Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D
27 marca 2017
Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.
LEKTOR Ogólnym celem tej metody jest wydajne generowanie dużych ilości stabilnych sferoidów komórkowych poprzez agregację komórek do wykorzystania w różnych testach opartych na komórkach. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie nier białkowej, rozpuszczalnej w wodzie matrycy do agregacji komórek i formowania sferoidów, co umożliwia łatwą i szybką izolację sferoidów. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu nowych informacji z zakresu biologii komórki na temat wpływu oddziaływań komórka-komórka oraz komórka-matryca na wzrost tkanki w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
NARRATOR Przed przygotowaniem agregatów podgrzać 50 mililitrów wody ultrapurej do 80 °C i dodać 10 gramów proszku metylocelulozy. Mieszać zawiesinę do czasu równomiernego rozprzestrzenienia cząsteczek. Następnie dolać zimnej wody ultrapurej do końcowej objętości 100 mililitrów i przechowywać cząsteczki przez noc w temperaturze 4 °C, aż roztwór stanie się przejrzysty, słomkowy i pozbawiony widocznych ciał stałych.
Przepuść roztwór przez filtr o porach 0,45 µm, aby usunąć nierozpuszczone fragmenty, a następnie rozcieńcz przefiltrowany roztwór w odpowiedniej pożywce hodowlanej do stężenia 1:5 mg/ml. Następnie przefiltruj pożywkę uzupełnioną metylocelulozą przez sito o porach 0,22 µm. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przemyj subkulturę o 70% konfluencji buforem PBS i inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w trzech mililitrach buforu asocjacyjnego Trypsin-EDTA.
Po kilku minutach należy sprawdzić komórki pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x. Gdy komórki oderwą się od płytki, reakcję neutralizuje się siedmioma mililitrami pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy. Roztwór komórek należy przenieść do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie zebrać uwolnione komórki poprzez wirowanie.
Najczęstszą przyczyną niepowodzenia w formowaniu sferoidów, poza obecnością zanieczyszczających cząsteczek, jest stosowanie nieoptymalnych stężeń metylocelulozy lub surowicy dla agregacji i wzrostu konkretnej linii komórkowej. NARRATOR-Używając mikropipety P1000 z końcówką z filtrem, zresuspenduj osad poprzez trzykrotne lub pięciokrotne pipetowanie 1 mL medium do formowania sferoidów, dociskając końcówkę pipety do dna probówki pod niewielkim kątem i powoli pipetując bez całkowitego wydmuchiwania zawartości końcówki, aby rozbić grudki osadu. Po policzeniu komórek rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 1×10⁴ komórek/mL, a sterylny zbiornik do pipety wielokanałowej przepłucz filtrowaną wodą ultrapure, aby usunąć kurz i włókna.
Przenieś komórki do zbiornika i za pomocą końcówek z filtrem nanieś 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki z półkolistym dnem (U-bottom) o właściwościach odpychających komórki, okresowo mieszając zawiesinę, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie zbiornika. Po rozniesieniu wszystkich komórek umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek i codziennie sprawdzaj dołki pod kątem tworzenia się sferoidów. Komórki powinny osiąść na dnie każdego dołka w ciągu sześciu godzin i zazwyczaj zagregować w sferoid w ciągu 24 do 48 godzin.
Aby potwierdzić prawidłowy proces tworzenia sferoidów, należy użyć końcówki P10 pod mikroskopem świetlnym, aby delikatnie nanieść pożywkę na sferoid za pomocą pipety. Prawidłowo uformowane sferoidy oddzielą się od płytki i będą się toczyć, co potwierdza ich strukturę 3-D. W celu osadzenia sferoidów w kolagenie należy zastosować technikę pipetowania wstecznego, aby równomiernie pokryć dno każdej studni ośmiostudniowej szkiełka do hodowli tkanek minimum 50 µL zneutralizowanego kolagenu na studnię.
Po pokryciu wszystkich dołków, umieść szkiełko komorowe w 35 mm naczyniu hodowlanym wypełnionym wodą ultrapurą, a następnie umieść całość w 10 cm naczyniu hodowlanym i inkubuj naczynie 10 cm w temperaturze 37 °C przez około godzinę. Po spolimeryzowaniu kolagenu, użyj końcówki z filtrem P1000, aby ostrożnie przenieść wcześniej uformowane sferoidy do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Kluczowe jest inkubowanie warstw podstawowych kolagenu aż do ich całkowitej polimeryzacji, aby uniknąć naruszenia kolagenu podczas dodawania sferoidów lub pożywki.
Narrator Zgatheredne sferoidy odwiruj w mikrowirówce stołowej, a następnie za pomocą pipety P200 usuń nadmiar supernatantu, w razie potrzeby odsączając go poprzez odwrócenie probówki na czystym ręczniku papierowym. Używając końcówki do pipety P200 o szerokim wylocie, niezwłocznie resuspenduj sferoidy w 50 µl zneutralizowanego kolagenu i ostrożnie przenieś mieszaniny sferoidów z kolagenem do każdego dołka ośmio-dołkowej szkiełka do hodowli tkanek. Umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze aż do czasu polimeryzacji kolagenu.
Po około godzinie do każdej studzienki należy powoli dodać co najmniej 100 µL ogrzanej pożywki hodowlanej zawierającej odpowiednią substancję do badania w celu przeprowadzenia kolejnej inkubacji. Następnie, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, należy wykonać sekcje obrazowania optycznego przez naciekające sferoidy. Zastosowanie tego protokołu pozwala na generowanie sferoidów z różnych linii komórkowych.
W odpowiednich warunkach traktowania metylocelulozą i surowicą poszczególne komórki opadają i przylegają do siebie w centrum studzienki, tworząc sferoidy o minimalnej adhezji do dna studzienki. Niektóre linie komórkowe są zdolne do przylegania do płytek odpychających komórki w przypadku braku lub niskich stężeń metylocelulozy, co prowadzi do powstania sferoidu otoczonego monowarstwą komórkową. Zasadniczo wyższe stężenia metylocelulozy zapobiegają przyleganiu komórek do studzienki.
Jednak zbyt wysokie stężenie metylocelulozy zmniejsza adhezję międzykomórkową i zapobiega osiadaniu komórek na dnie studzienki, co prowadzi do powstawania luźnych agregatów i licznych sferoidów satelitarnych. Sferoidy zatopione w kolagenie można traktować chemoatraktantem, aby wywołać inwazję pojedynczych komórek z sferoidu na zewnątrz do otaczającej macierzy. Utrwalone sferoidy zatopione w kolagenie można obrazować za pomocą mikroskopii w jasnym polu w celu ilościowego określenia odległości i liczby komórek inwazyjnych lub za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, aby zwizualizować struktury inwazyjne utworzone przez migrujące komórki.
Ważne jest, aby zapewnić komórkom wystarczająco dużo czasu na agregację w strukturalnie stabilne sferoidy, które będą na tyle wytrzymałe, by można było nimi manipulować bez ryzyka fragmentacji oraz łatwo je zebrać do wykorzystania w kolejnych analizach. Nasz protokół hodowli komórek można dodatkowo dostosować do wielu innych testów biologii komórki. Na przykład osadzanie komórek w mediach uzupełnionych wysokimi stężeniami metylocelulozy może być wykorzystane do oceny oporności komórek na siły ścinające.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób generowania trójwymiarowych sferoid komórkowych poprzez agregację, co będzie cennym narzędziem w wielu zastosowaniach z zakresu biologii komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybki i elastyczny protokół generowania trójwymiarowych (3D) sferoidów komórkowych poprzez agregację komórek. Metoda ta jest dostosowywalna do różnych typów komórek i znajduje zastosowanie w analizach związanych z migracją, inwazją oraz oddziaływaniami komórka-macierz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Trójwymiarowa hodowla komórek
- Techniki agregacji komórek
Wstęp
- Zrozumienie oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań komórka-macierz jest kluczowe dla wzrostu tkanek.
- Trójwymiarowe (3D) sferoidy komórkowe stanowią model bardziej istotny fizjologicznie w porównaniu do hodowli 2D.
- Zastosowanie macierzy niebiałkowej ułatwia tworzenie sferoidów.
- Metoda ta umożliwia szybką izolację sferoidów do różnorodnych analiz.
Cel badania
- Opracowanie protokołu efektywnego generowania stabilnych sferoidów komórkowych.
- Zbadanie wpływu mikrośrodowiska na zachowanie komórek.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki wzrostu tkanek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu metylocelulozy do agregacji komórek.
