty czułości, a dodanie większej ilości stopniowo pogorszyłoby jakość chromatografii i ostatecznie doprowadziłoby do zablokowania kolumny. W tym badaniu wykazaliśmy, że sferoidy HepG2/C3A i THLE-3 są wzbogacone w ważne białka z cyklu glikolizy i TCA, które są specyficznymi szlakami wątrobowymi i mają kluczowe znaczenie dla utrzymania poziomu glukozy we krwi i produkcji energii23,24. W rzeczywistości analiza spektrometrii mas dostarcza nie tylko informacji na poziomie białka, ale także pozwala na badanie modyfikacji potranslacyjnych białek, jak wykazano wcześniej w naszej grupie16.
Innym aspektem, który należy wziąć pod uwagę w badaniach fenotypowych 3D, jest liczba i rozmiar sferoid. Oprócz tego, że eksperymenty są bardziej powtarzalne, liczenie sferoid i określanie ich wielkości jest niezbędne do określenia, kiedy należy podzielić kulturę na wiele bioreaktorów, ponieważ liczba struktur 3D w naczyniu może wpływać na rozmiar sferoidów i poziom aktywności metabolicznej. Należy jednak podkreślić, że liczba i rozmiar sferoid zależą od linii komórkowej, początkowej liczby komórek, procesu podziału i czasu pobrania. Szczegóły dotyczące hodowli sferoidalnej HepG2/C3A, takie jak liczba komórek w sferoidach, zawartość białka i wielkość w funkcji wieku, zostały dostarczone przez Fey, Korzeniowska i Wrzesiński25. Aby uzyskać dokładną i skuteczną analizę przy użyciu opisanej tutaj metody półautomatycznej, najważniejszym krokiem jest dobry obraz sferoid. Dla uproszczenia zdjęcie można zrobić telefonem lub tabletem, ale jego rozdzielczość powinna być utrzymana jak najwyższa. Ponieważ obrazy są szybkie do uzyskania, umożliwiają one eksperymenty przesiewowe na dużą skalę w celu wizualizacji określonych cech fenotypowych lub zbadania reakcji na leczenie farmakologiczne. W związku z tym, ze względu na rosnącą liczbę testów opartych na komórkach, w ciągu ostatnich 10 lat opracowano szereg oprogramowania typu open source do analizy obrazu26. W tym protokole opisujemy półautomatyczny system wykorzystujący oprogramowanie FIJI18 do liczenia i mierzenia wielkości sferoid. Przedstawiliśmy skrypty (proste polecenia programistyczne) do zdefiniowania sekwencji operacji algorytmicznych, które można zastosować do zbioru obrazów, dzięki czemu analiza jest łatwym i szybkim procesem. Jednak w zależności od charakterystyki sferoidy należy zastosować pomiar ręczny. Na przykład, jeśli sferoidy są zbyt przezroczyste, pismo FIJI będzie nieprecyzyjne. Nawiasem mówiąc, jednym z najważniejszych kryteriów działania tej metody jest zwartość sferoid. Ta cecha przyczyni się do bardziej wzmocnionego kontrastu kolorów między sferoidami a tłem, co jest niezbędne, aby metoda była dokładna.
Podsumowując, oprócz zaprezentowania metodologii hodowli sferoid o wysokiej odtwarzalności, opisano również półautomatyczny system połączony z charakteryzacją fenotypową za pomocą przechwytywania obrazu i proteomiki. Spodziewamy się, że ten zestaw narzędzi do analizy komórek 3D stanie się bardziej niezawodny dzięki w pełni zautomatyzowanemu oprogramowaniu do analizy obrazu i spektrometrom masowym nowej generacji.

