Testowanie terapii w sferoidalnym modelu hodowli komórkowej 3D raka płaskonabłonkowego głowy i szyi

Opisujemy ewolucję trójwymiarowego modelu in vitro opartego na sferoidach, który umożliwia nam przetestowanie obecnego standardu eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi na liniach komórkowych, mając na celu ocenę podatności i odporności na terapię na pierwotnych komórkach z próbek ludzkich w przyszłości.

Ogólnym celem tej metody in vitro jest wygenerowanie trójwymiarowych sferoid hodowli komórkowych, które umożliwią testowanie obecnych standardowych lub eksperymentalnych schematów terapii raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Metoda ta pomaga nam zrozumieć trójwymiarowy wzrost komórek nowotworowych głowy i szyi pod wpływem promieniowania lub chemioterapii. Pozostaje powiedzieć, że obchodzenie się z pierwotnymi komórkami nowotworowymi jest trudne i nie zawsze prowadzi do niezawodnego trójwymiarowego tworzenia sferoidów.

Procedurę zademonstruje Sabina Schwenk-Zieger, technik z naszego laboratorium. Używając komórek pierwotnych z próbki guza, umieść próbkę na odpowiedniej i sterylnej powierzchni i dokładnie pokrój ją sterylnym, jednorazowym skalpelem na bardzo małe kawałki. Po wystarczającym mechanicznym oddzieleniu tkanki pierwotnej, przenieść ją do fiolki zawierającej kolagenazę 1 i 2 i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przesiać mieszaninę przez sitko Falcon o średnicy 70 mikrometrów i przemyć zawiesinę HBSS. Po udanym oddzieleniu i późniejszym przemyciu, przenieść zawiesinę zawierającą od jednego do dwóch milionów komórek do kolby do hodowli komórek T75, aby rosła do subkonfluencji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do dziesięciu dni. Pod mikroskopem potwierdź wzrost komórek nowotworowych.

Policz komórki w hodowli. Używając 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej przyczepności z wklęsłym okrągłym dnem, zasiej 5 000 pierwotnych komórek nowotworowych lub 1 000 do 2 000 komórek pośredniej linii komórkowej w 200 do 300 mikrolitrach pożywki do studzienek. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wykonuj zmiany nośników co drugi dzień. Należy zwrócić uwagę, aby nie zasysać sferoidy pipetą podczas wymiany pożywki. Hoduj sferoidy, aż zaobserwujesz trójwymiarowe konglomeraty komórkowe w kształcie sferoidy.

Należy pamiętać, aby wykluczyć studnie z nieregularnymi lub wielokrotnymi formacjami sferoidalnymi z dalszych badań. Następnie należy zmienić pożywkę na pożywkę z chemioterapią i/lub przeciwciałami monoklonalnymi w pożądanych stężeniach. Dodać cisplatynę w stężeniach 2,5, pięciu lub 10 mikromolowych lub 5-fluorouracyl w stężeniach 30 mikromolowych.

W tej procedurze zmierz rozmiar sferoidy po cyfrowej dokumentacji fotograficznej w szóstym, 10 i 16 dniu za pomocą oprogramowania graficznego. Po odwirowaniu płytki o masie 520 g przez 2,5 minuty usunąć supernatant. Następnie umyj komórki 1x PBS i ponownie odwiruj płytkę, a następnie usuń supernatant.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów enzymatycznego roztworu do oddzielania komórek do każdej fiolki, aby umożliwić rozpuszczenie sferoid. Następnie inkubuj płytkę przez osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź, czy sferoidy pomyślnie rozpuszczają się pod mikroskopem.

Dodaj 100 mikrolitrów DMEM. Następnie odwiruj płytkę o masie 520 g przez 2,5 minuty. Następnie usunąć supernatant i zawiesić komórki w 100 mikrolitrach DMEM.

Następnie, jeśli to konieczne, wykonaj dostępny na rynku test proliferacji kolorymetrycznej i odczytaj test w czytniku ELISA. Wszystkie linie komórkowe mogą generować wiarygodne sferoidy o różnych rozmiarach i czasie odczytu. Komórki pierwotne tworzyły powtarzalne sferoidy w ultra niskich płytkach mocujących.

Barwienie Ki-67 ujawnia peryferia kultury wykazujące znacznie wyższe tempo proliferacji niż komórki centralne, naśladując dystrybucję składników odżywczych w litych guzach błony śluzowej, które często wykazują martwicze rdzenie. Tutaj wpływ kilku chemioterapii i promieniowania na rozmiar sferoidów. Promieniowanie z dwoma szarymi przed leczeniem cisplatyną prowadzi do znacznego zmniejszenia wielkości sferoidu w porównaniu z samą cisplatyną.

Wraz z dalszym utrwaleniem generowania sferoid z pierwotnych komórek ludzkich, w ten sposób można wdrożyć koncepcję testowania terapii. Sferoidy zostałyby wygenerowane po biopsji guza, a następnie przetestowane pod kątem cech molekularnych i podatności na terapię. Udało nam się ustalić protokół generowania powtarzalnych sferoid z zawiesin komórkowych zarówno dla linii komórkowych, jak i pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych.

Ten test multimodalny jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować niewielkie różnice między grupami. W przyszłości test może być wykorzystany do oceny indywidualnej odpowiedzi na standardowe i eksperymentalne protokoły terapii. Po drugie, należy dokładniej scharakteryzować komórki nowotworowe ze świeżych próbek.

I po trzecie, skorelować odpowiedź na terapię z wzorcami molekularnymi. Wykorzystanie komórek pierwotnych i generowanie sferoid pozwoliłoby na zachowanie jak największej liczby cech wzrostu guza in vivo w połączeniu z opłacalnym testem do badania indywidualnej odpowiedzi na terapię.