Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi
20 kwietnia 2018
Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.
Ogólnym celem tej metody in vitro jest wygenerowanie trójwymiarowych sferoid hodowli komórkowych, które umożliwią testowanie obecnych standardowych lub eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Metoda ta pomaga nam zrozumieć trójwymiarowy wzrost komórek nowotworowych głowy i szyi pod wpływem promieniowania lub chemioterapii. Pozostaje powiedzieć, że obchodzenie się z pierwotnymi komórkami nowotworowymi jest trudne i nie zawsze prowadzi do niezawodnego trójwymiarowego tworzenia sferoidów.
Procedurę zademonstruje Sabina Schwenk-Zieger, technik z naszego laboratorium. Używając komórek pierwotnych z próbki guza, umieść próbkę na odpowiedniej i sterylnej powierzchni i dokładnie pokrój ją sterylnym, jednorazowym skalpelem na bardzo małe kawałki. Po wystarczającym mechanicznym oddzieleniu tkanki pierwotnej, przenieść ją do fiolki zawierającej kolagenazę 1 i 2 i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie przesiać mieszaninę przez sitko Falcon o średnicy 70 mikrometrów i przemyć zawiesinę HBSS. Po udanym oddzieleniu i późniejszym przemyciu, przenieść zawiesinę zawierającą od jednego do dwóch milionów komórek do kolby do hodowli komórek T75, aby rosła do subkonfluencji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do dziesięciu dni. Pod mikroskopem potwierdź wzrost komórek nowotworowych.
Policz komórki w hodowli. Używając 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności z wklęsłym okrągłym dnem, zasiej 5 000 pierwotnych komórek nowotworowych lub 1 000 do 2 000 komórek pośredniej linii komórkowej w 200 do 300 mikrolitrach pożywki do studzienek. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wykonuj zmiany nośników co drugi dzień. Należy zwrócić uwagę, aby nie zasysać sferoidy pipetą podczas wymiany pożywki. Hoduj sferoidy, aż zaobserwujesz trójwymiarowe konglomeraty komórkowe w kształcie sferoidy.
Należy pamiętać, aby wykluczyć studnie z nieregularnymi lub wielokrotnymi formacjami sferoidalnymi z dalszych badań. Następnie należy zmienić pożywkę na pożywkę z chemioterapią i/lub przeciwciałami monoklonalnymi w pożądanych stężeniach. Dodać cisplatynę w stężeniach 2,5, pięciu lub 10 mikromolowych lub 5-fluorouracyl w stężeniach 30 mikromolowych.
W tej procedurze zmierz rozmiar sferoidy po cyfrowej dokumentacji fotograficznej w szóstym, 10 i 16 dniu za pomocą oprogramowania graficznego. Po odwirowaniu płytki o masie 520 g przez 2,5 minuty usunąć supernatant. Następnie umyj komórki 1x PBS i ponownie odwiruj płytkę, a następnie usuń supernatant.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów enzymatycznego roztworu do oddzielania komórek do każdej fiolki, aby umożliwić rozpuszczenie sferoid. Następnie inkubuj płytkę przez osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy sferoidy pomyślnie rozpuszczają się pod mikroskopem.
Dodaj 100 mikrolitrów DMEM. Następnie odwiruj płytkę o masie 520 g przez 2,5 minuty. Następnie usunąć supernatant i zawiesić komórki w 100 mikrolitrach DMEM.
Następnie, jeśli to konieczne, wykonaj dostępny na rynku test proliferacji kolorymetrycznej i odczytaj test w czytniku ELISA. Wszystkie linie komórkowe mogą generować wiarygodne sferoidy o różnych rozmiarach i czasie odczytu. Komórki pierwotne tworzyły powtarzalne sferoidy w ultra niskich płytkach mocujących.
Barwienie Ki-67 ujawnia peryferia kultury wykazujące znacznie wyższe tempo proliferacji niż komórki centralne, naśladując dystrybucję składników odżywczych w litych guzach błony śluzowej, które często wykazują martwicze rdzenie. Tutaj wpływ kilku chemioterapii i promieniowania na rozmiar sferoidów. Promieniowanie z dwoma szarymi przed leczeniem cisplatyną prowadzi do znacznego zmniejszenia wielkości sferoidu w porównaniu z samą cisplatyną.
Wraz z dalszym utrwaleniem generowania sferoid z pierwotnych komórek ludzkich, w ten sposób można wdrożyć koncepcję testowania terapii. Sferoidy zostałyby wygenerowane po biopsji guza, a następnie przetestowane pod kątem cech molekularnych i podatności na terapię. Udało nam się ustalić protokół generowania powtarzalnych sferoid z zawiesin komórkowych zarówno dla linii komórkowych, jak i pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych.
Ten test multimodalny jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować niewielkie różnice między grupami. W przyszłości test może być wykorzystany do oceny indywidualnej odpowiedzi na standardowe i eksperymentalne protokoły terapii. Po drugie, należy dokładniej scharakteryzować komórki nowotworowe ze świeżych próbek.
I po trzecie, skorelować odpowiedź na terapię z wzorcami molekularnymi. Wykorzystanie komórek pierwotnych i generowanie sferoid pozwoliłoby na zachowanie jak największej liczby cech wzrostu guza in vivo w połączeniu z opłacalnym testem do badania indywidualnej odpowiedzi na terapię.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje trójwymiarowy model in vitro oparty na sferoidach, zaprojektowany w celu oceny podatności i oporności na terapię w przypadku raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Metoda ta ma na celu pogłębienie zrozumienia wzrostu nowotworu w odpowiedzi na leczenie radiacyjne i chemioterapię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- onkologia
- biologia komórki
Wstęp
- Rak плоскоkomórkowy głowy i szyi jest trudnym do leczenia typem nowotworu.
