Name: Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę generowania sferoidów wielokomórkowych na platformie lab-on-a-CD wykorzystującej siłę odśrodkową. Technika umożliwia szybką hodowlę sferoidów z różnych typów komórek dla inżynierii tkankowej i testowania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Naukowych Podstawowych (2016R1D1A1B03934418) oraz Program Rozwoju Technologii Biologicznych i Medycznych (2018M3A9H1023141) NRF, a finansowane przez rząd koreański, MSIT.

1. Produkcja chipów do hodowli sferoidów na bazie mikroprzepływów (CMS)
<ol>
	<li>Wykonaj formy PC dla górnej i dolnej warstwy chipa kultury CMS za pomocą obróbki CNC. Szczegółowe wymiary chipa podane są w Rysunek 1.</li>
	<li>Mieszać bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1 (w/w) przez 5 minut i umieścić w eksykatorze na 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Po przelaniu mieszaniny PDMS do form chipa hodowlanego CMS należy usunąć pęcherzyki powietrza jeszcze przez 1 godzinę i utwardzić w komorze grzewczej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Umieść je w odkurzanej myjce plazmowej powierzchniami, które mają być klejone, i wystawiaj je na działanie plazmy wspomaganej powietrzem o mocy 18 W przez 30 s.</li>
	<li>Sklej dwie warstwy chipa hodowlanego CMS i umieść go w komorze grzewczej w temperaturze 80 °C na 30 minut, aby zwiększyć siłę przyczepności.</li>
	<li>Wysterylizuj chip hodowlany CMS w sterylizatorze autoklawu w temperaturze 121 °C i 15 psi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 ml fiolki zawierającej 5 × 105–1 × 106 komórek hASC lub MRC-5s w łaźni wodnej w temperaturze 36,5 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco do fiolki i delikatnie wymieszaj z pipetą o pojemności 1 000 μl.</li>
	<li>Umieścić 15 ml DMEM podgrzanego do temperatury 36,5 °C na szalce Petriego o średnicy 150 mm za pomocą pipety i dodać komórki z fiolki.</li>
	<li>Po 1 dniu odessać DMEM i zastąpić go 15 ml świeżego DMEM. Następnie zmieniaj nośnik co 2 lub 3 dni.</li>
	<li>Aby oderwać komórki od szalki Petriego, dodaj 4 ml trypsyny do szalek Petriego i umieść je w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C i 5% CO2 na 4 minuty.</li>
</ol>
3. Monokulturowe formowanie sferoidów
<ol>
	<li>Umieść 2,5 ml 4% (w/v) roztworu pluronicznego F-127 w otworze wlotowym chipa hodowlanego CMS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A), obracając chip z prędkością 500–1 000 obr./min, a następnie obracaj chip z prędkością 4 000 obr./min przez 3 minuty za pomocą systemu CMS (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 2B). 
	UWAGA: Powłoka pluronowa zapobiega przyczepianiu się ogniw do portu wlotowego podczas obracania się chipa. Upewnij się, że powietrze nie jest uwięzione w mikrostudzienkach.</li>
	<li>Inkubować chip kulturowy CMS wypełniony roztworem pluronicznym przez noc w temperaturze 36,5 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń roztwór pluroniczny, wypłucz pozostały roztwór pluroniczny DMEM i susz wiór przez 12 godzin na czystej ławce.</li>
	<li>Dodaj 2,5 ml DMEM do chipa hodowlanego CMS i obracaj chip z prędkością ~ 4,000 obr./min przez 3 minuty w celu wstępnego zwilżenia wnętrza chipa.</li>
	<li>Zatrzymaj rotację i wyciągnij 100 μl DMEM, aby zrobić miejsce na wstrzyknięcie zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesin komórkowych zawierających 5 × 105 hASC lub 8× 105 MRC-5 przez pipetowanie Równomiernie rozprowadzić komórki, pipetując 3–5 razy w celu ponownego wymieszania.</li>
	<li>Obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty, aby uwięzić komórki w każdej mikrostudzience za pomocą siły odśrodkowej. 
