Name: Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj metodę testowania terapii w sferoidalnym modelu 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Ta technika pozwala ocenić odpowiedź na chemioterapię i radioterapię przy użyciu pierwotnych komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany z grantu Uniwersytetu w Monachium (projekt FöFoLe nr: 789-781).

Wszystkie badania pokazane w tym manuskrypcie, a mianowicie wykorzystanie próbek ludzkich nowotworów, są chronione na mocy i za zgodą komisji etycznej Uniwersytetu Medycznego w Moguncji/Centrum Medycznego Uniwersytetu w Monachium. Pacjenci wyrazili świadomą zgodę zgodnie z krajowymi wytycznymi prawnymi, wyrażając zgodę na naukowe wykorzystanie nadmiaru materiału biologicznego, który został uzyskany w trakcie ich leczenia. Badania zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.
1. Pobieranie biopsji guza z raka płaskonabłonkowego głowy i
<ol>
	<li>Na sali operacyjnej lub na fotelu otolaryngologicznym należy wykonać znieczulenie ogólne (propofol i/lub sewofluran, środek zwiotczający mięśnie) lub miejscowe (2% ultrakaina, adrenalina)/powierzchniowe (ksylokaina). Uwidocznij masę guza w jamie ustnej / gardle / krtani / innych częściach górnych dróg pokarmowych i oddechowych za pomocą standardowych narzędzi operacyjnych i, jeśli to konieczne, pod mikroskopem.</li>
	<li>Pobrać świeżą biopsję guza z obrzeży zmiany nowotworowej za pomocą lub tnących narzędzi. Unikaj środka zmiany ze względu na obfitą martwicę w tym obszarze. Otrzymaną tkankę umieścić w sterylnym pojemniku z izotonicznym roztworem chlorku sodu.</li>
	<li>Po biopsji należy wykonać hemostazę w razie potrzeby, np. za pomocą dwubiegunowego lub monopolarnego urządzenia do krzepnięcia oprócz stosowania substancji zwężających naczynia krwionośne</li>.
	<li>Biopsję guza przeznaczoną do wykorzystania w eksperymentach z hodowlą komórkową należy przenieść bezpośrednio do sąsiedniego przewodu laboratoryjnego. Wyślij inne biopsje guza do patologa jak zwykle, aby wykluczyć raka.</li>
	<li>Upewnij się, że technik laboratoryjny jest gotowy do bezpośredniego przetworzenia próbki.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbki guza
<ol>
	<li>Umieść próbkę guza na odpowiedniej i sterylnej powierzchni i dokładnie pokrój ją sterylnym skalpelem jednorazowego użytku na jak najmniejsze kawałki. 
	Ostrzeżenie: Upewnij się, że status chorób zakaźnych i przenoszonych przez krew jest dobrze udokumentowany, a technik zwraca uwagę na standardowe protokoły instytucji mające na celu zapobieganie zranieniu igłą lub skaleczeniem materiałem pacjenta potencjalnie stanowiącym zagrożenie biologiczne oraz protokoły, których należy przestrzegać po możliwym urazie.</li>
	<li>Po dostatecznym mechanicznym oddzieleniu tkanki pierwotnej, umieścić tkankę w fiolce zawierającej kolagenazę I/II i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przesiać przez sitko do komórek sokoła o wielkości 70 μm i przemyć zawiesinę zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Po udanym oddzieleniu i późniejszym przemyciu, zawiesinę zawierającą 1-2 ×10 6 komórek umieścić w kolbach do hodowli komórek T75 (75 cm2), aby osiągnąć subkonfluencję przy 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Ten krok może potrwać do 10 dni.
