Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Technika ta może być wykorzystana do generowania sferoid komórkowych z pojedynczych i wielu typów komórek przy użyciu platformy lab-on-a-CD, pionierskiego systemu do szybkiego generowania sferoid. Technika ta wykorzystuje siłę odśrodkową do umieszczania komórek w wyznaczonych mikrostudzienkach, umożliwiając sekwencyjne uniesienie wielu typów komórek w celu wytworzenia różnych sferoid. W przypadku produkcji chipów kulturowych CMS, najpierw wykonaj formy poliwęglanowe dla górnej i dolnej warstwy chipa kulturowego za pomocą komputerowej obróbki sterowanej numerycznie.

Następnie wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10 do jednego przez pięć minut przed umieszczeniem mieszaniny w eksykatorze na godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS do foremek do hodowli chipów CMS i umieść formy w eksykatorze na jeszcze jedną godzinę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Pod koniec drugiego odgazowania utwardź mieszaninę w komorze grzewczej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie umieść wióry w odkurzonej myjce plazmowej powierzchniami, które mają być klejone, do góry.

Wystaw chipy hodowlane na działanie plazmy wspomaganej powietrzem o mocy 18 watów przez 30 sekund i połącz dwie warstwy chipa w komorze grzewczej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zwiększyć siłę przyczepności. Następnie sterylizuj chip hodowlany CMS w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby przygotować komórki do tworzenia sferoidów, rozmrozić jednomililitrową fiolkę zawierającą od pięciu do 10 razy 10 do pięciu komórek będących przedmiotem zainteresowania w łaźni wodnej o temperaturze 36,5 stopni Celsjusza przez dwie minuty przed dodaniem jednego mililitra DMEM do komórek z delikatnym mieszaniem.

Następnie dodaj komórki do szalki Petriego o średnicy 150 milimetrów zawierającej 15 mililitrów pożywki o temperaturze 36,5 stopnia Celsjusza i umieść szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Następnego dnia zastąp supernatant 15 mililitrami świeżego DMEM i zwróć komórki do inkubatora. Aby odłączyć komórki, utwórz kulturę z czterema mililitrami trypsyny przez cztery minuty w temperaturze 36,5 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zatrzymując reakcję ze świeżą pożywką, gdy komórki podniosą się z dna naczynia.

Aby oznaczyć komórki, należy ogrzać odpowiedni barwnik fluorescencyjny komórek do temperatury pokojowej przed dodaniem 20 mikrolitrów bezwodnego dimetylosulfotlenku do fiolki, aby uzyskać jednomilimolowy roztwór. Rozcieńczyć fluorescencję do końcowego stężenia roboczego jednego mikromola w DMEM i dodać barwnik do zawiesiny komórek będących przedmiotem zainteresowania, delikatnie mieszając. Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 20 minut.

W przypadku tworzenia sferoidów monokulturowych, najpierw dodaj 2,5 mililitra 4% roztworu Pluronic F-127 do otworu wlotowego chipa hodowlanego CMS, obracając chip z prędkością od 500 do 1,000 obrotów na minutę. Po dodaniu całego roztworu obracaj chip z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez trzy minuty za pomocą systemu CMS. Pod koniec rotacji inkubuj chip hodowlany przez noc w temperaturze 36,5 stopni Celsjusza przy 5% dwutlenku węgla.

Następnego ranka usuń roztwór Pluronic i umyj chip hodowlany DMEM. Po suszeniu wióra przez 12 godzin na czystej ławce, dodaj 2,5 mililitra pożywki do portu wlotowego i obracaj wiór z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Pod koniec obrotu zastąp 100 mikrolitrów pożywki w porcie wlotowym 100 mikrolitrami przygotowanej zawiesiny ogniwa, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę.

Następnie obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez trzy minuty, aby uwięzić komórki w każdej mikrostudzience za pomocą siły odśrodkowej przed umieszczeniem chipa w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy dni, odświeżając pożywkę, jak wykazano każdego dnia. Aby wygenerować koncentryczną kokulturę sferoidalną, dodaj pierwszą populację komórek w 100 mikrolitrach pożywki do portu wlotowego chipa, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty obrotu z prędkością 3 000 obrotów na minutę. Pod koniec obrotu dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę i obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez kolejne trzy minuty.

Po wstrzyknięciu obu objętości komórek umieścić chip w inkubatorze do hodowli komórkowych z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez 24 godziny. Aby uzyskać formację sferoidy Janusa, dodaj 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty z prędkością 3 000 obrotów na minutę. Pod koniec rotacji umieścić chip w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu rotacji z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez trzy godziny.

Pod koniec inkubacji dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie obracaj chip z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez trzy minuty. Następnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę przez 24 godziny. Aby utworzyć sferoidy kanapkowe, najpierw dodaj 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1 000 obrotów na minutę, a następnie trzy minuty obrotu z prędkością 3 000 obrotów na minutę.

Pod koniec obrotu umieść chip na rotatorze w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwie godziny z prędkością od 1 000 do 2 000 obrotów na minutę, a następnie dodaj 100 mikrolitrów drugiej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością 500 do 1 000 obrotów na minutę. Obracaj chip z prędkością 3 000 obr./min przez trzy minuty i umieść chip z powrotem w inkubatorze na trzygodzinną inkubację z rotacją. Następnie dodaj dodatkowe 100 mikrolitrów pierwszej populacji komórek, podczas gdy chip obraca się z prędkością od 500 do 1000 obrotów na minutę, a następnie obracaj i hoduj komórki, jak właśnie pokazano, przez 12 godzin.

Zgodnie z protokołem, jak pokazano, można z powodzeniem wyprodukować chip kulturowy CMS o średnicy sześciu centymetrów. Kanał chipa hodowlanego CMS składa się z portu wlotowego oraz obszarów centralnych, szkiełkowych i mikrostudzienkowych. Zdjęcia poklatkowe dwóch typów kultur komórkowych wykonane z prędkością 2 000 obrotów na minutę przez pierwsze 24 godziny hodowli w poszczególnych chipach CMS, jak wykazano, pokazują pomyślne tworzenie sferoid.

Obrazowanie mikrostudzienek po trzech dniach hodowli pokazuje, że sferoidy wykazują doskonałą jednorodność i sferyczność. Można również generować sferoidy kokulturowe o strukturach konentrycznych, janusowych i warstwowych. Ponadto hodowle komórkowe wystawione na działanie wysokiej grawitacji przez siedem dni, a następnie barwienie żywe/martwe, pokazują, że większość komórek przeżywa długotrwałą hodowlę w chipach.

Górna i dolna warstwa chipa hodowlanego CMS powinny być starannie wyrównane, gdy są połączone, w przeciwnym razie liczba komórek w każdej mikrostudzience może nie być równa. Badanie to może obniżyć barierę wejścia do badań sferoidalnych w kokulturze i może być szeroko stosowane w badaniach nad kokulturą, na przykład do badań przesiewowych nowych leków, które mogą być przedmiotem zainteresowania.