	UWAGA: Nadmierna prędkość obrotowa może spowodować ucieczkę komórek przez otwory wyrzutowe roztworu.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 3 dni w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO2 , obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Zmieniaj pożywkę hodowlaną każdego dnia.</li>
</ol>
4. Formacja sferoidów kokultury
<ol>
	<li>Powstawanie koncentrycznych sferoid
	<ol>
		<li>Dodaj pierwsze ogniwa, 2,5 × 105 hASC i obróć chip z prędkością 3,000 obr./min. Po 3 minutach dodaj drugie ogniwa, 4 × 105 MRC-5 i obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty. Wstrzyknąć łącznie 100 μl zawiesin komórkowych metodą pipetowania. Po wstrzyknięciu ogniw należy zmienić prędkość obrotową na 500-1,000 obr./min.</li>
		<li>Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Koncentryczne sferoidy powstają w ciągu 24 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formacja sferoidalna Janusa
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających pierwsze komórki, 2,5 × 105 hASC, pipetując, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.</li>
		<li>Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających drugi zestaw komórek, 4 × 105 MRC-5, pipetując, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500–1 000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.</li>
		<li>Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając się z prędkością 1,000–2,000 obr./min. Sferoidy Janusa powstają w ciągu 24 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formacja sferoidy kanapkowej
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl zawiesin komórkowych zawierających pierwsze komórki, 1,5 × 105 hASC, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1 000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.</li>
		<li>Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających drugie komórki, 3 × 105 MRC-5, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.</li>
		<li>Inkubuj chip w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając z prędkością 1,000–2,000 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesin komórek zawierających trzecie komórki, 1,5 × 105 hASC, pipetując, gdy chip obraca się z prędkością 500–1000 obr./min. Następnie obracaj chip z prędkością 3,000 obr./min przez 3 minuty.</li>
		<li>Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5%CO2, obracając się z prędkością 1 000–2 000 obr./min. Sferoidy warstwowe powstają w ciągu 12 godzin. W przypadku hodowli długoterminowej należy codziennie zmieniać podłoże hodowlane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie komórek
<ol>
	<li>Podgrzej barwnik fluorescencyjny komórki do temperatury pokojowej (20 °C).</li>
	<li>Dodać 20 μl bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) na fiolkę, aby uzyskać 1 mM roztwór.</li>
	<li>Rozcieńczyć fluorescencję do końcowego stężenia roboczego 1 μM za pomocą DMEM.</li>
	<li>Dodać fluorescencję do zawiesiny komórek i delikatnie zawiesić za pomocą pipety.</li>
	<li>Inkubować 20 minut w temperaturze 36,5 °C, wilgotności >95% i 5% CO2 .</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CMS to zamknięty system, w którym wszystkie wstrzyknięte komórki dostają się do mikrostudzienki bez odpadów, co czyni go bardziej wydajnym i ekonomicznym niż konwencjonalne metody generowania sferoid oparte na mikrostudzienkach. W systemie CMS nośnik jest wymieniany co 12–24 godziny przez otwór ssący przeznaczony do wyjmowania nośnika z chipa (rysunek 3A). Podczas procesu zasysania mediów prawie żadne media nie wydostają się z wnętrza mikrostudzienki ze względu na napięcie powierzchniowe mię...

Łatwiej jest symulować biologiczne mikrośrodowiska in vivo za pomocą trójwymiarowej (3D) hodowli komórek sferoidalnych niż za pomocą dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek (np. konwencjonalnej hodowli komórek na szalce Petriego), aby uzyskać bardziej realistyczne wyniki eksperymentów1. Obecnie dostępne metody tworzenia sferoidów obejmują technikę wiszącej kropli2, technikę nakładania cieczy3, technikę karboksymetylocelulozy4, technikę mikroprzepływową opartą na sile magnetycznej5, oraz wykorzystanie bioreaktorów6. Chociaż każda metoda ma swoje zalety, konieczna jest dalsza poprawa odtwarzalności, produktywności i generowania sferoid kokultury. Na przykład, podczas gdy technika mikroprzepływowa oparta na sile magnetycznej5 jest stosunkowo niedroga, wpływ silnych pól magnetycznych na żywe komórki musi być dokładnie rozważony. Korzyści płynące z hodowli sferoidów, szczególnie w badaniu różnicowania i proliferacji mezenchymalnych komórek macierzystych, zostały zgłoszone w kilku badaniach7,8,9.