- Obecne terapie często wykazują zmienną skuteczność.
- Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych mogą lepiej naśladować warunki in vivo.
- Praca z pierwotnymi komórkami nowotworowymi wiąże się ze znacznymi trudnościami.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu in vitro do testowania terapii.
- Ocena skuteczności standardowych i eksperymentalnych schematów leczenia.
- Ułatwienie przyszłych badań na pierwotnych komórkach ludzkich.
Zastosowane metody
- Tworzenie trójwymiarowych sferoid kultur komórkowych.
- Wykorzystanie kolagenazy do dysocjacji tkanki.
- Inkubacja pierwotnych komórek nowotworowych w temperaturze 37 °C.
- Ocena wzrostu guza w warunkach terapeutycznych.
Główne wyniki
- Skuteczne tworzenie sferoidów z pierwotnych komórek nowotworowych.
- Wgląd w wzorce wzrostu komórek raka głowy i szyi.
- Ocena odpowiedzi na terapię w kontrolowanym środowisku.
- Potencjał do usprawnienia strategii leczenia na podstawie uzyskanych wyników.
Wnioski
- Opracowany model rokuje przyszłe możliwości badawcze.
- Zrozumienie oporności na terapię może prowadzić do lepszych wyników leczenia.
- Dalsze badania są niezbędne w celu doprecyzowania metodologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model trójwymiarowej hodowli komórkowej opartej na sferoidach odpowiada na krytyczną potrzebę tworzenia predykcyjnych systemów przedklinicznych w procesie opracowywania leków na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Dzięki umożliwieniu standaryzowanego badania podatności na terapię z wykorzystaniem pierwotnych komórek nowotworowych, test ten wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz odkrywanie biomarkerów translacyjnych. Podejście to usprawnia selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez dostarczanie ilościowych, powtarzalnych wyników, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w fazach wczesnego odkrywania i identyfikacji wiodących kandydatów na leki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w istotnym dla przebiegu choroby systemie 3D, który naśladuje architekturę guza in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe pomiary wielkości i żywotności sferoidów po zastosowaniu leczenia.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na generowanie danych do oceny zmienności odpowiedzi na terapię w różnych liniach komórkowych i próbkach pierwotnych, co wspomaga redukcję ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i rozwój analizy
- Wartość naukowa: Umożliwia standaryzowane, wysokoprzepustowe tworzenie sferoidów w płytkach o ultra niskim stopniu adhezji w celu zapewnienia spójności podczas screeningu związków.
- Wartość operacyjna: Pozwala na powtarzalną ekspozycję na schematy chemoradioterapii i immunoterapii z określonymi punktami końcowymi (rozmiar sferoidu, żywotność).
- Skalowalność: Kompatybilność z formatem 96-dołkowym wspiera standaryzację analizy oraz integrację międzyfunkcyjnych procesów roboczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych pozwala na zachowanie specyficznych dla pacjenta cech guza, co zwiększa istotność w kontekście przewidywania odpowiedzi klinicznej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia korelację odpowiedzi na terapię z wzorcami molekularnymi (np. barwieniem Ki-67) w celu zidentyfikowania mechanizmów oporności.
- Model przedkliniczny: Zapewnia kosztowo efektywny i powtarzalny system oceny schematów standardowych oraz eksperymentalnych przed badaniami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ewaluację przedkliniczną, w szczególności w programach onkologicznych koncentrujących się na guzach litych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących dynamiki wzrostu guza oraz oddziaływań w mikrośrodowisku pod wpływem presji terapeutycznej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników (rozmiar sferoidów, żywotność) po ekspozycji na cisplatynę, 5-FU lub kombinacje z promieniowaniem.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie grup terapeutycznych z wykorzystaniem cyfrowej dokumentacji fotograficznej oraz dysocjacji enzymatycznej do dalszych analiz.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez powiązanie odpowiedzi sferoidów z markerami proliferacji i profilami molekularnymi z próbek pierwotnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, kontrolowaną jakościowo platformę analityczną, którą można dostosować do różnych typów nowotworów i metod terapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Poprawia pewność predykcyjną poprzez modelowanie gradientów składników odżywczych i heterogeniczności proliferacji obserwowanej w guzach litych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom dysocjacji, wysiewania i wymiany pożywek.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza straty biologiczne, umożliwiając wczesną ocenę podatności na terapię w modelach pochodzących od pacjentów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez identyfikację osób reagujących i niereagujących przed rozpoczęciem kosztownych badań.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkanką pierwotnego guza oraz w technikach dysocjacji enzymatycznej.
- Zależność od płytek ultra-low adhesion oraz mikroskopii odwróconej do monitorowania sferoidów.
- Wymaga standaryzacji procedur wymiany pożywki, aby uniknąć uszkodzenia sferoidów podczas pipetowania.
- Wymaga walidacji na różnych liniach komórkowych HNSCC oraz próbkach pierwotnych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Ograniczenie wynikające ze zmienności wydajności tworzenia sferoidów z komórek pierwotnych, co wymaga określenia kryteriów wykluczania struktur nieregularnych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Processing the Tumor Specimen
1:39
Seeding the Cells on Ultra-low Adhesion Cell Culture Plates and Exposing Spheroids to Multimodal Standard or Experimental Tumor Therapy
2:52
Assessment of Spheroid Size and Extent of Cellular Proliferation for Assay Read-out
4:08
Results: Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
5:12
Conclusion
