Name: Pobieranie i przygotowanie zarodków Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Naucz się pobierać i przygotowywać zarodki Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju układu nerwowo-mięśniowego u mutantów, które nie mogą się wykluć.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.B. jest wspierany przez grant NIH GM54544.

Część 1: Sprzęt i materiały
<ol>
<li>Do wypreparowania embrionów wymagany jest dobry mikroskop stereoskopowy; sugeruje się powiększenie 40X, z okularami 25X w celu maksymalnego zwiększenia powiększenia.</li>
<li>Precyzyjne pęsety (numer 5) są niezbędne do ręcznej selekcji embrionów oraz ich dewitellinizacji.</li>
<li>Wymagany jest sprzęt do wytwarzania i modyfikowania cienkich szklanych igieł. Do preparowania niezbędne są igły z wyciągniętego szkła. W przypadku preparowania preferujemy szkło lite (jest trwalsze), lecz standardowe grubościenne rurki szklane (średnica zewnętrzna 1-1,5 mm) również sprawdzają się dobrze. Niektórzy stosują cienkie igły wolframowe, poddawane elektrolizie w kąpieli 1M NaOH przy użyciu autotransformatora o natężeniu 10+ A, aby uzyskać pożądaną ostrość. Zaostrzone igły wolframowe mają tę zaletę, że są stosunkowo odporne i trwałe. Szklane igły drążone (formowane podobnie jak elektrody do patch-clamp) są mocowane do plastikowych rurek i używane podczas preparowania do zasysania i wydmuchiwania soli fizjologicznej, a także do kontrolowanego podawania kleju. Do produkcji szklanych igieł dostępnych jest wiele rodzajów wyciągaczy do szkła. Programowalne komputerowo wyciągacze mogą być wstępnie ustawione do formowania różnych kształtów i rozmiarów. Powszechnie preferowane są modele Brown-Flaming (Sutter Instrument Co.). Do inspekcji i modyfikacji elektrod przed użyciem powinien być dostępny mikroskop złożony (obiektyw 20-40X).</li>
<li>Do kąpieli tkanek embrionalnych podczas preparowania powszechnie stosuje się dwa rodzaje roztworów: 1) sole „standardowe” (Jan i Jan, 1976a) lub „zmodyfikowane standardowe” (Broadie, 2000), oparte na roztworach powszechnie używanych do rejestracji w innych systemach bezkręgowców, oraz 2) sole „podobne do hemolimfy” (HL) (Stewart et al 1994), będące kompromisem między solą standardową a stężeniami jonów zmierzonymi w hemolimfie Drosophila. Należy zauważyć, że żadna z tych soli nie odtwarza dokładnie składu chemicznego hemolimfy in vivo (Broadie, 2000). Sól standardowa zawiera (w mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl2, 1,8 CaCl2, 72 sacharozy, 5 TES, pH 7,2. Badacze mogą również rozważyć komercyjnie dostępne sole dla owadów (np. Schneider’s Insect Media), które nie nadają się do rejestracji elektrofizjologicznej, ale najlepiej chronią kondycję odsłoniętych tkanek.</li>
</ol>
Część 2: Okresowanie embrionów i sekcja
<ol>
<li>Aby zapewnić optymalny zbiór jaj, należy utrzymywać młode (&lt;7 dni), zdrowe muchy samce i samice (20-40 osobników) w świeżych pojemnikach do składania jaj przez 2-3 dni. Pojemniki do składania jaj zazwyczaj składają się z plastikowych zlewków o pojemności 100 ml (Tri-Pour) z perforacją zapewniającą odpowiednią cyrkulację powietrza, nakrywających płytkę agarową 60 mm. Płytki agarowe zawierają sok jabłkowy lub winogronowy utwardzony agarem. Istnieje kilka receptur, ale przykładem jest następująca: 700 ml wody, 25-30 g agaru, 300 ml koncentratu soku (winogronowego lub jabłkowego), 0,5 g metyloparabenu (p-hydroksymetylobenzoesanu) i 30 g cukru. Wodę i agar należy wysterylizować w autoklawie, a p-hydroksymetylobenzoesan zagotować oddzielnie z cukrem i sokiem. Roztwory agaru i soku należy zmieszać i szybko wlać do płytek 60 mm, usuwając pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Przed zbiorem jaj muchy są karmione pastą drożdżową (7 g drożdży piekarskich w 9 ml wody przechowywanej w 4°C) na świeżych płytkach, wymienianych co najmniej dwa razy dziennie przez minimum dwa dni. Do 3. dnia odpowiednio przygotowany pojemnik powinien produkować 100-200 jaj na godzinę. Lepsze składanie jaj obserwuje się w pojemniku utrzymywanym na boku, gdy agar na płytce jest zarysowany. Wiele embrionów zostaje złożonych w rysach lub obok nich.</li>
