Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie transgenicznej linii danio pręgowanego, która umożliwia obserwację komórkowych zmian elektrycznych podczas embriogenezy, ruchu larwalnego i genezy guza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, fizjologii i biologii komórek nowotworowych, takie jak: jakie są podstawowe role komórkowej sygnalizacji elektrycznej podczas embriogenezy i w komórkach nowotworowych? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam śledzić komórkową sygnalizację elektryczną in vivo i w czasie rzeczywistym.

Po przygotowaniu mRNA transpozazy Tol2 i roztworu do wstrzykiwań zgodnie z protokołem tekstowym, po południu przed wstrzyknięciem należy założyć od czterech do sześciu zbiorników hodowlanych z co najmniej dwoma samcami i dwiema samicami. Aby zmniejszyć ilość odpadów rybnych i wywołać reakcję rozrodczą, unikaj karmienia ryb po południu. Następnego ranka należy wyjąć przygotowany roztwór do wstrzykiwań z zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i umieścić go na lodzie.

Pociągnij przegrody w zbiornikach hodowlanych ryb i pozwól rybom na łączenie się w pary. Ogólnie rzecz biorąc, ryby składają jaja w ciągu 20 do 30 minut. W oczekiwaniu, za pomocą ściągacza do mikropipet o następujących parametrach, wyciągnij igły ze szkła kapilarnego.

Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby złamać koniec igły i utworzyć skośną krawędź. Mniejsza średnica jest preferowana w celu zmniejszenia śmiertelności zarodków. Gdy ryby złożą jaja, zbierz je na szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów.

Natychmiast pod mikroskopem preparacyjnym usuń wszystkie nieprawidłowe zarodki i odchody rybne. Następnie pipetować zapłodnione zarodki do przygotowanej 3% formy wtryskowej agarozy. Usuń nadmiar wody, aby pomóc utrzymać zarodki na miejscu.

Gdy wszystkie rzędy zostaną wypełnione żywotnymi zarodkami, ułóż je tak, aby wszystkie pojedyncze komórki były zorientowane pod kątem 45 stopni w poziomie w stosunku do igły. To znacznie ułatwi późniejsze wstrzykiwanie. Następnie, mając na sobie rękawice, użyj końcówki do pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć pięć mikrolitrów przygotowanej konstrukcji z rurki na lodzie.

Ostrożnie włóż końcówkę pipety do tylnego końca uszkodzonej rurki kapilarnej do miejsca, w którym zaczyna się zwężać, aby odczynnik znalazł się jak najbliżej końcówki i wyrzucił go do kapilary. Jeśli nadal znajdują się pęcherzyki powietrza, potrząśnij igłą, uważając, aby nie złamać końcówki. Wprowadzić igłę prosto do uchwytu igły do mikroiniekcji i ostrożnie dokręcić, aż igła pozostanie na swoim miejscu.

Następnie ustaw kąt na około 45 stopni. Po przygotowaniu i założeniu igły włącz mikroskop i zbiornik z gazem. Wyreguluj objętość wtrysku, używając około 0,5 PSI do podtrzymywania i 30 PSI do wyrzucania.

Sprawdź, czy roztwór wysuwa się z igły po naciśnięciu pedału. Za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego dostosuj objętość i przepływ roztworu do około 10 mikrometrów średnicy. Upewnij się, że ciśnienie wsteczne pozwala na wypłynięcie niewielkiej ilości roztworu z igły.

Jeśli nie ma wystarczającego ciśnienia wstecznego, działanie kapilarne spowoduje, że płyn dostanie się do igły i zniszczy mRNA. Po skalibrowaniu igły włóż igłę do pojedynczej komórki zapłodnionych zarodków, używając krawędzi nacięcia żelowego, aby zapewnić podłoże, które utrzymuje zarodek na miejscu i umożliwia igłę wywieranie nacisku bez przesuwania zarodka. Gdy końcówka igły znajdzie się w pojedynczej komórce, naciśnij pedał, aby uwolnić żądaną ilość roztworu.

Ważne jest, aby wstrzyknąć roztwór do komórki, a nie do żółtka, w celu wytworzenia transgenicznego danio pręgowanego. Powtórz ten proces dla wszystkich zarodków. Po zakończeniu użyj pipety transferowej o pojemności 3,4 mililitra i wody z systemu rybnego, aby przenieść wstrzyknięte zarodki do oznakowanego naczynia, wypłukując je z nacięcia agarozy.