Odśrodkowy system mikroprzepływowy, znany również jako lab-on-a-CD (compact disc), jest przydatny do łatwego kontrolowania płynu wewnątrz i wykorzystywania rotacji substratu, a zatem jest wykorzystywany w zastosowaniach biomedycznych, takich jak testy immunologiczne10, testy kolorymetryczne do wykrywania markerów biochemicznych11, testy amplifikacji kwasów nukleinowych (PCR), zautomatyzowane systemy analizy krwi12oraz odśrodkowe urządzenia mikroprzepływowe typu "wszystko w jednym<klasa SUP="xref">13. Siłą napędową kontrolującą płyn jest siła dośrodkowa wytwarzana przez obrót. Dodatkowo, wiele funkcji mieszania, zaworów i dzielenia próbek można wykonać w prosty sposób na tej jednej platformie CD. Jednak w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami analizy biochemicznej, przeprowadzono mniej badań z zastosowaniem platform CD do komórek hodowlanych, zwłaszcza sferoidów14.
W tym badaniu pokazujemy wydajność systemu sferoidowego opartego na mikroprzepływach (CMS) poprzez monokulturę lub kokulturę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC) i ludzkich fibroblastów płuc (MRC-5). Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię badawczą naszej grupy15. W ten sposób można łatwo odtworzyć platformę lab-on-a-CD do hodowli sferoidów. Przedstawiono system generujący CMS składający się z chipa hodowli CMS, uchwytu chipa, silnika prądu stałego, mocowania silnika i platformy obrotowej. Mocowanie silnika jest drukowane w 3D z akrylonitryl-butadien-styrenem (ABS). Uchwyt wiórów i platforma obrotowa są obrabiane CNC (komputerowe sterowanie numeryczne) za pomocą komputera PC (poliwęglan). Prędkość obrotowa silnika jest regulowana w zakresie od 200 do 4 500 obr./min poprzez kodowanie algorytmu PID (proporcjonalno-całkująco-pochodnej) opartego na modulacji szerokości impulsu. Jego wymiary to 100 mm x 100 mm x 150 mm i waży 860 g, dzięki czemu jest łatwy w obsłudze. Korzystając z systemu CMS, sferoidy mogą być generowane w różnych warunkach grawitacji od 1 x g do 521 x g, dzięki czemu badanie promowania różnicowania komórek w warunkach wysokiej grawitacji można rozszerzyć z 2D cells16,17 do sferoidy 3D. Kokultura różnych typów komórek jest również kluczową technologią skutecznego naśladowania środowiska in vivo18. System CMS może z łatwością generować sferoidy monokulturowe, a także sferoidy kokulturowe o różnych typach budowy (np. koncentryczne, janusowe, kanapkowe). System CMS może być wykorzystywany nie tylko w prostych badaniach sferoidalnych, ale także w badaniach organoidów 3D, w celu uwzględnienia struktur narządów ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC)</td><td></td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyko-Antybiotyk</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Zawierał 1% kompletnego podłoża i buforu</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Czerwony CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Grawer obrotowy sterowany numerycznie (CNC)</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Silnik prądu stałego</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka eaggle'a Dulbecco (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Zawierała 10% ukończonych pożywki</td></tr><tr><td>ludzkich fibroblastów płucnych (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D program do projektowania wspomaganego komputerowo</td></tr><tr><td>szalka Petriego &Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td> Czyszczarka plazmowa <td>do obróbki powierzchniowej</td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanem do 4% (m/v) roztworu</td></tr><tr><td>Poliwęglan (PC)</td><td>Akrylmall</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma lab-on-a-cd do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Trójwymiarowa hodowla komórek sferoidalnych może przynieść bardziej użyteczne wyniki w eksperymentach komórkowych, ponieważ może lepiej symulować mikrośrodowiska komórkowe żywego ciała niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. W tym badaniu wyprodukowaliśmy napędzaną silnikiem elektrycznym platformę lab-on-a-CD (compact disc), zwaną odśrodkowym systemem hodowli sferoidalnej opartej na mikroprzepływach (CMS), aby stworzyć trójwymiarowe (3D) sferoidy komórkowe wykorzystujące dużą siłę odśrodkową. To urządzenie może zmieniać prędkości obrotowe, aby wygenerować warunki grawitacyjne od 1 x g do 521 x g. System CMS ma średnicę 6 cm, posiada sto mikrostu mikrostudzienek o wielkości 400 μm i jest wytwarzany przez formowanie z polidimetylosiloksanu w formie poliwęglanowej wstępnie wykonanej przez komputerową maszynę sterowaną numerycznie. Ściana barierowa przy wejściu do kanału systemu CMS wykorzystuje siłę odśrodkową do równomiernego rozprowadzenia komórek wewnątrz chipa. Na końcu kanału znajduje się obszar szkiełka, który umożliwia komórkom wejście do mikrostudzienek. W ramach demonstracji, sferoidy zostały wygenerowane przez monokulturę i kokulturę ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i ludzkich fibroblastów płuc w warunkach wysokiej grawitacji przy użyciu systemu. System CMS wykorzystywał prosty schemat działania do produkcji sferoid kokultury o różnych strukturach koncentrycznych, janusowych i kanapkowych. System CMS będzie przydatny w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej, które wymagają hodowli sferoidów i organoidów jednego lub wielu typów komórek.

