Name: Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj wydajną metodę agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D przy użyciu metylocelulozy. Ta technika umożliwia łatwe izolowanie sferoidów i badanie interakcji komórkowych w trójwymiarowym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują M. Gordonowi z Queen's University Biomedical Imaging Centre za pomoc. Praca ta była wspierana przez granty operacyjne z Kanadyjskiego Towarzystwa Badań nad Rakiem (19439) i Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (MOP-142303) (LMM), a także przez stypendia dla absolwentów Ontario i stypendia z Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research Research (SMM, EYL) oraz przez Craig Jury Summer Scholarshipship (SMM).

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy szybką i elastyczną metodę wytwarzania sferoid komórkowych 3D do modelowania architektury tkanek in vivo przy użyciu niedrogich i powszechnie dostępnych odczynników. Nasz protokół wykorzystuje niecytotoksyczne i promujące adhezję właściwości MC 8,9, aby pośredniczyć w agregacji komórek i minimalizować tworzenie monowarstw komórkowych. W przeciwieństwie do matryc opartych na białkach wyizolowanych ze źródeł zwierzęcych, MC jest obojętny, nie...

Biologicznie istotna ocena zachowania komórek nowotworowych jest wyzwaniem przy użyciu tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) metodologii hodowli komórkowych, częściowo dlatego, że nie odzwierciedlają one odpowiednio mikrośrodowiska komórkowego występującego in vivo. Alternatywne podejścia włączające składniki macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli (np. testy w komorze Boydena) są bardziej fizjologicznie reprezentatywne dla środowiska tkankowego in vivo. Mogą one jednak ograniczać się do oceny zachowania poszczególnych komórek i nie podsumowują złożonych kombinacji in vivo interakcji komórka-macierz i komórka-komórka, które przyczyniają się do wzrostu tkanki lub guza1,2,3.
Użycie sferoid wielokomórkowych to nowe podejście, które dokładniej odtwarza zwartą architekturę wzrostu komórek in vivo1,4. Sferoidy mogą być używane do badania interakcji komórka-macierz normalnych komórek, ale mogą również działać jako analogi guza do modelowania cech progresji guza, takich jak wzrost przerzutowy lub oporność na leki4.
Sferoidy mogą powstawać w wyniku proliferacji pojedynczych komórek osadzonych w matrycy5, lub szybciej, poprzez promowanie agregacji wielu komórek w celu utworzenia pojedynczego klastra komórkowego (np. wisząca kropla, metody wirowania)6,7. Istniejące techniki agregacji komórek mogą wymagać kosztownych materiałów lub specjalistycznego sprzętu. Ponadto sferoidy te mają szeroki zakres rozmiarów i morfologii i mogą być trudne do wyprodukowania w dużych ilościach, co utrudnia porównania między warunkami wzrostu lub zabiegami. Wreszcie, sferoidy generowane tymi metodami mogą być trudne do wyizolowania z białkowej macierzy zewnątrzkomórkowej, w której są osadzone, do wykorzystania w innych zastosowaniach.
Tutaj opisujemy solidną i łatwo modyfikowalną metodologię agregacji komórek do szybkiego tworzenia sferoid komórkowych o stałej wielkości przy użyciu dostępnych na rynku płytek odstraszających komórki w kształcie litery U i obojętnej matrycy promującej adhezję, metylocelulozy. Po uformowaniu te wielokomórkowe sferoidy są łatwo izolowane do użytku w szerokim zakresie zastosowań. Protokół można również łatwo dostosować do generowania sferoid poprzez proliferację komórek, które można wykorzystać do oceny innych procesów komórkowych. Tutaj pokazujemy testy inwazji komórek, oznaczane ilościowo za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, oraz test anoikis, jako przykładowe zastosowania tych dwóch różnych protokołów tworzenia sferoidów.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Solanka solankowa buforowana fosforanami</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Używany do buforu do płukania PBS+; Nie autoklawować buforu do płukania PBS+ po dodaniu chlorku wapnia</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Używany do buforu do płukania PBS+; Nie autoklawować PBS+ przemywać buforu po dodaniu chlorku magnezu</td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Do tworzenia sferoidów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Do hodowli linii komórkowych SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Do hodowli linii komórkowej TT</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filtruj przed użyciem w celu usunięcia zanieczyszczeń cząstkami stałymi</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Przygotować w wodzie do 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Do hodowli linii komórkowych HCT-116, BxPC-3</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Bufor dysocjacyjny</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Do testu inwazji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3,1 mg / ml; Utrzymuj na lodzie podczas użytkowania</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Mniejsza fluorescencja tła w porównaniu do pożywki uzupełnionej czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoatraktant</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td>Do mikroskopii immunofluorescencyjnej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Szkło nakrywkowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72225-01</td><td>Do montażu wyciętych sferoid</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Służy do barwienia aktyny w skali 1:200</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Stosowany w buforze blokującym BSA</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td> Glicerol <td>zapobiegający blaknięciu</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Używany w nośniku montażowym MOWIOL</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH-Used</td><td></td> <td>do analizy obrazu&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroszkiełka</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Do montażu sferoid wycinanych</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Stosowany w podłożu montażowym MOWIOL</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Stosowany w buforze utrwalającym</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Stosowany w buforze przepuszczalnym</td></tr></tbody></table>

wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3d

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Jednowarstwowa hodowla komórkowa nie modeluje odpowiednio zachowania tkanek in vivo, co wiąże się ze złożonymi interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz. Techniki trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych są najnowszą innowacją opracowaną w celu wyeliminowania niedociągnięć w przylegającej hodowli komórek. Chociaż opracowano kilka technik wytwarzania analogów tkanek in vitro, metody te są często złożone, kosztowne do ustalenia, wymagają specjalistycznego sprzętu i są na ogół ograniczone przez kompatybilność tylko z niektórymi typami komórek. Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół agregacji komórek w wielokomórkowe sferoidy 3D o stałej wielkości, który jest zgodny ze wzrostem różnych nowotworów i normalnych linii komórkowych. Wykorzystujemy różne stężenia surowicy i metylocelulozy (MC), aby promować niezależne od zakotwiczenia wytwarzanie sferoidów i zapobiegać tworzeniu się monowarstw komórkowych w wysoce powtarzalny sposób. Optymalne warunki dla poszczególnych linii komórkowych można osiągnąć poprzez dostosowanie stężeń MC lub surowicy w pożywce do tworzenia sferoidów. Wygenerowane sferoidy 3D mogą być zbierane do wykorzystania w szerokim zakresie zastosowań, w tym w badaniach nad sygnalizacją komórkową lub ekspresją genów, badaniami przesiewowymi potencjalnych leków lub w badaniu procesów komórkowych, takich jak inwazja i migracja komórek nowotworowych. Protokół jest również łatwo przystosowany do generowania sferoid klonalnych z pojedynczych komórek i może być dostosowany do oceny niezależnego od zakotwiczenia wzrostu i odporności na anoikis. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia łatwo modyfikowalną metodę generowania i wykorzystywania sferoid komórek 3D w celu podsumowania mikrośrodowiska 3D tkanek i modelowania wzrostu in vivo komórek prawidłowych i nowotworowych.

Opisujemy elastyczną i wydajną metodę generowania dyskretnych sferoidów z wykorzystaniem płytek odpychających komórki oraz pożywek do formowania sferoidów uzupełnionych o MC. W odpowiednich warunkach stężenia MC i surowicy pojedyncze komórki osiadają i przylegają do siebie w centrum dołka, tworząc sferoidy przy minimalnej adhezji do dna dołka. Zastosowanie tego protokołu pozwoliło na wygenerowanie sferoidów z różnych linii komórkowych (Rysunek 2B). W przypadku każdej lini...