	<ol>
		<li>Użyć specjalnej pożywki do hodowli keratynocytów składającej się z następujących składników: 125 ml zmodyfikowanej pożywki dla orłów (DMEM) firmy Dulbecco, 250 ml pożywki z uzupełnieniem keratynocytów (pożywka uzupełniona składająca się z 500 ml pożywki Keratynocytów SF, 15 mg ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE), 2,5 ml penicyliny/streptomycyny, 150 ng rekombinowanego ludzkiego nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF), 516 μL 300 mM CaCl2, mieszanka podstawowa do przygotowania z wyprzedzeniem), 125 ml mieszanki składników odżywczych F12, 10 mg BPE (0,75 ml), 75 ng rekombinowanego ludzkiego EGF (2 μL), 3,75 ml 200 mM L-alanylo-L-Glutamin-Dipeptydu (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Umieszczanie komórek na płytkach do hodowli komórkowych o bardzo niskiej adhezji
<ol>
	<li>Potwierdź wzrost komórek nowotworowych pod mikroskopem. Policz komórki w hodowli (hodowla pierwotna lub komórkowa) i zasiej 5 000 pierwotnych komórek nowotworowych lub 1 000-2 000 komórek pośredniej linii komórkowej / innej linii komórkowej w 200-300 μl pożywki (krok 3.2.) na płytkę o bardzo niskiej przyczepności z wklęsłym, okrągłym dnem (96-dołk).</li>
	<li>Hodowla komórek w temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 °C i w równych częściach DMEM i pożywki dla komórek nabłonka dróg oddechowych (BEGM), 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% pirogronianu sodu, 1% aminokwasów endogennych, 1% L-glutaminy (etap 2.3.). Jeśli stosowane są linie komórkowe, wystarczające są pożywki na bazie DMEM.
	<ol>
		<li>Wykonuj zmiany nośników co drugi dzień. Należy zwrócić uwagę, aby nie zasysać sferoidy pipetą podczas wymiany pożywki. Hodować sferoidy aż do osiągnięcia poziomu wzrostu opisanego w ppkt 3.3 (około 7-10 dni).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź spontaniczne tworzenie się sferoid pod mikroskopem, szukając trójwymiarowych konglomeratów komórkowych w kształcie sferoidy. Z dalszych badań należy wykluczyć studzienki z nieregularnymi i/lub wieloma sferoidami. 
	UWAGA: Sferoidy powinny być również widoczne gołym okiem, co ułatwia dalsze przetwarzanie i zmiany nośników, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
4. Wystawienie sferoid na multimodalną standardową lub eksperymentalną terapię nowotworów
<ol>
	<li>Wybierz żądany schemat terapii. Projektowanie wystarczająco dużych grup kontrolnych, które umożliwiają porównanie leczenia z nieleczonymi sferoidami lub sferoidami otrzymującymi tylko częściowe schematy leczenia, np. samego promieniowania. Wielkość grup kontrolnych zależy od projektu grupy eksperymentalnej i nie może być zdefiniowana uniwersalnie.</li>
	<li>Zamiana pożywek na pożywki z dodatkami, czyli pożywki z chemoterapeutykami i/lub przeciwciałami monoklonalnymi w pożądanych stężeniach. Dodać cisplatynę w stężeniach 2,5/5/10 μM lub 5-fluoruracyl (5FU) w stężeniu 30 μM. 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów o wysokiej przepustowości lub dużych rozmiarów/dużej liczby grup, można użyć automatycznego robota pipetującego zgodnie</li> z ustaleniami w eksperymentach.
	<li>Alternatywnie, należy napromieniować płytki hodowli komórkowych sferoidami o temperaturze 2 Gy za pomocą odpowiedniego urządzenia do naświetlania. 