Udowodniono, że hodowle komórkowe in vitro są niezbędne i nieocenione w zdobywaniu podstawowej wiedzy z biologii. Znaczna część wiedzy naukowej w biologii, a w szczególności w raku, pochodzi z systemu hodowli 2D, czyli komórek rosnących w monowarstwie. Chociaż hodowla 2D jest dominującym systemem hodowli komórek, ma wiele wad, które mogą potencjalnie zahamować dalszy postęp biologiczny. Na przykład w hodowlach 2D brakuje interakcji komórka-komórka ważnych dla sygnalizacji komórkowej i proliferacji1. Do tej pory wykazano, że systemy hodowli 3D lepiej modelują różnicowanie, reakcję na leki, inwazję guza i biologię2,3,4,5. Modelowanie 3D nowotworów złośliwych jest szczególnie istotne ze względu na wzrost starzejącej się populacji i śmiertelność z powodu nowotworów. Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie i często ma fatalne rokowania6. Wiadomo, że HCC ma niski wskaźnik wyleczeń, słabą odpowiedź na lek i wysoki wskaźnik nawrotów6,7,8. Opracowano kilka modeli 3D dla prawidłowej wątroby i HCC, które naśladują fizjologię normalnej i złośliwej tkanki wątroby in vivo9,10.
Niektóre z obecnych systemów 3D obejmują płynne nakładki, bioreaktory, hydrożel, rusztowania i struktury drukowane w 3D. Sferoidy generowane w bioreaktorach zapewniają unikalne korzyści, ponieważ naśladują rozkład guza w zakresie ekspozycji na składniki odżywcze, wymiany gazowej i proliferacji/spoczynku komórek11. Bioreaktory są szczególnie odpowiednie dla modeli nowotworowych ze względu na ich łatwość użycia, dużą skalowalność, dyfuzję składników odżywczych i dostępność11. Ponadto bioreaktory mogą pozwolić na przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, większą odtwarzalność i zmniejszenie liczby błędów ludzkich. Bioreaktor użyty w tym badaniu jest wyjątkowy, ponieważ symuluje system o zmniejszonej grawitacji, który minimalizuje zakłócające siły ścinające stosowane w typowych bioreaktorach, co pozwala na lepszą odtwarzalność12. Dookólna grawitacja i zmniejszenie sił ścinających pozwalają komórkom rozwijać się w bardziej fizjologiczny sposób. Jako dowód, komórki HepG2/C3A hodowane zgodnie z tą metodologią rozwijają kuliste organelle, które wytwarzają in vivo poziomy ATP, kinazy adenylanowej, mocznika i cholesterolu13,14. Ponadto leczenie farmakologiczne w tym systemie 3D jest bardziej zaawansowane i zautomatyzowane w porównaniu z hodowlami 2D. W hodowlach 2D leczenie farmakologiczne często musi trwać krótko ze względu na konieczność trypsynizacji i utrzymania zdrowia komórek. Jednak w naszym przypadku możemy prowadzić długotrwałe leczenie farmakologiczne sferoid bez konieczności zaburzania struktury i fizjologii komórek. W związku z tym konieczne jest przejście z kultur 2D na 3D, aby lepiej modelować zjawiska biologiczne in vivo i dalej rozwijać się naukowo.
Ten artykuł przedstawia metodologię hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności (Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2) i pokazuje półautomatyczny system do fenotypowego charakteryzowania struktur 3D (Rysunek 3). Na poziomie obrazu podajemy informacje na temat zliczania i mierzenia powierzchni sferoid (Rysunek 3). Korzystając z metod spektrometrii mas, pokazujemy, w jaki sposób proteomika może być wykorzystana do oceny określonych funkcji biologicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Zbierając i analizując te dane, mamy nadzieję poprawić zrozumienie biologii stojącej za systemami hodowli komórkowych 3D.