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

LEKTOR Ogólnym celem tej metody jest wydajne generowanie dużych ilości stabilnych sferoidów komórkowych poprzez agregację komórek do wykorzystania w różnych testach opartych na komórkach. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie nier białkowej, rozpuszczalnej w wodzie matrycy do agregacji komórek i formowania sferoidów, co umożliwia łatwą i szybką izolację sferoidów. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu nowych informacji z zakresu biologii komórki na temat wpływu oddziaływań komórka-komórka oraz komórka-matryca na wzrost tkanki w trójwymiarowym mikrośrodowisku.NARRATOR Przed przygotowaniem agregatów podgrzać 50 mililitrów wody ultrapurej do 80 °C i dodać 10 gramów proszku metylocelulozy. Mieszać zawiesinę do czasu równomiernego rozprzestrzenienia cząsteczek. Następnie dolać zimnej wody ultrapurej do końcowej objętości 100 mililitrów i przechowywać cząsteczki przez noc w temperaturze 4 °C, aż roztwór stanie się przejrzysty, słomkowy i pozbawiony widocznych ciał stałych.Przepuść roztwór przez filtr o porach 0,45 µm, aby usunąć nierozpuszczone fragmenty, a następnie rozcieńcz przefiltrowany roztwór w odpowiedniej pożywce hodowlanej do stężenia 1:5 mg/ml. Następnie przefiltruj pożywkę uzupełnioną metylocelulozą przez sito o porach 0,22 µm. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przemyj subkulturę o 70% konfluencji buforem PBS i inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w trzech mililitrach buforu asocjacyjnego Trypsin-EDTA.Po kilku minutach należy sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x. Gdy komórki oderwą się od płytki, reakcję neutralizuje się siedmioma mililitrami pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy. Roztwór komórek należy przenieść do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie zebrać uwolnione komórki poprzez wirowanie.Najczęstszą przyczyną niepowodzenia w formowaniu sferoidów, poza obecnością zanieczyszczających cząsteczek, jest stosowanie nieoptymalnych stężeń metylocelulozy lub surowicy dla agregacji i wzrostu konkretnej linii komórkowej. NARRATOR-Używając mikropipety P1000 z końcówką z filtrem, zresuspenduj osad poprzez trzykrotne lub pięciokrotne pipetowanie 1 mL medium do formowania sferoidów, dociskając końcówkę pipety do dna probówki pod niewielkim kątem i powoli pipetując bez całkowitego wydmuchiwania zawartości końcówki, aby rozbić grudki osadu. Po policzeniu komórek rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 1×10⁴ komórek/mL, a sterylny zbiornik do pipety wielokanałowej przepłucz filtrowaną wodą ultrapure, aby usunąć kurz i włókna.Przenieś komórki do zbiornika i za pomocą końcówek z filtrem nanieś 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki z półkolistym dnem (U-bottom) o właściwościach odpychających komórki, okresowo mieszając zawiesinę, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie zbiornika. Po rozniesieniu wszystkich komórek umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek i codziennie sprawdzaj dołki pod kątem tworzenia się sferoidów. Komórki powinny osiąść na dnie każdego dołka w ciągu sześciu godzin i zazwyczaj zagregować w sferoid w ciągu 24 do 48 godzin.Aby potwierdzić prawidłowy proces tworzenia sferoidów, należy użyć końcówki P10 pod mikroskopem świetlnym, aby delikatnie nanieść pożywkę na sferoid za pomocą pipety. Prawidłowo uformowane sferoidy oddzielą się od płytki i będą się toczyć, co potwierdza ich strukturę 3-D. W celu osadzenia sferoidów w kolagenie należy zastosować technikę pipetowania wstecznego, aby równomiernie pokryć dno każdej studni ośmiostudniowej szkiełka do hodowli tkanek minimum 50 µL zneutralizowanego kolagenu na studnię.Po pokryciu wszystkich dołków, umieść szkiełko komorowe w 35 mm naczyniu hodowlanym wypełnionym wodą ultrapurą, a następnie umieść całość w 10 cm naczyniu hodowlanym i inkubuj naczynie 10 cm w