	Uwaga: Przestrzegaj protokołów instytucji dotyczących zapobiegania narażeniu pracowników na szkodliwe promieniowanie. Pracuj tylko z wyznaczonymi i przeszkolonymi technikami zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony przed promieniowaniem. W razie potrzeby dodać chemioterapeutyki zgodnie z opisem w punkcie 4.2. potem.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w poprzednio opisanych warunkach hodowli (37 °C, etap 3.2).</li>
	<li>Po inkubacji kontynuuj hodowlę komórkową przez co najmniej 6 dni ze zmianami pożywki co drugi dzień.</li>
</ol>
5. Ocena wielkości sferoidy i zakresu proliferacji komórkowej do odczytu testu
<ol>
	<li>Zmierz wielkość sferoidy pod względem powierzchni po cyfrowej dokumentacji fotograficznej w dniu 6 (dzień 10, dzień 16) za pomocą programu graficznego (parametr 1).</li>
	<li>Po odwirowaniu płytki przy 520 x g przez 2,5 minuty, usunąć supernatant. Przemyć komórki odpowiednią ilością 1x PBS i ponownie odwirować płytkę zgodnie z opisem, a następnie usunąć supernatant (PBS).</li>
	<li>Dodać 100 μl enzymatycznego roztworu do oddzielania komórek do każdej fiolki, aby umożliwić rozpuszczenie sferoid. Inkubować płytkę przez 8 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Sprawdź, czy sferoida pomyślnie rozpuściła się pod mikroskopem. Dodać 100 μl DMEM. Odwirować płytkę o masie 520 x g przez 2,5 minuty. Usunąć supernatant i zawiesić komórki w 100 μl DMEM.</li>
	<li>Wykonaj dostępny na rynku test proliferacji kolorymetrycznej, na przykład test WST-8 na każdej fiolce zgodnie z instrukcjami producenta25. Odczytać test w czytniku testu immunoenzymatycznego (ELISA) (parametr 2).</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+early+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Profiling early head and neck cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).</li>
<li>Jerjes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tobacco+and+alcohol+and+their+reduction%2Fcessation+on+mortality+in+oral+cancer+patients%3A+short+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication.</a> Head Neck Oncol. 4, 6(2012).</li>
<li>Chen, H. H. W., Kuo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+radiotherapy+in+cancer+treatment%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges.</a> Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).</li>
<li>Boeckx, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epidermal+growth+factor+receptor+therapy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+focus+on+potential+molecular+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance.</a> Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).</li>
<li>Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+resistance+to+the+EGFR+monoclonal+antibody+cetuximab%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab.</a> Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).</li>
<li>Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Factors+in+Patients+Irradiated+for+Recurrent+Head-and-Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer.</a> Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).</li>
<li>Shirai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Definitive+and+Postoperative+Radiotherapy+for+Stage+I-IVB+Hypopharyngeal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer.</a> Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).</li>
<li>Theile, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+drug+transporters%27+significance+for+multidrug+resistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).</li>
<li>Slade, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bone+marrow%2C+disseminated+tumour+cells+and+blood-circulating+tumour+cells+in+breast+cancer+patients+after+primary+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment.</a> Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).</li>
<li>Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+head+and+neck+cancer%3A+clinical+impact+in+diagnosis+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Ledgerwood, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+intratumor+mutational+heterogeneity+varies+by+primary+tumor+sub-site%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site.</a> Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).</li>
<li>Loyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+next-generation+sequencing+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer.</a> Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).</li>
<li>Morris, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Landscape+of+Recurrent+and+Metastatic+Head+and+Neck+Cancers%3A+Insights+From+a+Precision+Oncology+Sequencing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li>
<li>Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+for+head+and+neck+cancer%3A+latest+developments+and+clinical+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential.</a> Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).</li>
<li>Mack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+non-enzymatic+in+vitro+retrieval+of+tumour+cells+from+surgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens.</a> PLoS One. 8 (1), e55540(2013).</li>
<li>Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-based+three-dimensional+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery.</a> Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Cancer Genome Atlas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas.</a> Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).</li>
<li>Duarte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+head+and+neck+squamous+carcinoma+cancer+stem-like+cells+in+a+syngeneic+mouse+model+and+analysis+of+hypoxia+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect.</a> Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).</li>
<li>Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+cancer+stem+cells%3A+Review+of+their+radiobiology+and+role+in+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers.</a> Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).</li>
<li>Cossu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Insight+into+Inhibitor+of+Apoptosis+Proteins+Recognition+by+a+Potent+Divalent+Smac-Mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49527(2012).</li>
<li>Hagemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+3D+Cell+Cultures+Enable+Personalized+Therapy+Testing+and+Drug+Discovery+in+Head+and+Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer.</a> Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).</li>
<li>Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies?</a> PLoS Med. 7 (3), e1000245(2010).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+properties+of+endometrial+cancer+in+three+dimensional+%283D%29+culture+and+2D+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer.</a> Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+pancreatic+carcinoma+spheroids+induce+a+matrix-rich%2C+chemoresistant+phenotype+offering+a+better+model+for+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing.</a> BMC Cancer. 13, 95(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udało nam się ustalić protokół generowania powtarzalnych sferoid z zawiesin komórkowych, zarówno dla linii komórkowych, jak i, we wstępnych eksperymentach, pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych. Najpierw oceniliśmy dwie wcześniej opisane metody i zidentyfikowaliśmy metodę ULA, metodę, w której stosuje się płytki hodowlane o powierzchniach o bardzo niskiej przyczepności, jako bezpieczniejszą i bardziej niezawodną metodę generowania jednolitych trójwymiarowych sferoid. Dzięki połączeniu dwóch oddzielnych metod odczytu...

