Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D
March 27th, 2017
Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.
NARRATOR: Ogólnym celem tej metody jest efektywne generowanie dużych ilości wytrzymałych sferoid komórkowych poprzez agregację komórek w celu ich wykorzystania w różnych testach opartych na komórkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona niebiałkową, rozpuszczalną w wodzie matrycę do agregacji komórek i tworzenia sferoidów, co umożliwia łatwą i szybką izolację sferoid. Metoda ta może pomóc w zdobyciu nowych informacji w biologii komórki na temat wpływu interakcji komórka-komórka i komórka/matryca na wzrost tkanek w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
NARRATOR Przed przygotowaniem agregatów podgrzej 50 mililitrów ultraczystej wody do 80 stopni Celsjusza i dodaj 10 gramów proszku metylocelulozy. Mieszać zawiesinę, aż cząstki zostaną równomiernie rozproszone. Następnie dodaj zimną ultraczystą wodę do końcowej objętości 100 mililitrów i przechowuj cząstki przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż roztwór stanie się klarowny i słomkowy bez widocznych ciał stałych.
Przepuścić roztwór przez filtr 0,45 mikrometra w celu usunięcia wszelkich nierozpuszczonych fragmentów i rozcieńczyć 1:5 miligrama na mililitr przefiltrowanego roztworu w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Następnie przefiltrować pożywkę uzupełnioną metylocelulozą przez sitko o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umyj 70% zlewającą się subkulturę PBS i dołącz komórki trzema mililitrami buforu asocjacyjnego trypsyna-EDTA w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Po kilku minutach obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym pod 10-krotnym powiększeniem. Gdy komórki zostaną podniesione z płytki, zneutralizuj reakcję za pomocą siedmiu mililitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą. Przenieś roztwór komórek do świeżej 15-mililitrowej probówki, a następnie zbierz uwolnione komórki przez odwirowanie.
Najczęstszą przyczyną nieudanego tworzenia się sferoidów, oprócz cząstek zanieczyszczających, jest stosowanie nieoptymalnych stężeń metylocelulozy lub surowicy do agregacji i wzrostu określonej linii komórkowej. NARRATOR - Używając mikropipety P1000 z końcówką filtrującą, przetarć paletę trzy do pięciu razy jednym mililitrem pożywki sferoidalnej, dociskając końcówkę pipety do dna probówki pod niewielkim kątem, jednocześnie pipetując powoli, nie wyrzucając całej zawartości końcówki w celu prześwitywania granulki. Po zliczeniu rozcieńczyć zawiesinę komórek do stężenia jeden raz od 10 do czwartej komórki na mililitr i przepłukać sterylny wielokanałowy zbiornik na pipety przefiltrowaną ultraczystą wodą, aby usunąć kurz i włókna.
Dozuj komórki do zbiornika i użyj końcówek filtrujących, aby przenieść 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki odstraszającej komórki w kształcie litery U, okresowo mieszając zawiesinę komórek, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie zbiornika. Po umieszczeniu wszystkich komórek umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych i codziennie sprawdzać studzienki pod kątem tworzenia się sferoidów. Komórki powinny osiąść na dnie każdej studzienki w ciągu sześciu godzin i zazwyczaj agregować się w sferoidę w ciągu 24 do 48 godzin.
Aby potwierdzić udane formowanie sferoidy, użyj końcówki P10 pod mikroskopem świetlnym, aby delikatnie pipetować podłoże nad sferoidą. Prawidłowo uformowane sferoidy odczepią się od płytki i będą się toczyć, potwierdzając ich strukturę 3D. Aby osadzić sferoidy w kolagenie, użyj pipetowania wstecznego, aby równomiernie pokryć dno każdej studzienki ośmiodołkowej komory do hodowli tkanek z co najmniej 50 mikrolitrami zneutralizowanego kolagenu na studzienkę.
Gdy wszystkie studzienki zostaną przykryte, umieść szkiełko komory w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej wypełnionym ultraczystą wodą w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i inkubuj 10-centymetrową szalkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około godzinę. Gdy kolagen zostanie spolimeryzowany, użyj końcówki filtra P1000, aby ostrożnie przenieść wstępnie uformowane sferoidy do 1,5-mililitrowych probówek wirówek. Bardzo ważne jest, aby warstwy bazowe kolagenu były inkubowane aż do całkowitej polimeryzacji, aby uniknąć zakłócenia kolagenu podczas dodawania sferoid lub podłoża.
Narrator Zebrane sferoidy należy zebrać w stołowej mikrowirówce i usunąć supernatanty za pomocą pipety P200, w razie potrzeby usuwając nadmiar supernatantu przez odwrócenie rurki na czystym ręczniku papierowym. Używając końcówki pipety P200 o szerokim otworze, natychmiast ponownie zawiesić sferoidy w 50 mikrolitrach zneutralizowanego kolagenu i ostrożnie przenieść mieszaniny kolagenu sferoidalnego do każdej studzienki szkiełka komory do hodowli tkankowej z ośmioma dołkami. Umieść szkiełko z powrotem w inkubatorze, aż kolagen zostanie spolimeryzowany.
Po około godzinie powoli dodać co najmniej 100 mikrolitrów podgrzanej pożywki hodowlanej zawierającej odpowiednią obróbkę do każdej studzienki do kolejnej inkubacji. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać przekroje obrazowania optycznego przez atakujące sferoidy. Korzystając z tego protokołu, sferoidy mogą być generowane z różnych linii komórkowych.