- Podgrzewanie i mieszanie wody ultrapure oraz proszku metylocelulozy.
- Przechowywanie roztworu w celu uzyskania przejrzystości przed użyciem.
- Zastosowanie metody w różnych testach opartych na komórkach.
Główne wyniki
- Pomyślne sformowanie trójwymiarowych sferoidów komórkowych z różnych typów komórek.
- Wykazana łatwość izolacji sferoidów przy użyciu matrycy niebiałkowej.
- Zdobycie wiedzy na temat oddziaływań komórka-matryca w środowisku 3D.
- Potencjalne zastosowania w testach migracji, inwazji oraz anoikis.
Wnioski
- Protokół ten zapewnia wszechstronne podejście do trójwymiarowej (3D) hodowli komórek.
- Można go dostosować do różnych zastosowań badawczych w biologii komórki.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie złożonych oddziaływań komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Solidne trójwymiarowe modele sferoidów są niezbędne do wypełnienia luki między tradycyjną dwuwymiarową hodowlą komórek a złożonym mikrośrodowiskiem guza in vivo, co umożliwia bardziej predykcyjną ocenę przedkliniczną. Ten elastyczny protokół agregacji wspiera wysokoprzepustowe i powtarzalne generowanie sferoidów z różnorodnych linii komórkowych, co ma bezpośredni wpływ na wczesne odkrycia, walidację celów oraz badania translacyjne. Jego adaptacyjność i skalowalność sprawiają, że stanowi on uniwersalną platformę do mechanistycznej minimalizacji ryzyka oraz ilościowego screeningu fenotypowego w badaniach nad onkologią i biologią tkanek.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań komórka-macierz w fizjologicznie istotnym kontekście 3D.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie wzrostu niezależnego od podłoża oraz oporności na anoikizę.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odtwarzanie mikrośrodowisk przypominających nowotworowe.
- Zapewnia platformę do badań nad ścieżkami inwazji i migracji opartych na postawionych hipotezach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane sferoidy o spójnym rozmiarze, odpowiednie do ilościowych testów przesiewowych leków.
- Poprawia powtarzalność i skalowalność analiz w wielu typach komórek i warunkach.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych układów 3D do dalszych badań obrazowych i analiz molekularnych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na punkty końcowe związane z inwazją, migracją i żywotnością.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dopasowuje modele in vitro do istotnej dla choroby biologii 3D w celu prowadzenia translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie testów inwazji i migracji w matrycy 3D.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając danych prognostycznych dotyczących zachowań typowych dla nowotworów.
- Wspiera badania mechanistyczne nad opornością i potencjałem metastatycznym w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda agregacji integruje się bezproblemowo od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne, wspierając zarówno schematy pracy mechanistyczne, jak i fenotypowe.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących zachowania komórek w 3D, wyjaśniając zależności w szlakach sygnałowych oraz ryzyko biologiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków w standaryzowanych systemach 3D.
- Analityka: Umożliwia pomiar inwazji, migracji i żywotności za pomocą obrazowania oraz odczytów molekularnych.
- Badania translacyjne: Łączy istotność in vitro i in vivo poprzez modelowanie mikrośrodowiska nowotworowego i mechanizmów oporności.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczny, modyfikowalny protokół, który można dostosować do różnych linii komórkowych i formatów testów w celu zastosowania w całym portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad celami i szlakami sygnałowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w kulturach 3D, poprawiając powtarzalność i skalowalność testów przesiewowych oraz analiz mechanistycznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych istotnych dla danej jednostki chorobowej na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów z walidowanymi fenotypami 3D.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek 3D oraz pracy z macierzami na bazie metylocelulozy.
- Wymaga dostępu do płytek odpychających komórki, platform obrazowania oraz standardowej infrastruktury do hodowli tkanek.
- Wymaga standaryzacji rozmiaru sferoidów, składu macierzy i czasu trwania testów w ramach zespołów w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla szerokiego zakresu linii komórkowych nowotworowych i prawidłowych poprzez optymalizację stężeń surowicy i metylocelulozy.
- Ograniczenia obejmują specyficzne dla danej linii komórkowej zachowania agregacyjne oraz konieczność starannej optymalizacji macierzy w celu uniknięcia powstania luźnych agregatów lub monowarstw.