<li>Aby zebrać dużą liczbę embrionów, należy je delikatnie przenieść z płytki agarowej do koszyczka za pomocą pędzelka. Koszyczek można wykonać z probówki wirówkowej o pojemności 15 lub 50 ml. Należy odciąć dno, pozostawiając wystarczającą powierzchnię, aby zamocować sito (siatka 70 µm) między pokrywką a górną częścią probówki. Embriony należy przepłukać dH2O i umieścić w czarce Petriego ze świeżym roztworem wybielacza w stężeniu od 50% do 100%, aby usunąć zewnętrzny chorion. Alternatywnie jaja można zbierać pojedynczo za pomocą precyzyjnej pęsety i dechlorionować, umieszczając je ręcznie w kropli wybielacza. Dechlorionacja może trwać od 30 sekund do 2 minut (świeży wybielacz działa znacznie szybciej) i powinna być monitorowana pod mikroskopem stereoskopowym. Usunięcie chorionu odsłania lśniącą, przezroczystą błonę witelinową. Dechlorionowane jaja należy krótko przepłukać lub umieścić w soli fizjologicznej, ponieważ wybielacz szybko niszczy tkanki dewitellinizowane.</li>
<li>Kluczowe jest dokładne określenie stadium rozwoju embrionów do pożądanego wieku. Zdefiniowane stadia embrionalne Drosophila (1-17; Campos-Ortega i Hartenstein, 1985) nie są użyteczne, ponieważ cały funkcjonalny rozwój nerwowo-mięśniowy zachodzi w późnym stadium 16 lub stadium 17. W związku z tym stadia embrionów określa się na podstawie godzin rozwoju w temperaturze 25°C w inkubatorze z nawilżaniem, licząc godziny po zapłodnieniu lub, co częstsze, po złożeniu jaja (AEL). W tych warunkach embriogeneza trwa 21 +/- 1 h w 25°C.</li>
<li>Jaja z czasowego zbioru (1-2 h), które osiągnęły odpowiedni wiek, są następnie oceniane pod kątem kryteriów morfologicznych. Po dokładnym przemyciu w dH2O, dechlorionowane jaja umieszcza się w plastikowej szalce hodowlanej (pod dH2O) do obserwacji. Poprawne określenie stadium można potwierdzić za pomocą kryteriów morfologicznych, wykorzystując światło odbite w mikroskopie stereoskopowym (Campos-Ortega i Hartenstein, 1985). Dojrzałe embriony w późnych stadiach (22-24 h AEL) tuż przed wykluciem są zazwyczaj rozpoznawane po segmentacji kutykuli i napuchniętych tchawicach. Embriony można również genotypować za pomocą balancerów GFP i mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami.</li>
<li>Do sekcji dechlorionowane i stadiowane embriony przytwierdza się (stroną grzbietową do góry) do szkiełka podstawowego pod kroplą soli fizjologicznej (patrz krok 1.5). Embriony usuwa się z błony witelinowej poprzez przebicie błony w pobliżu końca przedniego lub tylnego za pomocą szklanej mikropipety lub igły wolframowej, a następnie delikatnie uwalnia się embrion z błony. Przygotowując się do sekcji, embrion powinien być ułożony na szkiełku powierzchnią grzbietową do góry (sekcja grzbietowa odsłoni brzuszny układ nerwowy i układ nerwowo-mięśniowy do przeprowadzania eksperymentów. Embrion można oczywiście ułożyć w inny sposób, aby ułatwić dostęp do innych tkanek).</li>
<li>Embriony we wczesnych stadiach (&lt;16 h AEL) przylegają bezpośrednio do czystego szkła lub szkła powleczonego polilizyną (hydrobromek poli-L-lizyny; Broadie i Bate, 1993a, b). Starsze embriony (&gt;16 h AEL), po uformowaniu kutykuli, muszą zostać przyklejone, idealnie do szkiełek pokrywkowych powleczonych Sylgardem (Dow Corning). Używa się do tego chirurgicznego lub weterynaryjnego kleju cyjanoakrylowego polimeryzującego w wodzie (Broadie i Bate, 1993c, d). Klej podaje się przez małą pipetę z elektrody szklanej (końcówka o średnicy wewnętrznej 10-20 mikrometrów) przymocowaną do gumowej rurki, a przepływ kleju kontroluje się ciśnieniem ustnym. Podczas podawania kleju należy zachować ostrożność, ponieważ polimeryzuje on szybko po kontakcie z solą fizjologiczną. Należy również zauważyć, że klejenia nie można przeprowadzać w soli fizjologicznej o zerowym lub niskim stężeniu jonów dwuwartościowych, ponieważ klej wymaga jonów dwuwartościowych do polimeryzacji. Małe ilości kleju stosuje się najpierw do mocnego przymocowania głowy i ogona.</li>
<li>Po przyklejeniu końców embrionu do szkiełka, wykonuje się nacięcie wzdłuż linii środkowej grzbietu za pomocą elektrody szklanej lub zaostrzonej igły wolframowej. Ułatwia to delikatne perforowanie linii nacięcia przed wykonaniem ostatecznego cięcia. Brzegi nacięcia zostają następnie przyklejone do szkiełka za pomocą większej ilości kleju, aby delikatnie rozpłaszczyć embrion. Narządy wewnętrzne, w tym jelita, ciała tłuszczowe i opcjonalnie tchawice, są następnie usuwane poprzez odsysanie za pomocą szklanej pipety przymocowanej do gumowej rurki (Broadie i Bate 1993a-c). Embrion powinien być teraz płasko przyklejony do szkiełka, warstwą epidermy do dołu, z odsłoniętym brzusznym centralnym układem nerwowym, nerwami obwodowymi i somatyczną muskulaturą do celów eksperymentalnych.</li>
</ol>