W odpowiednich warunkach obróbki metylocelulozą i surowicą poszczególne komórki osiadają i przylegają do siebie w środku studni, tworząc sferoidy o minimalnym przyleganiu do dna studni. Niektóre linie komórkowe są w stanie przylegać do płytek odstraszających komórki przy braku lub przy niskich stężeniach metylocelulozy, co powoduje powstanie sferoidy otoczonej monowarstwą komórki. Ogólnie rzecz biorąc, wyższe stężenia metylocelulozy uniemożliwiają przyleganie komórek do studni.
Jednak zbyt wysokie stężenie metylocelulozy zmniejsza adhezję komórek do komórek i zapobiega osiadaniu komórek na dnie studni, co prowadzi do powstawania luźnych agregatów i licznych sferoid satelitarnych. Sferoidy osadzone w kolagenie można leczyć chemoatraktantem w celu wywołania inwazji pojedynczych komórek na zewnątrz od sferoidy do otaczającej macierzy. Stałe sferoidy osadzone w kolagenie można obrazować za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu ilościowego określenia odległości i liczby atakujących komórek lub za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu wizualizacji inwazyjnych struktur utworzonych przez migrujące komórki.
Ważne jest, aby dać komórkom wystarczająco dużo czasu na agregację w strukturalnie zdrowe sferoidy, które są wystarczająco wytrzymałe, aby można było nimi manipulować bez fragmentacji i które można łatwo zebrać w celu wykorzystania w kolejnych testach. Nasz protokół wzrostu komórek może być dodatkowo dostosowany do wielu testów biologii komórki. Na przykład umieszczenie komórek w pożywkach uzupełnionych wysokimi stężeniami metylocelulozy może być wykorzystane do oceny odporności celanicznej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować trójwymiarowe sferoidy komórkowe przez agregację, co będzie cennym narzędziem dla wielu zastosowań w biologii komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szybki i elastyczny protokół generowania sferycznych 3D struktur komórkowych poprzez agregację komórek. Metoda ta jest przystosowana do różnych typów komórek i może być zastosowana w badaniach związanych z migracją komórek, inwazją i interakcjami komórka-macierz.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- 3D hodowla komórek
- Techniki agregacji komórek
Tło
- Rozumienie interakcji komórka-komórka i komórka/macierz jest kluczowe dla wzrostu tkanki.
- 3D sferyczne struktury komórkowe zapewniają bardziej fizjologicznie odpowiedni model w porównaniu z 2D hodowlami.
- Zastosowanie macierzy niebiałkowej ułatwia tworzenie sferycznych struktur.
- Ta metoda pozwala na szybkie izolację sferycznych struktur do różnych badań.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do efektywnego generowania odpornych sferycznych struktur komórkowych.
- Zbadanie wpływu mikrośrodowiska na zachowanie komórek.
- Poprawa rozumienia dynamiki wzrostu tkanki.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworu metylocelulozy do agregacji komórek.
- Podgrzewanie i mieszanie ultraczystej wody i proszku metylocelulozy.
- Przechowywanie roztworu w celu osiągnięcia klarowności przed użyciem.
- Zastosowanie metody w różnych badaniach opartych na komórkach.
Główne wyniki
- Sukces w formowaniu 3D sferycznych struktur komórkowych z różnych typów komórek.
- Wykazana łatwość izolacji sferycznych struktur za pomocą niebiałkowej macierzy.
- Przezroczyste wglądy w interakcje komórka-macierz w środowisku 3D.
- Potencjalne zastosowania w badaniach migracji, inwazji i anoikis.
Wnioski
- Protokół zapewnia wszechstronne podejście do 3D hodowli komórek.
- Może być dostosowany do różnych zastosowań badawczych w biologii komórki.
- Ta metoda poprawia rozumienie złożonych interakcji komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust 3D spheroid models are essential for bridging the gap between traditional 2D cell culture and the complex in vivo tumor microenvironment, enabling more predictive preclinical evaluation. This flexible aggregation protocol supports high-throughput, reproducible generation of spheroids from diverse cell lines, directly impacting early discovery, target validation, and translational research. Its adaptability and scalability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking and quantitative phenotypic screening in oncology and tissue biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D context.
- Supports functional validation of targets by modeling anchorage-independent growth and anoikis resistance.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating tumor-like microenvironments.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies of invasion and migration pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, size-consistent spheroids suitable for quantitative drug screening assays.
- Improves assay reproducibility and scalability across multiple cell types and conditions.
- Enables preparation of validated 3D systems for downstream imaging and molecular analyses.
- Supports reliable evaluation of compound effects on invasion, migration, and viability endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant 3D biology for translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by supporting invasion and migration assays in a 3D matrix.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on tumor-like behaviors.
- Supports mechanistic studies of resistance and metastatic potential in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic and phenotypic workflows.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of cell behavior in 3D, clarifying pathway dependencies and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in standardized 3D systems.
- Analytics: Enables measurement of invasion, migration, and viability with imaging and molecular readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by modeling tumor microenvironments and resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable protocol adaptable across cell lines and assay formats for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway studies.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows, improving reproducibility and scalability for screening and mechanistic assays.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, disease-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated 3D phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of methylcellulose-based matrices.
- Needs access to cell-repellent plates, imaging platforms, and standard tissue culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of spheroid size, matrix composition, and assay timing for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of tumor and normal cell lines with optimization of serum and methylcellulose concentrations.
- Limitations include cell line-specific aggregation behaviors and the need for careful matrix optimization to avoid loose aggregates or monolayer formation.