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>końcówka Luer lock, wyskalowana do 12 ml</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta filtracyjna Orochem</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka przypodłogowa</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy kolektor próżniowy</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Bioreaktor do hodowli komórkowych 3D</td></tr><tr><td>Inkubator ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Inkubator CO2 do hodowli komórkowych 3D</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia 24-dołkowa okrągłodenna płytka mocująca o bardzo niskim dnie, zawierająca mikrodołki</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>inkubator CO2 do hodowli komórkowych 2D</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC</td><td>Metanol</td> klasy HPLC Fisher Scientific <td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Resin 30 &micro; m</td><td></td><td></td> Spektrometr masowy Waters 186007549 <td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Mikroskop PAULA</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 wieloetykietowy czytnik mikropłytek</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier pH</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoetanolamina</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Reprosil-Pur</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 & Aring; wielkość porów, faza C18-AQ, 3 &mu; Rozmiar kulki</td></tr><tr><td>M SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna modyfikowana do sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V511A Koncentrator próżniowy</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac (płytki 96-dołkowe)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterylny kaptur</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>długości 3", średnicy 0,05"</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td> wodna Vortex <td>Sigma</td> Z258415 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3d

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Prezentujemy protokół, który opisuje właściwości i zalety korzystania z samodzielnego inkubatora klinostatu do hodowli, leczenia i monitorowania kultur komórkowych 3D. Klinostat naśladuje środowisko, w którym komórki mogą gromadzić się jako wysoce powtarzalne sferoidy o niskich siłach ścinających i aktywnej dyfuzji składników odżywczych. Wykazaliśmy, że zarówno hepatocyty nowotworowe, jak i nienowotworowe (linie komórkowe HepG2/C3A i THLE-3) wymagają 3 tygodni wzrostu, zanim osiągną funkcje porównywalne z komórkami wątroby. Protokół ten podkreśla wygodę korzystania z inkubatorów do komórek 3D z kamerami monitorującymi wzrost komórek, ponieważ podczas leczenia można wykonywać migawki w celu zliczenia i zmierzenia sferoid. Opisujemy porównanie linii komórkowych THLE-3 i HepG2/C3A, pokazując, w jaki sposób można hodować nienowotworowe linie komórkowe, a także unieśmiertelnione komórki rakowe. Pokazujemy i ilustrujemy, w jaki sposób eksperymenty proteomiczne można przeprowadzić z kilku sferoid, które można zebrać bez zakłócania sygnalizacji komórkowej, tj. Nie jest wymagana trypsynizacja. Pokazujemy, że analiza proteomiczna może być wykorzystana do monitorowania typowego fenotypu wątroby metabolizmu łańcucha oddechowego i produkcji białek zaangażowanych w detoksykację metali oraz opisania półautomatycznego systemu do liczenia i pomiaru obszaru sferoidy. Podsumowując, protokół przedstawia zestaw narzędzi, który obejmuje charakterystykę fenotypową za pomocą przechwytywania obrazu oraz proces proteomiki do eksperymentowania na modelach hodowli komórkowych 3D.

W niniejszym protokole opisujemy właściwości innowacyjnego, bezstresowego inkubatora komórek 3D, systemu zaprojektowanego specjalnie do hodowli sferoidów 3D (Rysunek 2). Zoptymalizowaliśmy protokół hodowli 3D dla linii komórkowych THLE-3 oraz HepG2/C3A. Opisany tutaj protokół jest prosty w obsłudze i umożliwia powtarzalną oraz kosztowo efektywną hodowlę &gt; 100 sferoidów na bioreaktor. Po umieszczeniu w bioreaktorze sferoidy są traktowane w sposób podobny do komórek utrzymywanych w hodowli 2D. Optymalne warunki wzrostu uzyskuje się poprzez wymianę mediów dwa do trzech razy w tygodniu (Rysunek 2B) oraz regulację prędkości obrotowej w zależności od wzrostu i wielkości sferoidów (Rysunek 2C). System ten, w którym sferoidy 3D są hodowane w rotujących bioreaktorach (Rysunek 2E,F), zapewnia optymalne środowisko wzrostu dla struktur 3D poprzez wystawianie sferoidów na równomierną i bardzo niską siłę ścinania.