Precyzyjne określanie stadium rozwoju embrionów jest kluczowe ze względu na szybkie dojrzewanie właściwości funkcjonalnych w przeciągu zaledwie kilku godzin. Kilka kwestii komplikuje ten proces. Po pierwsze, większość badaczy określa stadium embrionów na podstawie czasu składania jaj, jednak czas ten może się znacznie różnić w zależności od osobnika i warunków (Broadie et al. 1992). W szczególności samice na ograniczonej diecie mają tendencję do zatrzymywania zapłodnionych jaj przez dłuższy czas przed ich złożeniem. Dlat...

<table><tbody><tr><td>Klatki do zbierania embrionów</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (do szalek 60 mm; dostępne inne rozmiary)</td><td>Klatki można również wykonać samodzielnie, używając z dziurkami zlewków z trzema wlewami, jak pokazano w filmie</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Dostępny u różnych dostawców</td><td>Klej chirurgiczny lepiej przylega do szkiełek podstawkowych pokrytych sylgardem</td></tr><tr><td>Cienkie rurki szklane, średnica zewnętrzna 1,0-1,5 mm</td><td>Różni</td><td></td><td>Do wyciągania cienkich igieł szklanych do sekcji oraz rurek do aplikacji kleju</td></tr><tr><td>Rurki plastikowe, do przymocowania do pipety szklanej w celu ssania ustnego i aplikacji kleju</td><td>Tygon</td><td></td><td>Średnica wewnętrzna rurki musi odpowiadać średnicy zewnętrznej szkła.</td></tr></tbody></table>