Chip do hodowli CMS o średnicy 6 cm (Rycina 2) został pomyślnie wykonany zgodnie z powyższym protokołem. Najpierw chip został sporządzony oddzielnie z warstwy górnej i dolnej, a następnie połączony za pomocą wiązania plazmowego. Powstałe sferoidy można łatwo zebrać poprzez odłączenie chipa. Kanał chipa do hodowli CMS składa się z portu wlotowego oraz obszarów centralnego, poślizgowego i mikrowyżkowych (Rycina 3). Roztwory komórek, pożywki i pluronicu są wstrzyki...

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Technika ta może być wykorzystana do generowania sferoid komórkowych z pojedynczych i wielu typów komórek przy użyciu platformy lab-on-a-CD, pionierskiego systemu do szybkiego generowania sferoid. Technika ta wykorzystuje siłę odśrodkową do umieszczania komórek w wyznaczonych mikrostudzienkach, umożliwiając sekwencyjne uniesienie wielu typów komórek w celu wytworzenia różnych sferoid. W przypadku produkcji chipów kulturowych CMS, najpierw wykonaj formy poliwęglanowe dla górnej i dolnej warstwy chipa kulturowego za pomocą komputerowej obróbki sterowanej numerycznie.Następnie wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10 do jednego przez pięć minut przed umieszczeniem mieszaniny w eksykatorze na godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS do foremek do hodowli chipów CMS i umieść formy w eksykatorze na jeszcze jedną godzinę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Pod koniec drugiego odgazowania utwardź mieszaninę w komorze grzewczej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie umieść wióry w odkurzonej myjce plazmowej powierzchniami, które mają być klejone, do góry.Wystaw chipy hodowlane na działanie plazmy wspomaganej powietrzem o mocy 18 watów przez 30 sekund i połącz dwie warstwy chipa w komorze grzewczej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zwiększyć siłę przyczepności. Następnie sterylizuj chip hodowlany CMS w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby przygotować komórki do tworzenia sferoidów, rozmrozić jednomililitrową fiolkę zawierającą od pięciu do 10 razy 10 do pięciu komórek będących przedmiotem zainteresowania w łaźni wodnej o temperaturze 36,5 stopni Celsjusza przez dwie minuty przed dodaniem jednego mililitra DMEM do komórek z delikatnym mieszaniem.Następnie dodaj komórki do szalki Petriego o średnicy 150 milimetrów zawierającej 15 mililitrów pożywki o temperaturze 36,5 stopnia Celsjusza i umieść szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia zastąp supernatant 15 mililitrami świeżego DMEM i zwróć komórki do inkubatora. Aby odłączyć komórki, utwórz kulturę z czterema mililitrami trypsyny przez cztery minuty w temperaturze 36,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zatrzymując reakcję ze świeżą pożywką, gdy komórki podniosą się z dna naczynia.Aby oznaczyć komórki, należy ogrzać odpowiedni barwnik fluorescencyjny komórek do temperatury pokojowej przed dodaniem 20 mikrolitrów bezwodnego dimetylosulfotlenku do fiolki, aby uzyskać jednomilimolowy roztwór. Rozcieńczyć fluorescencję do końcowego stężenia roboczego jednego mikromola w DMEM i dodać barwnik do zawiesiny komórek będących przedmiotem zainteresowania, delikatnie mieszając. Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 20 minut.W przypadku tworzenia sferoidów monokulturowych, najpierw dodaj 2,5 mililitra 4% roztworu Pluronic F-127 do otworu wlotowego chipa hodowlanego CMS, obracając chip z prędkością od 500 do 1,000 obrotów na minutę. Po dodaniu całego roztworu obracaj chip z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez trzy minuty za pomocą systemu CMS. Pod koniec rotacji inkubuj chip hodowlany przez noc w temperaturze 36,5 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla.Następnego ranka usuń roztwór Pluronic i umyj chip hodowlany DMEM. Po suszeniu wióra przez 12 godzin na czystej ławce, dodaj 2,5 mililitra