Wcześniej pokazaliśmy, w jaki sposób sferoidy mogą być wykorzystywane do analizy modyfikacji chromatyny16. W niniejszej pracy szczegółowo demonstrujemy sposób otrzymywania sferoidów wątrobowych oraz sposób prowadzenia eksperymentów proteomicznych w celu analizy pełnego proteomu (Rysunek 1). W skrócie, protokół rozpoczęto od hodowli komórek THLE-3 lub HepG2/C3A w monowarstwie, aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Aby hodować komórki w formie sferoidów, około 2 000 komórek wysiano na płytkę ultra-low attachment zawierającą mikrodofki, co umożliwiło ich samoagregację, a następnie uformowane sferoidy przeniesiono do bioreaktora (Rysunek 1A). Choć, jak wykazano wcześniej17, są one funkcjonalnie aktywne po 3 tygodniach hodowli, w tym protokole prezentujemy wyniki uzyskane z sferoidów zebranych po 36 dniach hodowli. Po zebraniu sferoidy odwirowano, a zarówno osad, jak i nadsącz przechowywano do analizy. Żywotność komórek oceniono na podstawie nadsączu poprzez ilościowe oznaczenie kinazy adenylanowej uwalnianej przez uszkodzone komórki, zgodnie z wcześniejszym opisem17. Białka komórkowe wyekstrahowano z osadu komórkowego, a pełny proteom przeanalizowano za pomocą wysokorozdzielczej spektrometrii mas (Rysunek 1B).
Niniejszy protokół demonstruje również półautomatyczną metodę zliczania sferoidów (Rycina 3A) przy użyciu publicznego programu do przetwarzania obrazów FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Do analizy należy wykonać wysokiej jakości zdjęcie sferoidu, uwzględniając parametry opisane w sekcji 5. Następnie, po przygotowaniu zdjęcia do analizy, do zliczania sferoidów wykorzystuje się skrypt makro (Plik uzupełniający 1). Działanie makra polega na utworzeniu folderu o nazwie FIJI Spheroids counting wewnątrz katalogu, w którym znajdują się zdjęcia sferoidów. W folderze tym zapisywane są wszystkie informacje z analizy; obejmuje to zdjęcie zliczonych sferoidów z przypisanym do każdego z nich numerem ID. Zawiera on również plik Excel o nazwie spheroid counting. Plik ten zawiera powierzchnię w pikselach oraz numer ID każdego zliczonego sferoidu. Dane odpowiadające jednemu analizowanemu zdjęciu są prezentowane w oddzielnej karcie pliku. Karta jest etykietowana zgodnie z nazwą analizowanego zdjęcia. Ponieważ rozmiar sferoidów może być zaburzony przez wiele czynników, w tym liczbę struktur w naczyniu oraz leczenie farmakologiczne, ważne jest również monitorowanie ich powierzchni (planimetria). Przedstawiony tutaj skrypt makro (Plik uzupełniający 2) działa poprzez pomiar obszarów czarnych, które odpowiadają sferoidom na zdjęciu (Rycina 3B). Wyniki są gromadzone w pliku planimetry.xlsx, który zawiera zmierzoną powierzchnię, obwód i średnicę każdego sferoidu. Wykorzystuje się również pomiar zwany średnicą Fereta do obliczenia średnicy. Feret to najdłuższa możliwa średnica, natomiast minFeret to średnica najkrótsza. Średnica końcowa jest średnią z tych dwóch wartości. W folderze z wynikami, oprócz pliku planimetry.xlsx, znajduje się również zdjęcie zmierzonych sferoidów.
Przed przystąpieniem do analizy proteomu oceniono żywotność sferoidów w czasie trwania hodowli. Poziomy AK wzrastały do 17. dnia, osiągając około 7% śmierci komórek, a następnie spadły do poziomu poniżej 5% (Rysunek 4A), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi pracami17. Niniejszy protokół przedstawia również pełną analizę proteomu w celu monitorowania fenotypu komórek. W pierwszej kolejności porównano proteomy komórek płaskich oraz sferoidów linii THLE-3 i HepG2/C3A. Analiza pierwszej głównej składowej (PC1) wykazuje wyraźną separację próbek sferoidów od kultur komórek płaskich, a korelacja z typem komórek (THLE-3 i HepG2/C3A) wydaje się być nieistotna (Rysunek 4B). Chociaż sferoidy THLE-3 i HepG2/C3A nie tworzą wspólnych klastrów, wykazują podobne profile zgodne z funkcjami wątroby. W tym protokole prezentujemy przykład metalotionein, które odgrywają rolę w detoksykacji metali realizowanej przez wątrobę. W analizie proteomicznej zidentyfikowano dwie izoformy nadmiernie ekspresjonowane w sferoidach w porównaniu do komórek płaskich (MT1E i MT1X) (Rysunek 4C). Przedstawiono również wzbogacenie Gene Ontology (GO) dla obu linii komórkowych hodowanych jako sferoidy. Procesy metaboliczne węglowodanów, obejmujące cykl kwasu trójkarboksylowego (cykl TCA), łańcuch transportu elektronów (oddychanie komórkowe) oraz metabolizm pirogronianu, są często występującymi terminami i są wzbogacone w sferoidach zarówno HepG2/C3A, jak i THLE-3 (Rysunek 4D,E). Innymi funkcjami wzbogaconymi w obu rodzajach sferoidów są detoksykacja komórkowa oraz metabolizm kwasów tłuszczowych i cholesterolu. Wspólnie funkcje te są uznawane za kluczowe dla pracy wątroby.
