Wizualizacja ekspresji białek w oparciu o CUBIC: procedura wizualizacji ekspresji białek w biopsjach skóry myszy o pełnej grubości

- Skóra jest złożonym narządem składającym się z różnych populacji komórek ułożonych w wielu warstwach. CUBIC, trójwymiarowa technika obrazowania oparta na oczyszczaniu tkanek, pomaga wizualizować wzorce ekspresji białek wewnątrz tych komórek skóry za pomocą biopsji całej skóry. Zacznij od wzięcia uśpionej myszy i usunięcia włosów z jej grzbietowej części szyi. Wytnij kawałek skóry i pokrój go na małe kawałki.

Zanurz kawałki w roztworze oczyszczającym CUBIC1 i inkubuj. Komórki skóry są nieprzezroczyste, ze względu na obecność chromoforów i lipidów, które powodują rozpraszanie światła. Substancje chemiczne zawarte w roztworze CUBIC usuwają te cząsteczki, zmniejszając w ten sposób rozpraszanie światła i sprawiając, że tkanka staje się przezroczysta.

Następnie potraktuj tkankę pożądanymi przeciwciałami pierwotnymi, które wiążą się specyficznie z docelowymi białkami wewnątrzkomórkowymi ulegającymi ekspresji w komórkach skóry. Ponadto należy leczyć fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi, które wiążą się z kompleksami białkowo-pierwszorzędowymi przeciwciałami. Przeciwbarwić tkankę barwnikiem wiążącym DNA, który barwi jądro.

Na koniec zanurz próbkę w roztworze CUBIC2. Rozwiązanie dodatkowo zmniejsza rozpraszanie światła w tkance, czyniąc ją bardziej przezroczystą do obrazowania. Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym, aby uwidocznić fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania w trójwymiarowej próbce. Poniższy protokół umożliwia wizualizację ekspresji markerów proliferacji keratynocytów w biopsjach skóry całego wierzchowca przy użyciu protokołu CABIC.

- Zacznij od użycia trymerów do zgolenia włosów z szyi myszy poddanej eutanazji, uważając, aby nie zranić skóry. Następnie odkaż skórę 70% etanolem w PBS. Następnie podnieś skórę grzbietu szyi za pomocą kleszczy i za pomocą nożyczek usuń około 1,5 na 4 centymetry powierzchni grzbietowej skóry myszy. Następnie spłaszcz skórę, stroną właściwą do dołu, na kawałku bibuły filtracyjnej, zwracając uwagę na orientację przednią i tylną próbkę i przytnij bibułę wokół wypreparowanej skóry.

- Aby uzyskać optymalne obrazowanie, próbki skóry muszą pozostać płaskie ze stałą orientacją mieszków włosowych. Aby utrzymać próbki we właściwej pozycji przednio-tylnej, mocujemy kawałki skóry na bibule filtracyjnej w biopsjach prostokątnych.

- Przenieś próbki do 15-mililitrowej probówki wypełnionej świeżo przygotowanym 4% PFA w PBS. Następnie, gdy zostaną mocno przymocowane do bibuły filtracyjnej, przenieś próbki do nowej 15-mililitrowej probówki PBS na dwa 5-minutowe płukania.

Aby usunąć biopsje skóry po drugim myciu, użyj ostrej żyletki, aby pociąć tkanki na kawałki o wymiarach około 0,2 na 0,5 centymetra, uważając, aby dłuższe boki próbek były przecięte wzdłuż kierunku przednio-tylnego próbek.

- Przecięcie dłuższego boku biopsji równolegle do orientacji mieszków włosowych pomaga również uniknąć rozległych uszkodzeń mieszków włosowych.

- Następnie zanurz biopsje w 5 mililitrach świeżo przygotowanego roztworu oczyszczającego CUBIC1 w nowej 15-mililitrowej probówce i umieść probówkę na obrotowej platformie w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kawałki tkanki staną się przezroczyste, umyj biopsje w 4 mililitrach PBS przez cztery 6-godzinne płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie 4-godzinne płukanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% wagowo sacharozy w PBS.

Pod koniec inkubacji każdą próbkę należy zamrozić w związku o optymalnej temperaturze cięcia w pojedynczych 15-mililitrowych probówkach przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek dla penetracji przeciwciał.

Następnego ranka zabarwić próbki skóry odpowiednimi przeciwciałami i ważnymi barwnikami, które Cię interesują. Następnie inkubuj próbki w 1 mililitrze świeżo przygotowanego roztworu klarującego CUBIC2 w 2-mililitrowych probówkach na wytrząsarce przez 24 godziny w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanek.

Gdy tkanki są czyste, należy umieścić biopsje wzdłuż dłuższego boku poszczególnych szkiełek szklanych w taki sposób, aby kierunek wzrostu mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Umieść jedną kroplę roztworu CUBIC2 na tkankę. Umieść dwa paski niebieskiego kleju o wymiarach 1 milimetr na 2 centymetry na szkiełku nakrywkowym. Następnie przykryj biopsję drugim szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła. Używając odpowiedniego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych, zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować obszary zainteresowania wybarwione fluorescencyjnie. Następnie uzyskaj fluorescencyjne obrazy konfokalne obszarów zainteresowania.