zbieranie i przygotowywanie embrionów drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophilajest wiodącym modelem genetycznym do badania zarówno rozwoju zarodkowego, jak i funkcjonalnej neuronauki. Tradycyjnie dziedziny te są od siebie dość odizolowane, z w dużej mierze niezależnymi historiami i społecznościami naukowymi. Jednakże interfejsem między tymi zazwyczaj rozbieżnymi dziedzinami są programy rozwojowe leżące u podstaw nabywania funkcjonalnych właściwości przesyłania sygnałów elektrycznych oraz różnicowania funkcjonalnych synaps chemicznych podczas końcowych faz formowania obwodów neuronalnych. Ten interfejs jest krytycznie ważnym obszarem badań. WDrosophilate fazy rozwoju funkcjonalnego następują w okresie &lt;8 godzin (w 25°C) podczas ostatniej trzeciej części embriogenezy. Ten późny okres rozwoju był długo uważany za niepodatny na badania ze względu na odkładanie się twardej, nieprzepuszczalnej kutykuli epidermalnej. Przełomem okazało się zastosowanie wodopolimeryzującego kleju chirurgicznego, który można nakładać miejscowo na kutykulę, aby umożliwić kontrolowaną dyssekcję embrionów w późnym stadium. Dzięki cięciu wzdłużnemu na grzbiecie embrion może zostać rozłożony na płasko, co odsłania brzuszny sznur nerwowy oraz muskulaturę ściany ciała do badań eksperymentalnych. System ten był szeroko wykorzystywany do izolacji i charakterystyki mutantów genetycznych upośledzających tworzenie się synaps embrionalnych, a tym samym do odkrywania molekularnych mechanizmów sterujących specyfikacją i różnicowaniem połączeń synaptycznych oraz funkcjonalnych właściwości sygnalizacji synaptycznej.

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

*Drosophila* jest wiodącym modelem genetycznym w badaniach nad rozwojem zarodkowym oraz funkcjonalną neuronauką. Tradycyjnie dziedziny te są dość ...

Aby przeprowadzić rejestracje elektrofizjologiczne w embrionach Drosophila, muszą one zostać najpierw pobrane, skoordynowane i poddane sekcji. Kontrolowana sekcja jest możliwa dzięki zastosowaniu polimeryzującego w wodzie kleju chirurgicznego, który stabilizuje embriony na szkiełkach podstawowych. Następnie z ustabilizowanych embrionów usuwa się organy wewnętrzne, aby odsłonić brzuszny OUN, nerwy obwodowe oraz muskulaturę somatyczną. Cześć, jestem Dave Featherstone z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Illinois w Chicago.Witajcie, nazywam się Ton i pochodzę z laboratorium Dave'a Featherstone'a w Departamencie Nauk Biologicznych na University of Illinois w Chicago. Dzisiaj pokażemy wam, jak pobierać i manualnie preparować zarodki w późnym stadium rozwoju z Joof. Stosujemy tę procedurę w laboratorium ogólnym, aby przygotować się do testów elektrofizjologicznych rozwoju i funkcji układu nerwowo-mięśniowego Joof, co zaprezentuję w kolejnej prezentacji Jo Ova.Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od zbioru embrionów, czyli powszechnej procedury stosowanej w wielu eksperymentach z udziałem muszek owocówek, którą teraz omówimy. Umieść grupę od 20 do 40 młodych samców

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zbieranie i przygotowywanie Drosophila Embriów do nagrywania elektrofizjologicznego i innych procedur

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Naucz się pobierać i przygotowywać zarodki Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju układu nerwowo-mięśniowego u mutantów, które nie mogą się wykluć.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

Przeglądaj więcej filmów