<img alt="Tworzenie sferoidów w 3D hodowli komórkowej, płytka o ultraniskim przywieraniu, analiza LC-MS/MS, przetwarzanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat hodowli sferoidów i przygotowania próbek. (A) Podejście eksperymentalne do 3D hodowli komórkowej. Płaskie hodowle komórkowe przy pożądanej konfluencji poddano trypsynizacji i wysiano na płytkę 24-dołkową o ultraniskim przywieraniu zawierającą mikrodofki, w których komórki samoorganizują się w sferoidy. Po 24 h sferoidy przeniesiono do bioreaktora i hodowano do momentu uzyskania gotowości do analizy. (B) Po zebraniu sferoidy odwirowano, a otrzymany osad oraz nadsącz z hodowli przechowywano do czasu przetworzenia. Ekstrahowano histony16 oraz białka niehistonowe, które następnie poddano trawieniu do peptydów i analizie za pomocą wysokorozdzielczej spektrometrii mas. Pliki raw uzyskane ze spektrometrii mas przeszukano w bazie danych ludzkich, a następnie przetworzono dane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces hodowli komórek z komorą wilgotnościową; konfiguracja eksperymentu do analizy wzrostu komórek i mikroskopii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: System 3D hodowli komórek. (A) Części bioreaktora. Bioreaktor składa się z komory wymiany gazowej i nawilżania zawierającej koraliki wodne oraz otwieranej komory komórkowej z dwoma korkami do wymiany pożywki i zbierania sferoidów. (B) Wymiana pożywki w bioreaktorze. Bioreaktor jest napełniany 10 mL pożywki wzrostowej za pomocą strzykawki z igłą. (C) Aplikacja sterująca systemem. Prędkość obrotowa, poziom CO2, temperatura, dziennik alarmów i inne funkcje mogą być kontrolowane za pomocą jednostki sterującej. (D) Umieszczanie bioreaktora w inkubatorze 3D. Każdy bioreaktor posiada przypisany silnik, który może powoli obracać bioreaktorem. (E) Bioreaktor w ruchu z prędkością (rpm) sterowaną za pomocą tabletu (C). Prędkość (rpm) jest dostosowywana do wielkości sferoidów. (F) Bioreaktory wewnątrz inkubatora 3D. Inkubator 3D może pomieścić do 6 indywidualnie sterowanych bioreaktorów. Zdjęcie dzięki uprzejmości Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces analizy liczby sferoidów; segmentacja obrazu, wyznaczanie konturów i wyniki w tabeli danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka fenotypowa sferoidów za pomocą obrazowania. (A) Półautomatyczne liczenie sferoidów. Po wykonaniu zdjęć sferoidów w bioreaktorze, obraz jest przygotowywany do analizy w programie FIJI. Każdy sferoid zostaje przeliczony i przypisany mu jest numer identyfikacyjny (ID). Wykorzystywany jest makroprogram, a wyniki prezentują ID policzonego sferoidu, etykietę (nazwę analizowanego zdjęcia) oraz pole powierzchni (liczbę pikseli w sferoidzie). (B) Planimetryczne wyznaczanie pola powierzchni sferoidu. Za pomocą makroprogramu wyznaczane jest pole powierzchni, obwód i średnica konkretnego sferoidu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza danych sferoidów komórkowych; wykresy słupkowe, wykres rozrzutu, sieci procesów biologicznych; wyniki badań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza proteomu sferoidów wątrobowych. (A) Żywotność sferoidów obliczono na podstawie uwalniania adenylokinazy (AK) do supernatantu hodowli. Wyniki stanowią średnie z powtórzonych pomiarów ± SD. (B) Przeprowadzono analizę głównych składowych (PCA) w celu porównania proteomu płaskich hodowli i sferoidów komórek THLE-3 oraz HepG2/C3A.