Pobieranie i przygotowanie zarodków Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Aby wykonać zapisy elektrofizjologiczne w zarodkach Drosophila, należy je najpierw pobrać, skoordynować i wypreparować Kontrolowana sekcja jest możliwa za pomocą kleju chirurgicznego polimeryzującego wodę, który stabilizuje zarodki w celu pokrycia szkiełek. Narządy wewnętrzne są następnie usuwane ze stabilizowanych zarodków w celu odsłonięcia brzusznego OUN, nerwów obwodowych i mięśni somatycznych. Cześć, nazywam się Dave Featherstone i pracuję na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Illinois w Chicago.

Cześć, jestem Ton i pracuję w laboratorium Dave'a Featherstone'a na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Illinois w Chicago. Dzisiaj pokażemy Ci, jak zbierać i ręcznie preparować zarodki w późnym stadium rozwoju od Joof. Używamy tej procedury General lab, aby przygotować się do alternatywnych testów rozwoju i funkcji układu nerwowo-mięśniowego, które pokażę Wam w kolejnej nadchodzącej prezentacji Jo Ova.

Więc zacznijmy. Protokół ten rozpoczyna się od pobrania zarodków, powszechnej procedury stosowanej w różnych eksperymentach Joof, które teraz omówimy. Ułóż mieszankę od 20 do 40 młodych samców i samic much w doniczce nieśnej.

Umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Aby dokładnie oszacować etap rozwoju zarodka, temperatura i wilgotność powinny być spójne. Chociaż dostępne są komercyjne doniczki do układania, mogą być one zbudowane z perforowanych plastikowych zlewek o średnicy 100 mil, które pasują do 60-milimetrowych płyt ślimaka do jabłek.

Przepis na świder jabłkowy można znaleźć w pisemnym protokole. Perforacje w zlewce można wykonać za pomocą podgrzewanej sondy i powinny być mniejsze niż u dorosłych much. Płytki uzupełnia się bolusem pasty drożdżowej, która pobudzi samice do składania wielu jaj, wymieszania drożdży i wody do konsystencji masła orzechowego, a następnie rozsmarowania na talerzach szpatułką.

Zmieniaj talerz dwa razy dziennie, stukając muchami z talerza. A teraz mogę założyć nową płytkę i to może wrócić do inkubatora. Ale w międzyczasie mogłem sprawdzić, ile jaj zostało tu złożonych do trzeciego dnia.

Dobra doniczka powinna produkować od 100 do 200 jaj na godzinę, przy czym najwyższa produkcja jaj przypada między świtem a późnym rankiem. Aby uprościć zbieranie, zarysowanie lub wprowadzanie dłuta do ślimaka płytki zbierającej, w tej procedurze większość jaj zostanie złożona w zadrapaniach lub obok nich. Muchy mogą składać jaja przez jedną do dwóch godzin, więc można zbierać zarodki w późnym stadium, ale te ramy czasowe będą się różnić w zależności od eksperymentu.

Metody pobierania zarodków będą się również różnić w zależności od liczby zarodków potrzebnych do eksperymentu. Do sekcji i elektrofizjologii potrzeba stosunkowo niewielu zarodków, w takim przypadku można je delikatnie pobrać z płytek za pomocą cienkich kleszczyków. Aby usunąć zewnętrzną powłokę, spłucz zarodki wodą destylowaną i umieść je w naczyniu zawierającym świeże od 50 do 100% wybielacza każdy, monitoruj zarodki pod mikroskopem preparacyjnym.

Po 30 do 120 sekundach corion rozpuści się, odsłaniając błyszczącą, przezroczystą błonę witalną. Ponieważ wybielacz może szybko zniszczyć witalizowane tkanki, odchlorowane jaja należy krótko wypłukać lub umieścić w soli fizjologicznej. Umieść odchlorowane jaja w plastikowym naczyniu hodowlanym zawierającym wodę destylowaną.

W tym czasie można je wizualnie genotypować, sprawdzając markery GFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, a odpowiednie filtry po uporządkowaniu interesujących osób przystępują do sekcji. Ponieważ zarodki są zbyt małe, aby można je było wypreparować, wymagane jest pewne zaawansowane przygotowanie. Starsze zarodki z rozwiniętymi skórkami należy przykleić do szkiełek nakrywkowych pokrytych sogarem za pomocą cyjanoakrylowego kleju chirurgicznego lub weterynaryjnego Cyjanoakrylowy klej chirurgiczny, znany również jako histo aal.

Niebieski działa dobrze, ponieważ polimeryzuje w kontakcie z roztworem zawierającym jony dwuwartościowe. Rozpocznij sekcję od przeniesienia interesującego zarodka na szkiełko nakrywkowe pokryte cygarem pod kroplą soli fizjologicznej grzbietem do góry. Usuń życiodajną błonę, wykonując małe nacięcie w membranie za pomocą szklanej mikropipety lub igły wolframowej.

Następnie delikatnie uwolnij zarodek z błony. Zarodki we wczesnym stadium przyczepiają się bezpośrednio do czystego szkła lub szkła pokrytego poli L-lizyną. W przypadku starszych zarodków przymocuj je do szkiełek nakrywkowych pokrytych kardą, podając klej chirurgiczny przez małą szklaną pipetę przymocowaną do gumowej rurki.

Przepływ kleju jest kontrolowany przez usta. Użyj niewielkich ilości kleju, aby mocno przymocować głowę i ogon. Rób to ostrożnie, ponieważ klej szybko miesza się w soli fizjologicznej.

Aby wypreparować ustabilizowany zarodek, delikatnie przebij linię wzdłuż grzbietowej linii środkowej za pomocą szklanej elektrody lub zaostrzonej igły wolframowej. Za pomocą tego samego narzędzia wykonaj nacięcie, przecinając perforacje. Bardzo ważne jest, aby igła preparująca była zawsze pod płytkim kątem, aby uniknąć uszkodzenia brzusznej mięśni nerwowych.

Następnie usuń narządy wewnętrzne za pomocą delikatnego ssania ust ze szklanej pipety przymocowanej do gumowej rurki. Rozprowadź zarodek płasko, używając większej ilości kleju, aby przymocować boki nacięcia do szkiełka nakrywkowego. Po odkurzeniu wszystkich narządów wewnętrznych, nerwy obwodowe brzusznego OUN i mięśnie somatyczne są wystawiane do eksperymentów.

W tym momencie zarodek jest gotowy do zapisów elektrofizjologicznych lub może zostać utrwalony do immunohistochemii i późniejszej mikroskopii przy użyciu konwencjonalnych technik. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować i przeciąć późniejszy etap, aby zmiękczyć zarodki. Nakładanie kleju chirurgicznego i wycinanie zarodków będzie na początku frustrujące, ale nie ma żadnych tajemnych sztuczek.

Musisz rozwijać umiejętności motoryczne poprzez praktykę przez kilka tygodni, ale stopniowo odsetek udanych sekcji będzie rósł. Zapraszamy do obejrzenia naszego innego filmu geograficznego, który szczegółowo opisuje konfiguracje nagrywania z komórek mięśniowych i neuronów ruchowych. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.