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest szóstym najczęściej występującym nowotworem na świecie z rosnącą częstością występowania patogenezy związanej z zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego błony śluzowej (HPV), obok większości przypadków spowodowanych nadmiernym spożyciem nikotyny i alkoholu 1,2. Podczas gdy mniejsze guzy i stadia przedinwazyjne są zwykle dobrze leczone za pomocą chirurgicznego wycięcia, zwykle w połączeniu z wycięciem węzłów chłonnych szyjnych, leczenie zaawansowanego stadium i nawrotu HNSCC pozostaje wyzwaniem ze względu na agresywną inwazję guza z przerzutami i opornością na promieniowanie i chemioterapię protokoły3,4,5,6,7,8. Ostatnie badania sugerują dużą zmienność fenotypu komórkowego i podcharakterystykę krążących i rozsianych komórek nowotworowych właśnie się rozpoczęła9,10. Wcześniejsze przekonanie o solidnej, jednolitej masie guza musiało zostać zrewidowane w świetle ostatnich badań przeprowadzonych w ostatnich latach11,12,13,14. Obecne podejścia do charakterystyki nowotworów i identyfikacji kluczowych mutacji mogą zidentyfikować kilka genów, które wydają się być związane z opornością na terapię, ale pozostają podejściem wymagającym dużych kosztów. Co więcej, wiedza na temat genotypu niekoniecznie pozwala na wiarygodne przewidywanie fenotypu i jego odpowiedzi na leczenie.
Niewiele poczyniono postępów w poprawie ogólnego i wolnego od choroby przeżywalności w zaawansowanym stadium i nawracających chorobach. W przypadku raka związanego z nikotyną i wirusem, obecne opcje leczenia oprócz operacji obejmują agresywne schematy radioterapii i chemioterapii opartej na platynie. Istnieją implikacje dla różnych wskaźników odpowiedzi między rakiem HPV ujemnym i dodatnim; Nie doprowadziło to jednak jeszcze do zmiany ogólnych wytycznych terapeutycznych. Oporność na radioterapię i chemioterapię jest zjawiskiem powszechnym we wszystkich stadiach nowotworu i występuje zarówno w chemioterapii opartej na platynie, jak i w terapii celowanej (Anti-EGFR; naskórkowy czynnik wzrostu-receptor) oraz ostatnio pojawiające się hamowanie punktów kontrolnych<klasa SUP="xref">15. Nieskuteczna radioterapia i chemioterapia wiążą się z wysokimi kosztami znacznej zachorowalności pacjentów, między innymi w zakresie dysfagii, zapalenia błon śluzowych, suchości w jamie ustnej i ryzyka pogorszenia czynności nerek lub serca. Przewidywanie odpowiedzi na terapię przed podjęciem decyzji o ogólnej koncepcji terapii dla każdego pacjenta wydaje się być kluczowym celem, zapobiegającym niepotrzebnym koncepcjom leczenia, skutkom ubocznym i kosztom.