(C) Względna obfitość metalotionein, które są białkami eksprymowanymi przez ludzką wątrobę. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. (D) Funkcjonalnie pogrupowana sieć przedstawia wzbogacenie GO dla sferoidów HepG2/C3A oraz (E) sferoidów THLE-3, gdzie wyświetlono jedynie etykietę najbardziej istotnego terminu dla każdej grupy. Sieć została zbudowana przy użyciu oprogramowania ClueGo19. Rozmiar węzła reprezentuje istotność wzbogacenia terminu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Makro skrypt do zliczania sferoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Makro do planimetrycznego wyznaczania wielkości sferoidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Protokół ten pokazuje, jak hodować sferoidy o wysokiej powtarzalności i pokazuje, w jaki sposób można przeprowadzić eksperymenty proteomiczne w celu scharakteryzowania biologicznej funkcji struktur 3D. Nasza kultura 3D może jednocześnie wyprodukować setki powtórzeń biologicznych w tym samym bioreaktorze, a podejście LC-MS może zmierzyć obfitość tysięcy białek w jednym eksperymencie. Procedurę zademonstruje Stephanie Stransky, doktor habilitowany z laboratorium.Na początek weź zawiesinę komórek HepG2 / C3A i THLE-3. Policz liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek w kompletnej pożywce wzrostowej, aby uzyskać 1 milion komórek w maksymalnej objętości 1,5 mililitra. Umyj studzienki 24-dołkowej okrągłej płytki dolnej o bardzo niskim nasadce z 0,5 mililitra pożywki wzrostowej i odwiruj przy 3 000 g przez pięć minut.Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę i odwirować ją przez trzy minuty w temperaturze 120 g. Następnie inkubuj płytkę, aby zainicjować tworzenie sferoidów. Następnie zrównoważ bioreaktor na 24 godziny przed przeniesieniem sferoid, wypełniając komorę wilgotnościową 25 mililitrami sterylnej wody, a komorę komórkową dziewięcioma mililitrami pożywki wzrostowej za pomocą 10-mililitrowej strzykawki z długą igłą.Następnie umieść bioreaktor w inkubatorze 3D na 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Delikatnie pipetuj sferoidy w górę iw dół za pomocą końcówek o szerokości jednego mililitra, aby odłączyć je od bardzo niskiej płytki mocującej i przenieść do naczynia do hodowli tkankowej. Aby uchwycić pozostałe sferoidy, umyj płytkę 0,5 mililitra podgrzanej pożywki wzrostowej i przenieś ją do naczynia hodowlanego.Za pomocą mikroskopu świetlnego oceń rozmiar, zwartość i okrągłość sferoid, aby wybrać te, które są odpowiednio uformowane. Przenieś wybraną sferoidę do bioreaktora równoważącego wypełnionego pięcioma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. Następnie napełnij cały bioreaktor świeżą pożywką wzrostową.Umieść bioreaktor w inkubatorze 3D i wyreguluj prędkość obrotową za pomocą jednostki sterującej. Zastąp 10 mililitrów starej pożywki 10 mililitrami świeżej pożywki co dwa do trzech dni. Zmieniaj prędkość obrotową za każdym razem po wymianie nośnika.Hoduj sferoidy przez 15 dni i podziel je między dwa świeże bioreaktory. Otwórz aplikację 3D zainstalowaną na tablecie, wybierz bioreaktor i uchwyć obraz. Alternatywnie umieść czarne tło za bioreaktorem i upewnij się, że żadne światło nie odbija się od komory ogniw.Uchwyć obraz jak najbliżej bioreaktora. Następnie zbierz sferoidy, usuwając pięć mililitrów