pożywki do portu wlotowego i obracaj wiór z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Pod koniec obrotu zastąp 100 mikrolitrów pożywki w porcie wlotowym 100 mikrolitrami przygotowanej zawiesiny ogniwa, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę.Następnie obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez trzy minuty, aby uwięzić komórki w każdej mikrostudzience za pomocą siły odśrodkowej przed umieszczeniem chipa w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy dni, odświeżając pożywkę, jak wykazano każdego dnia. Aby wygenerować koncentryczną kokulturę sferoidalną, dodaj pierwszą populację komórek w 100 mikrolitrach pożywki do portu wlotowego chipa, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty obrotu z prędkością 3 000 obrotów na minutę. Pod koniec obrotu dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę i obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez kolejne trzy minuty.Po wstrzyknięciu obu objętości komórek umieścić chip w inkubatorze do hodowli komórkowych z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez 24 godziny. Aby uzyskać formację sferoidy Janusa, dodaj 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty z prędkością 3 000 obrotów na minutę. Pod koniec rotacji umieścić chip w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu rotacji z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez trzy godziny.Pod koniec inkubacji dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez 24 godziny. Aby utworzyć sferoidy kanapkowe, najpierw dodaj 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty obrotu z prędkością 3 000 obrotów na minutę.Pod koniec obrotu umieść chip na rotatorze w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwie godziny z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę, a następnie dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500 do 1 000 obrotów na minutę. Obracaj chip z prędkością 3 000 obr./min przez trzy minuty i umieść chip z powrotem w inkubatorze na trzygodzinną inkubację z rotacją. Następnie dodaj dodatkowe 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1000 obrotów na minutę, a następnie obracaj i hoduj komórki, jak właśnie pokazano, przez 12 godzin.Zgodnie z protokołem, jak pokazano, można z powodzeniem wyprodukować chip kulturowy CMS o średnicy sześciu centymetrów. Kanał chipa hodowlanego CMS składa się z portu wlotowego oraz obszarów centralnych, szkiełkowych i mikrostudzienkowych. Zdjęcia poklatkowe dwóch typów kultur komórkowych wykonane z prędkością 2 000 obrotów na minutę przez pierwsze 24 godziny hodowli w poszczególnych chipach CMS, jak wykazano, pokazują pomyślne tworzenie sferoid.Obrazowanie mikrostudzienek po trzech dniach hodowli pokazuje, że sferoidy wykazują doskonałą jednorodność i sferyczność. Można również generować sferoidy kokulturowe o strukturach konentrycznych, janusowych i warstwowych. Ponadto hodowle komórkowe wystawione na działanie wysokiej grawitacji przez siedem dni, a następnie barwienie żywe/martwe, pokazują, że większość komórek przeżywa długotrwałą hodowlę w chipach.Górna i dolna warstwa chipa hodowlanego CMS powinny być starannie wyrównane, gdy są połączone, w przeciwnym razie liczba komórek w każdej mikrostudzience może nie być równa. Badanie to może obniżyć barierę wejścia do badań sferoidalnych w kokulturze i może być szeroko stosowane w badaniach nad kokulturą, na przykład do badań przesiewowych nowych leków, które mogą być przedmiotem zainteresowania.

lab-on-cd-platform-for-generating-multicellular-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj metodę generowania sferoidów wielokomórkowych na platformie lab-on-a-CD wykorzystującej siłę odśrodkową. Technika umożliwia szybką hodowlę sferoidów z różnych typów komórek dla inżynierii tkankowej i testowania leków.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Przeglądaj więcej filmów