Przetwarzanie nóg owadów do mikroskopii fluorescencyjnej: metoda zachowania struktur nerwowo-mięśniowych do obrazowania

- Na początek zanurz znieczulone owady w 70% roztworze etanolu, aby zmniejszyć hydrofobowość naskórka. Następnie przemyć i przepuścić tkankę roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem zawierającym detergent przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić penetrację tkanki podczas utrwalania.

Następnie usuń głowę i brzuch z klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby delikatnie wywrzeć nacisk na połączenie koksy i klatki piersiowej i odłącz nogę. Ostrożnie umieść nogi na noc w lodowatym 4% roztworze paraformaldehydu, aby mógł wniknąć w tkankę. Paraformaldehyd utrwala tkanki poprzez sieciowanie białek.

Następnie usuń roztwór utrwalający i kilkakrotnie przemyj tkankę solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą detergent. Przed zamontowaniem umieść nogi w czystym lub lekko rozcieńczonym buforze montażowym na co najmniej jeden dzień, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu, aby bufor dostał się do tkanki.

Na koniec zamontuj nogi w kropli podłoża montażowego. Użyj podkładki dystansowej między szkiełkiem mikroskopowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec uszkodzeniu preparatu, i zabezpiecz mocowanie lakierem do paznokci.

W poniższym przykładzie zobaczymy rozwarstwienie, utrwalenie i montaż nóg Drosophila melanogaster.

- Zacznij od napełnienia odpowiedniej liczby studzienek w szklanej płytce wielodołkowej 70% etanolem. Użyj pędzla, aby dodać 15 do 20 znieczulonych dwutlenkiem węgla much w każdym wieku i każdej płci do każdej studzienki i delikatnie wcieraj muchy w etanol, aż zostaną całkowicie zanurzone.

Po nie więcej niż jednej minucie spłucz muchy trzykrotnie 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami przez co najmniej 10 minut na pranie. Po ostatnim umyciu użyj kleszczy, aby usunąć głowę i brzuch każdej muchy bez uszkadzania odcinka piersiowego lub nóg, a następnie użyj końcówki cienkich kleszczy, aby delikatnie, ale stanowczo wywrzeć nacisk na połączenie koksy i klatki piersiowej, aby odłączyć jedną nogę od odcinka piersiowego.

Umieścić nogi w jednym dołku nowej płytki wielodołkowej, zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehydu na lodzie, w celu inkubacji przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

- Ważne jest, aby delikatnie wepchnąć nogi do bufora mocującego, nie pozwalając im unosić się na wodzie, aby uzyskać dobrze zamocowane nogi.

- Następnego dnia umyj nogi pięć razy w świeżym 0,3% roztworze niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 20 minut na pranie. Po ostatnim praniu wymień detergent na medium montażowe i trzymaj nogi w podłożu montażowym przez co najmniej 24 godziny.

Następnego dnia dodaj około 20 mikrolitrów 70% glicerolu obok powlekanego końca szklanego szkiełka mikroskopowego i przykryj glicerol szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 22 milimetry. Następnie dodaj około 10-mikrolitrową linię podłoża montażowego po prawej stronie szkiełka nakrywkowego i nałóż drugą 30-mikrolitrową linię podłoża montażowego po prawej stronie 10-mikrolitrowej linii.

Za pomocą cienkich kleszczyków przenieś jedną nogę z płytki wielodołkowej w kropli pożywki na 10-mikrolitrowy pasek podłoża montażowego w orientacji zewnętrznej stroną do góry lub do dołu. Powtarzaj tę czynność, aż sześć do ośmiu nóg zostanie zamontowanych i wyrównanych, a następnie umieść drugie szkiełko nakrywkowe na nogach tak, aby drugie szkiełko nakrywkowe lekko spoczywało na pierwszym szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj lakieru do paznokci w każdym rogu szkiełek nakrywkowych, aby zabezpieczyć je na miejscu.