Staraliśmy się stworzyć model do testowania podatności leczenia poszczególnych pacjentów na obecne standardowe chemio-radioterapie, który mógłby być zintegrowany z regularnym i kontrolowanym jakościowo algorytmem leczenia onkologicznego z technicznego punktu widzenia. Dalekosiężnym celem było wykorzystanie modelu bez użycia mocno zmienionych i starych linii komórkowych, ponieważ słabo reprezentują one rzeczywiste ludzkie komórki nowotworowe bez ich zmienności i heterogeniczności, jak wiemy teraz, podczas gdy ustanowienie protokołu zostało dokonane w różnych liniach komórkowych. Aby być niezależnym tylko od komercyjnie dostępnych linii komórkowych, niedawno z powodzeniem wygenerowaliśmy pośrednią linię komórkową o nazwie "PiCa" z pierwotnych komórek HNSCC z ludzkich próbek nowotworów z konserwatywnymi markerami komórkowymi na powierzchni i ograniczonymi przejściami16. Ta linia komórkowa PiCa powinna służyć jako przygotowanie do opracowania modelu na drodze do późniejszych prób na świeżych ludzkich komórkach rakowych z biopsji guza. Wykazano, że komórki w trójwymiarowych hodowlach komórkowych reagują inaczej i bardziej podobnie jak in vivo na podawanie leków przeciwnowotworowych niż te rosnące w monowarstwach17,18,19,20,21, głównie ze względu na zachowanie właściwości migracyjnych i różnicowania niektórych podzbiorów komórek22,23,24. W tym miejscu opisujemy protokół trójwymiarowego modelu opartego na sferoidach z pośrednich linii komórkowych i pierwotnych komórek ludzkiego raka płaskonabłonkowego oraz sposoby integracji takiego modelu z leczeniem raka głowy i szyi u chirurga i onkologa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>F 0425</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco Life Technologies, Paisley, Wielka Brytania</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>A2212</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche Life Sciences, Bazylea, Szwajcaria</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Platforma do hodowli i testów 3D GravityPLUS</td><td>InSphero, Schlieren, Szwajcaria</td><td>PB-CS 06-001</td><td></td></tr><tr><td>Płyta GravityTRAP</td><td>InSphero, Schlieren, Szwajcaria</td><td>PB-CS-01-001</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane o bardzo niskim mocowaniu (ULA) Corning</td><td>, Corning, NY, USA</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowych</td><td>Promocell, Heidelberg, Niemcy</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>amfoterycyna B</td><td>Biochrom, Berlin, Niemcy</td><td>A 2612</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do wzrostu komórek nabłonka dróg oddechowych mieszanka suplementów</td><td>Promocell, Heidelberg, Niemcy</td><td>C39165</td><td></td></tr><tr><td>Test WST-8</td><td>Promocell, Heidelberg, Niemcy</td><td>PC PK-CA705-CK04</td><td></td></tr><tr><td>Keratynocyty SFMedium + L-Glutamina 500mL</td><td>Invitrogen</td><td>#17005-034</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE), 25mg</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu 2,5 i mikro; g</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>#21068-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna 10000U / ml Penicylina / 10000 i mikro; g / ml Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F12 Mieszanka składników odżywczych</td><td>Invitrogen</td><td>#21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (200 mM L-alanylo-L-glutaminy-dipeptyd w NaCl)</td><td>Invitrogen</td><td>#35050087</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg)</td><td>Life Technologies</td><td>#14025-092</td><td>(bez czerwieni fenolowej)</td></tr><tr><td>1x TrypLE Expres</td><td>Enzyme Invitrogen</td><td>#12604-013</td> <td>(bez czerwieni fenolowej)</td></tr><tr><td>Accutase (enzymatyczne rozwiązanie do odrywania komórek)</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td><td>Cat# AT104</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do komórek Falcon</td><td>BD Biosciences, USA#</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3d raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Aktualne opcje leczenia zaawansowanego i nawracającego raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) obejmują metody radioterapii i chemo-radioterapii z operacją lub bez. Podczas gdy schematy chemioterapii oparte na platynie stanowią obecnie złoty standard pod względem skuteczności i są stosowane w zdecydowanej większości przypadków, pojawiają się nowe schematy chemioterapii, a mianowicie immunoterapia. Jednak wskaźniki odpowiedzi i mechanizmy oporności na terapię dla obu schematów chemioterapii są trudne do przewidzenia i pozostają niewystarczająco poznane. Do tej pory znane są szerokie warianty mechanizmów oporności na chemioterapię i promieniowanie. Badanie to opisuje opracowanie standaryzowanego, wysokoprzepustowego testu in vitro do oceny odpowiedzi linii komórkowej HNSCC na różne schematy terapii i, miejmy nadzieję, na komórkach pierwotnych od poszczególnych pacjentów jako przyszłe narzędzie do spersonalizowanej terapii nowotworów. Test został zaprojektowany tak, aby można go było zintegrować ze standardowym algorytmem o kontrolowanej jakości dla pacjentów z HNSCC w naszym centrum opieki trzeciego stopnia; Będzie to jednak przedmiotem przyszłych badań. Wykonalność techniczna wygląda obiecująco w przypadku komórek pierwotnych z biopsji guza od rzeczywistych pacjentów. Próbki są następnie przenoszone do laboratorium. Biopsje są rozdzielane mechanicznie, a następnie poddawane jest trawieniu enzymatycznemu. Komórki są następnie hodowane w fiolkach do hodowli komórkowych o bardzo niskiej przyczepności, które sprzyjają powtarzalnemu, standaryzowanemu i spontanicznemu tworzeniu trójwymiarowych konglomeratów komórkowych w kształcie sferoidy. Sferoidy są następnie gotowe do poddania się protokołom chemoradioterapii i protokołom immunoterapii w razie potrzeby. Ostateczna żywotność komórek i wielkość sferoidy są wskaźnikami podatności na terapię i dlatego mogą być brane pod uwagę w przyszłości w celu oceny prawdopodobnej odpowiedzi pacjentów na terapię. Model ten może być cennym, opłacalnym narzędziem do spersonalizowanej terapii raka głowy i szyi.

Byliśmy w stanie powtarzalnie generować sferoidy z zawiesin pojedynczych komórek, początkowo z różnych linii komórkowych, w tym z zastrzeżonej linii komórkowej PiCa, a następnie z pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych pochodzących ze świeżych biopsji guzów, zgodnie z opisem Hagemanna et al.26. Oceniliśmy dwie uznane metody generowania sferoidów: tak zwaną metodę wiszącej kropli (HD) oraz metodę ultra-niskiej adhezji (ULA), z których ta druga okazała s...

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Ogólnym celem tej metody in vitro jest wygenerowanie trójwymiarowych sferoid hodowli komórkowych, które umożliwią testowanie obecnych standardowych lub eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Metoda ta pomaga nam zrozumieć trójwymiarowy wzrost komórek nowotworowych głowy i szyi pod wpływem promieniowania lub chemioterapii. Pozostaje powiedzieć, że obchodzenie się z pierwotnymi komórkami nowotworowymi jest trudne i nie zawsze prowadzi do niezawodnego trójwymiarowego tworzenia sferoidów.Procedurę zademonstruje Sabina Schwenk-Zieger, technik z naszego laboratorium. Używając komórek pierwotnych z próbki guza, umieść próbkę na odpowiedniej i sterylnej powierzchni i dokładnie pokrój ją sterylnym, jednorazowym skalpelem na bardzo małe kawałki. Po wystarczającym mechanicznym oddzieleniu tkanki pierwotnej, przenieść ją do fiolki zawierającej kolagenazę 1 i 2 i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie przesiać mieszaninę przez sitko Falcon o średnicy 70 mikrometrów i przemyć zawiesinę HBSS. Po udanym oddzieleniu i późniejszym przemyciu, przenieść zawiesinę zawierającą od jednego do dwóch milionów komórek do kolby do hodowli komórek T75, aby rosła do subkonfluencji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do dziesięciu dni. Pod mikroskopem potwierdź wzrost komórek nowotworowych.Policz komórki w hodowli. Używając 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności z wklęsłym okrągłym dnem, zasiej 5 000 pierwotnych komórek nowotworowych lub 1 000 do 2 000 komórek pośredniej linii komórkowej w 200 do 300 mikrolitrach pożywki do studzienek. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wykonuj zmiany nośników co drugi dzień. Należy zwrócić uwagę, aby nie zasysać sferoidy pipetą podczas wymiany pożywki. Hoduj sferoidy, aż zaobserwujesz trójwymiarowe konglomeraty komórkowe w kształcie sferoidy.Należy pamiętać, aby wykluczyć studnie z nieregularnymi lub wielokrotnymi formacjami sferoidalnymi z dalszych badań. Następnie należy zmienić pożywkę na pożywkę z chemioterapią i/lub przeciwciałami monoklonalnymi w pożądanych stężeniach. Dodać cisplatynę w stężeniach 2,5, pięciu lub 10 mikromolowych lub 5-fluorouracyl w stężeniach 30 mikromolowych.W tej procedurze zmierz rozmiar sferoidy po cyfrowej dokumentacji fotograficznej w szóstym, 10 i 16 dniu za pomocą oprogramowania graficznego. Po odwirowaniu płytki o masie 520 g przez 2,5 minuty usunąć supernatant. Następnie umyj komórki 1x PBS i ponownie odwiruj płytkę, a następnie usuń supernatant.Następnie dodaj 100 mikrolitrów enzymatycznego roztworu do oddzielania komórek do każdej fiolki, aby umożliwić rozpuszczenie sferoid. Następnie inkubuj płytkę przez osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy sferoidy pomyślnie rozpuszczają się pod mikroskopem.Dodaj 100 mikrolitrów DMEM. Następnie odwiruj płytkę o masie 520 g przez 2,5 minuty. Następnie usunąć supernatant i zawiesić komórki w 100 mikrolitrach DMEM.Następnie, jeśli to konieczne, wykonaj dostępny na rynku test proliferacji kolorymetrycznej i odczytaj test w czytniku ELISA. Wszystkie linie komórkowe mogą generować wiarygodne sferoidy o różnych rozmiarach i czasie odczytu. Komórki pierwotne tworzyły powtarzalne sferoidy w ultra niskich płytkach mocujących.Barwienie Ki-67 ujawnia peryferia kultury wykazujące znacznie wyższe tempo proliferacji niż komórki centralne, naśladując dystrybucję składników odżywczych w litych guzach błony śluzowej, które często wykazują martwicze rdzenie. Tutaj wpływ kilku chemioterapii i promieniowania na rozmiar sferoidów. Promieniowanie z dwoma szarymi przed leczeniem cisplatyną prowadzi do znacznego zmniejszenia wielkości sferoidu w porównaniu z samą cisplatyną.Wraz z dalszym utrwaleniem generowania sferoid z pierwotnych komórek ludzkich, w ten sposób można wdrożyć koncepcję testowania terapii. Sferoidy zostałyby wygenerowane po biopsji guza, a następnie przetestowane pod kątem cech molekularnych i podatności na terapię. Udało nam się ustalić protokół generowania powtarzalnych sferoid z zawiesin komórkowych zarówno dla linii komórkowych, jak i pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych.Ten test multimodalny jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować niewielkie różnice między grupami. W przyszłości test może być wykorzystany do oceny indywidualnej odpowiedzi na standardowe i eksperymentalne protokoły terapii. Po drugie, należy dokładniej scharakteryzować komórki nowotworowe ze świeżych próbek.I po trzecie, skorelować odpowiedź na terapię z wzorcami molekularnymi. Wykorzystanie komórek pierwotnych i generowanie sferoid pozwoliłoby na zachowanie jak największej liczby cech wzrostu guza in vivo w połączeniu z opłacalnym testem do badania indywidualnej odpowiedzi na terapię.

therapy-testing-spheroid-based-3d-cell-culture-model-for-head-neck

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy prostą platformę z nakładką z agarozy do hodowli trójwymiarowych wielokomórkowych sferoidów z wykorzystaniem linii komórkowych raka neuroendokrynnego. Metoda ta stanowi bardzo wygodny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na komórki nowotworów neuroendokrynnych. Może ona również pomóc w tworzeniu ludzkich sferoidów nowotworów neuroendokrynnych do celów terapii antynowotworowej.

Linie komórkowe ludzkich guzów neuroendokrynnych jako trójwymiarowy model do badania terapii ludzkich guzów neuroendokrynnych

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Poznaj metodę testowania terapii w sferoidalnym modelu 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Ta technika pozwala ocenić odpowiedź na chemioterapię i radioterapię przy użyciu pierwotnych komórek nowotworowych.

Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Przeglądaj więcej filmów