temperaturze 37 °C przez około godzinę. Po spolimeryzowaniu kolagenu, użyj końcówki z filtrem P1000, aby ostrożnie przenieść wcześniej uformowane sferoidy do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Kluczowe jest inkubowanie warstw podstawowych kolagenu aż do ich całkowitej polimeryzacji, aby uniknąć naruszenia kolagenu podczas dodawania sferoidów lub pożywki.Narrator Zgatheredne sferoidy odwiruj w mikrowirówce stołowej, a następnie za pomocą pipety P200 usuń nadmiar supernatantu, w razie potrzeby odsączając go poprzez odwrócenie probówki na czystym ręczniku papierowym. Używając końcówki do pipety P200 o szerokim wylocie, niezwłocznie resuspenduj sferoidy w 50 µl zneutralizowanego kolagenu i ostrożnie przenieś mieszaniny sferoidów z kolagenem do każdego dołka ośmio-dołkowej szkiełka do hodowli tkanek. Umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze aż do czasu polimeryzacji kolagenu.Po około godzinie do każdej studzienki należy powoli dodać co najmniej 100 µL ogrzanej pożywki hodowlanej zawierającej odpowiednią substancję do badania w celu przeprowadzenia kolejnej inkubacji. Następnie, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, należy wykonać sekcje obrazowania optycznego przez naciekające sferoidy. Zastosowanie tego protokołu pozwala na generowanie sferoidów z różnych linii komórkowych.W odpowiednich warunkach traktowania metylocelulozą i surowicą poszczególne komórki opadają i przylegają do siebie w centrum studzienki, tworząc sferoidy o minimalnej adhezji do dna studzienki. Niektóre linie komórkowe są zdolne do przylegania do płytek odpychających komórki w przypadku braku lub niskich stężeń metylocelulozy, co prowadzi do powstania sferoidu otoczonego monowarstwą komórkową. Zasadniczo wyższe stężenia metylocelulozy zapobiegają przyleganiu komórek do studzienki.Jednak zbyt wysokie stężenie metylocelulozy zmniejsza adhezję międzykomórkową i zapobiega osiadaniu komórek na dnie studzienki, co prowadzi do powstawania luźnych agregatów i licznych sferoidów satelitarnych. Sferoidy zatopione w kolagenie można traktować chemoatraktantem, aby wywołać inwazję pojedynczych komórek z sferoidu na zewnątrz do otaczającej macierzy. Utrwalone sferoidy zatopione w kolagenie można obrazować za pomocą mikroskopii w jasnym polu w celu ilościowego określenia odległości i liczby komórek inwazyjnych lub za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, aby zwizualizować struktury inwazyjne utworzone przez migrujące komórki.Ważne jest, aby zapewnić komórkom wystarczająco dużo czasu na agregację w strukturalnie stabilne sferoidy, które będą na tyle wytrzymałe, by można było nimi manipulować bez ryzyka fragmentacji oraz łatwo je zebrać do wykorzystania w kolejnych analizach. Nasz protokół hodowli komórek można dodatkowo dostosować do wielu innych testów biologii komórki. Na przykład osadzanie komórek w mediach uzupełnionych wysokimi stężeniami metylocelulozy może być wykorzystane do oceny oporności komórek na siły ścinające.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób generowania trójwymiarowych sferoid komórkowych poprzez agregację, co będzie cennym narzędziem w wielu zastosowaniach z zakresu biologii komórki.

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Sferoidy komórkowe były uważane za jeden z potencjalnych modeli w dziedzinie zastosowań biologicznych. W tym artykule opisano protokoły skalowalnego generowania sferoid komórkowych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D, które zapewnia wydajną metodę solidnego i szybkiego wytwarzania jednolitych sferoid komórkowych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Poznaj wydajną metodę agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D przy użyciu metylocelulozy. Ta technika umożliwia łatwe izolowanie sferoidów i badanie interakcji komórkowych w trójwymiarowym środowisku.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Przeglądaj więcej filmów