pożywki z bioreaktora za pomocą strzykawki przymocowanej do długiej igły przez górny port. Upewnij się, że sferoidy opadają do dolnej środkowej części bioreaktora.Teraz otwórz przedni port i zbierz sferoidy za pomocą końcówki o szerokości jednego mililitra. Przenieś te sferoidy do mikroprobówek wirówek, odwiruj z prędkością 500 g przez pięć minut i wyrzuć pożywkę. Umyj sferoidę, dodając 200 mikrolitrów HBSS w celu usunięcia FBS.Następnie przeprowadzić wirowanie przy 500 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie szybko zanurz sferoidalny osad w ciekłym azocie, aby go zamrozić i przechowuj ten zamrożony granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki. Aby zlizować komórki, weź probówkę z zebranymi sferoidami i zawieś je ponownie w 25 mikrolitrach 5% SDS.Homogenizować granulki, pipetując w górę i w dół. Następnie rozpuść jeden mikrogram próbek i 10 mikrolitrów 0,1% kwasu trójchlorooctowego. Po wyekstrahowaniu białka i oczyszczeniu próbek, skonfiguruj metodę akwizycji MS, aby wygenerować widma MS/MS ze zidentyfikowanych sygnałów peptydowych.Następnie przenieś płytkę do automatycznego podajnika próbek do chromatografii cieczowej w postaci nanolitrów. Ustaw pełny skan MS na stosunek masy do ładunku 300 do 1, 100 w Orbitrapie. Dostosuj rozdzielczość do 120000 i ustaw cel automatycznej kontroli wzmocnienia na 125.Następnie ustaw MS/MS w Orbitrap z sekwencyjnym oknem izolacyjnym o stosunku masy do ładunku 50. Wyceluj w cel automatycznej kontroli wzmocnienia na 400 i ustaw energię dysocjacji zderzeniowej o wyższej energii na 30. Zgodnie z analizą żywotności sferoidów, poziomy kinazy adenylanowej wzrastają do 17 dnia, co powoduje około 7% śmierci komórki.Następnie śmiertelność spada poniżej 5%Ponadto analiza pierwszego głównego składnika ujawnia wyraźne rozróżnienie między próbkami sferoidalnymi a płaskimi hodowlami komórkowymi. Analiza proteomiczna wykazała, że sferoidy THLE-3 i HepG2/C3A mają podobne profile, które odzwierciedlają czynność wątroby. Dodatkowo sferoidy wykazywały nadekspresję dwóch izoform metalotionein w porównaniu z komórkami płaskimi.Funkcjonalnie pogrupowane sieci wykazały wzbogacenie ontologii genów w procesie metabolizmu węglowodanów w sferach HepG2/C3A i THLE-3. Aby uniknąć rozlania pożywki wzrostowej, nie otwieraj ani nie zamykaj przedniego portu, gdy komora ogniwa jest całkowicie wypełniona płynem. Przygotowanie i analiza próbek opisana w tym protokole może być wykorzystana do zbadania proteomu hodowli komórek za pomocą metod 2D i 3D, a także próbek tkanek.

semi-automated-phenotypic-analysis-functional-3d-spheroid-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

W tym miejscu tworzymy platformę profilowania metabolicznego integrującą trójwymiarowe (3D) sferoidy glejaka i normalizację opartą na obrazowaniu za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Podejście to umożliwia dokładniejszą ocenę odpowiedzi metabolicznych guza na leczenie farmakologiczne i zapewnia wgląd w potencjalne mechanizmy oporności.

Postępy w profilowaniu metabolicznym trójwymiarowych sferoid guza mózgu do badań przesiewowych leków

Poznaj półautomatyczną analizę fenotypową sferoidów 3D przy użyciu spektrometrii mas LC-MS. Ta metoda umożliwia charakteryzację białek w hodowlach komórek HepG2/C3A i THLE-3.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Przeglądaj więcej filmów