Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Ponieważ bakterie są tak małe, ludzie często zapominają, że są to obiekty trójwymiarowe. Nasz protokół pozwala na dokładną rekonstrukcję kształtów zarówno komórek płaskich, jak i zakrzywionych. Protokół ten wymaga jedynie niewielkich modyfikacji standardowego mikroskopu i są one łatwo dostępne w skryptach MATLAB.

Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść dwa stosy każdego z trzech szkiełek nakrywkowych o wymiarach 20 na 20 milimetrów na przeciwległych końcach pojedynczego szklanego szkiełka mikroskopowego. Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu wacików agarozowych na szkiełko podstawowe i natychmiast i stanowczo umieścić drugie szkiełko na stosie szkiełek nakrywkowych, aby spłaszczyć agarozę. Po pozostawieniu agarozy do zestalenia się przez około minutę w temperaturze pokojowej, ostrożnie zsuń z górnego szkiełka i użyj dużego końca końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyciąć z żelu pojedyncze podkładki o średnicy pięciu milimetrów.

Po uzyskaniu wszystkich elektrod, należy kilkakrotnie odpipetować hodowlę komórkową E. coli, aby rozbić wszelkie grudki komórek i zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek przed dodaniem jednego mikrolitra subkultury do każdej podkładki. Po pozostawieniu próbek do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut, upewnij się, że kropelki zostały całkowicie wchłonięte przez elektrody przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na podkładkach. Następnie za pomocą bawełnianego wacika delikatnie przetrzyj odpowiednią warstwę uszczelniającą wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, uważając, aby szczeliwo znajdowało się z dala od górnej części szkiełka nakrywkowego.

Natychmiast po uszczelnieniu szkiełka nakrywkowego umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i po pięciu minutach równoważenia termicznego użyj kół ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na środku komórki. W powiązanym oprogramowaniu mikroskopu w obszarze Akwizycja ND zaznacz pole Z, aby uzyskać stos Z, a następnie kliknij przycisk Strona główna, aby ustawić środek komórki jako punkt początkowy. Ustaw rozmiar kroku na 0,1 mikrometra, a zakres na cztery mikrometry i upewnij się, że urządzenie Z jest ustawione na piezoelektryczny stage.

Bardzo ważne jest, aby zarówno na górze, jak i na dole komórki było wystarczające rozmycie, aby komórka była prawie nie do odróżnienia od tła. Ustaw kanały fluorescencyjne pod oknem lambda na ustawienia dla obrazowanych cząsteczek fluorescencyjnych i potwierdź, że kolejność eksperymentu jest ustawiona na lambda, tak aby przed przełączeniem został uzyskany pełny stos Z w każdym kanale koloru. Następnie kliknij Uruchom teraz, aby rozpocząć pobieranie obrazu.

Po uzyskaniu wszystkich obrazów otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu. Narysuj ramkę wokół pojedynczej komórki i zduplikuj tę komórkę dwa razy, raz dla każdego kanału, upewniając się, że pole Duplikuj hiperstos jest zaznaczone, a następnie zmień kanał na jeden lub dwa. Gdy oba stosy będą dostępne, wybierz Obrazy, Stosy, Narzędzia i Konkatenuj, aby połączyć obrazy.

Z kanałem białkowym jako pierwszym, a kanałem kształtu drugim. Po zapisaniu nowego obrazu jako pliku TIFF utwórz folder w folderze na pulpicie, który zawiera przycięte obrazy i cell_shape_settings_tri. txt z exampleData_tri shae-cellshape-public

Edytuj plik cell_shape_settings_tri. txt, aby mieć poprawne ustawienia dla interesującego Cię eksperymentu. I uruchom funkcję Cell_shape_detector3dConvTriFolder z ciągiem do lokalizacji folderu, a następnie numerem komórki, od której należy zacząć, oraz liczbą komórek, które powinny zostać uruchomione.

Aby potwierdzić, że komórki zostały poprawnie zrekonstruowane, uruchom ScreenFits. Po otwarciu graficznego interfejsu użytkownika kliknij przycisk Wybierz folder i wybierz folder z plikami danych rekonstrukcji, aby wizualnie wyświetlić rekonstrukcje poszczególnych komórek. Dla każdej komórki, która wydaje się zniekształcona lub nie ma pełnego pokrycia, zaznacz pole obok rekonstrukcji, aby dołączyć FLAG do nazwy, aby można było wykluczyć ją z dalszej analizy.

Uruchom enrichmentSmothingSpline, aby utworzyć profil wzbogacenia względnego stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w funkcji krzywizny Gaussa na powierzchni. Następnie wybierz każdy folder z właśnie utworzonym TRI. i wybierz nowo utworzony plik maty krzywej.

Ta metoda jest szczególnie przydatna w przypadku komórek zakrzywionych lub o nietypowych kształtach, ponieważ reprezentacja 2D nie może dokładnie odzwierciedlić krzywizny komórek. W tym eksperymencie wygenerowano zielone fluorescencyjne białko fuzyjne z bakteryjnym białkiem aktyny MreB w celu zbadania dokładnej lokalizacji białka aktyny zarówno w dzikich, jak i zmutowanych komórkach E. coli. Wykonując te pomiary na obrazach przechwyconych w 3D, można było zrekonstruować kształty zarówno komórek dzikich, jak i zmutowanych komórek rodZ.

Lokalizacja MreB została następnie określona jako wzbogacona przy małych krzywiznach Gaussa, co jest cechą geometryczną, którą można zmierzyć tylko w 3D w sposób zależny od rodZ. Pamiętaj, aby upewnić się, że stos Z jest wystarczająco duży, aby komórki były rozmyte na górze i na dole oraz aby komórki były dobrze oddalone od siebie. Pokazujemy, jak zmierzyć geometryczną lokalizację białek w 3D, ale na podstawie tych danych można obliczyć inne informacje, takie jak rozmiar zespołów białek znaczników.