Przechowuj zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby mogły się rozwijać. Sprawdzaj przez cały dzień, aby usunąć martwe zarodki ryb i zastąp wodę 0,1% błękitem metylenowym w wodzie dla ryb. Około sześciu do ośmiu godzin po wstrzyknięciu użyj 10 wstrzykniętych zarodków ryb i metody hotshot, aby przygotować genomowe DNA.

Następnego ranka użyj mikroskopu preparacyjnego ze źródłem światła fluorescencyjnego, aby posortować zarodki wykazujące GFP w tkankach innych niż żółtkowe. Zarodki te powinny zawierać wstrzyknięty konstrukt. Wykonaj test akcyzy Tol2, aby sprawdzić aktywność transpozonu, jak opisano wcześniej.

Jeśli można wykryć wycięte osocze, należy zachować wstrzyknięte zarodki ryb i wyhodować je. W przeciwnym razie powtórz proces syntezy mRNA Tol2 i mikroiniekcji, aż do uzyskania pozytywnych wyników testu akcyzowego Tol2. Aby zobrazować zarodki danio pręgowanego, krzyżowanie się ryb założycielskich pokolenia F2 z rybami typu dzikiego w indywidualnych parach.

Zbieraj zarodki ryb na różnych pożądanych etapach rozwoju zgodnie z przewodnikiem dotyczącym oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego. W przypadku zarodków ryb we wczesnym stadium w wodzie systemu rybnego, pod lunetą preparacyjną, użyj kleszczy, aby ostrożnie obrać i usunąć kosmówkę. Za pomocą pipety do usuwania zanieczyszczeń przenieś kilka zarodków do wklęsłego szkiełka podstawowego z 3% metylocelulozą.

Następnie, za pomocą igły pod lunetą do preparacji, ustaw zarodki w żądanych pozycjach, aby zobaczyć aktywność komórkowego GFP. W przypadku zarodków w stadium poniżej 12 somitów należy użyć mikroskopu złożonego epifluorescencji z kompatybilną kamerą i oprogramowaniem do obrazowania. W przypadku zarodków powyżej stadium 12 somitów należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego do preparacji.

Aby zobrazować napięcie komórek nowotworowych, najpierw zidentyfikuj ryby ze złośliwymi guzami osłonki nerwów obwodowych lub MPNST. Umieść rybę na szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów i przeprowadź obrazowanie całego mocowania. Na koniec, po obrazowaniu, wypreparuj guz przed obejrzeniem aktywności elektrycznej komórek nowotworowych.

W przypadku udanego wstrzyknięcia, ponad 50% wstrzykniętych zarodków będzie wykazywać pewien stopień GFP w komórkach somatycznych, a większość z nich wykaże dodatni wynik testu akcyzowego transpozonu Tol2. W tym przypadku badano zmiany potencjału błonowego w całym cyklu komórkowym podczas wczesnego rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. Jak widać na tym filmie poklatkowym, komórki uległy hiperpolaryzacji przed utworzeniem bruzdy rozszczepienia.

Co więcej, różne tkanki wykazywały różne potencjały błonowe w zarodkach ryb w wieku od jednego do trzech dni. Na przykład somit i sznur notologiczny były na ogół hiperspolaryzowane w porównaniu z sąsiednimi tkankami i narządami. W tym dwudniowym zarodku ryb aktywność elektryczna nerwowo-mięśniowa jest wykazywana podczas ruchu ze zmianami gęstości kolorów odpowiadającymi transdukcji sygnalizacji elektrycznej.

Zbadano właściwości bioelektryczne komórek nowotworowych w zarodkach pochodzących ze skrzyżowania ryb reporterowych ASAP1 z mutantem RPL35, który jest podatny na spontaniczne MPNST. W porównaniu z otaczającymi tkankami komórki nowotworowe były bardziej spolaryzowane. Po opanowaniu, tę technikę mikroiniekcji można wykonać w około trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zarodki danio pręgowanego powinny znajdować się w stadium jednokomórkowym, aby uzyskać idealne wyniki. Wraz z opracowaniem technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwoju i biologią komórki do badania in vivo zmian sygnalizacji elektrycznej u danio pręgowanego i innych organizmów modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć transgeniczną linię danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji.