Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek
29 października 2019
Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.
Ponieważ bakterie są tak małe, ludzie często zapominają, że są to obiekty trójwymiarowe. Nasz protokół pozwala na dokładną rekonstrukcję kształtów zarówno komórek płaskich, jak i zakrzywionych. Protokół ten wymaga jedynie niewielkich modyfikacji standardowego mikroskopu i są one łatwo dostępne w skryptach MATLAB.
Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść dwa stosy każdego z trzech szkiełek nakrywkowych o wymiarach 20 na 20 milimetrów na przeciwległych końcach pojedynczego szklanego szkiełka mikroskopowego. Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu wacików agarozowych na szkiełko podstawowe i natychmiast i stanowczo umieścić drugie szkiełko na stosie szkiełek nakrywkowych, aby spłaszczyć agarozę. Po pozostawieniu agarozy do zestalenia się przez około minutę w temperaturze pokojowej, ostrożnie zsuń z górnego szkiełka i użyj dużego końca końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby wyciąć z żelu pojedyncze podkładki o średnicy pięciu milimetrów.
Po uzyskaniu wszystkich elektrod, należy kilkakrotnie odpipetować hodowlę komórkową E. coli, aby rozbić wszelkie grudki komórek i zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek przed dodaniem jednego mikrolitra subkultury do każdej podkładki. Po pozostawieniu próbek do wyschnięcia na powietrzu przez pięć do 10 minut, upewnij się, że kropelki zostały całkowicie wchłonięte przez elektrody przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na podkładkach. Następnie za pomocą bawełnianego wacika delikatnie przetrzyj odpowiednią warstwę uszczelniającą wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, uważając, aby szczeliwo znajdowało się z dala od górnej części szkiełka nakrywkowego.
Natychmiast po uszczelnieniu szkiełka nakrywkowego umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i po pięciu minutach równoważenia termicznego użyj kół ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na środku komórki. W powiązanym oprogramowaniu mikroskopu w obszarze Akwizycja ND zaznacz pole Z, aby uzyskać stos Z, a następnie kliknij przycisk Strona główna, aby ustawić środek komórki jako punkt początkowy. Ustaw rozmiar kroku na 0,1 mikrometra, a zakres na cztery mikrometry i upewnij się, że urządzenie Z jest ustawione na piezoelektryczny stage.
Bardzo ważne jest, aby zarówno na górze, jak i na dole komórki było wystarczające rozmycie, aby komórka była prawie nie do odróżnienia od tła. Ustaw kanały fluorescencyjne pod oknem lambda na ustawienia dla obrazowanych cząsteczek fluorescencyjnych i potwierdź, że kolejność eksperymentu jest ustawiona na lambda, tak aby przed przełączeniem został uzyskany pełny stos Z w każdym kanale koloru. Następnie kliknij Uruchom teraz, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
Po uzyskaniu wszystkich obrazów otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu. Narysuj ramkę wokół pojedynczej komórki i zduplikuj tę komórkę dwa razy, raz dla każdego kanału, upewniając się, że pole Duplikuj hiperstos jest zaznaczone, a następnie zmień kanał na jeden lub dwa. Gdy oba stosy będą dostępne, wybierz Obrazy, Stosy, Narzędzia i Konkatenuj, aby połączyć obrazy.
Z kanałem białkowym jako pierwszym, a kanałem kształtu drugim. Po zapisaniu nowego obrazu jako pliku TIFF utwórz folder w folderze na pulpicie, który zawiera przycięte obrazy i cell_shape_settings_tri. txt z exampleData_tri shae-cellshape-public
Edytuj plik cell_shape_settings_tri. txt, aby mieć poprawne ustawienia dla interesującego Cię eksperymentu. I uruchom funkcję Cell_shape_detector3dConvTriFolder z ciągiem do lokalizacji folderu, a następnie numerem komórki, od której należy zacząć, oraz liczbą komórek, które powinny zostać uruchomione.
Aby potwierdzić, że komórki zostały poprawnie zrekonstruowane, uruchom ScreenFits. Po otwarciu graficznego interfejsu użytkownika kliknij przycisk Wybierz folder i wybierz folder z plikami danych rekonstrukcji, aby wizualnie wyświetlić rekonstrukcje poszczególnych komórek. Dla każdej komórki, która wydaje się zniekształcona lub nie ma pełnego pokrycia, zaznacz pole obok rekonstrukcji, aby dołączyć FLAG do nazwy, aby można było wykluczyć ją z dalszej analizy.
Uruchom enrichmentSmothingSpline, aby utworzyć profil wzbogacenia względnego stężenia białka będącego przedmiotem zainteresowania w funkcji krzywizny Gaussa na powierzchni. Następnie wybierz każdy folder z właśnie utworzonym TRI. i wybierz nowo utworzony plik maty krzywej.
Ta metoda jest szczególnie przydatna w przypadku komórek zakrzywionych lub o nietypowych kształtach, ponieważ reprezentacja 2D nie może dokładnie odzwierciedlić krzywizny komórek. W tym eksperymencie wygenerowano zielone fluorescencyjne białko fuzyjne z bakteryjnym białkiem aktyny MreB w celu zbadania dokładnej lokalizacji białka aktyny zarówno w dzikich, jak i zmutowanych komórkach E. coli. Wykonując te pomiary na obrazach przechwyconych w 3D, można było zrekonstruować kształty zarówno komórek dzikich, jak i zmutowanych komórek rodZ.
Lokalizacja MreB została następnie określona jako wzbogacona przy małych krzywiznach Gaussa, co jest cechą geometryczną, którą można zmierzyć tylko w 3D w sposób zależny od rodZ. Pamiętaj, aby upewnić się, że stos Z jest wystarczająco duży, aby komórki były rozmyte na górze i na dole oraz aby komórki były dobrze oddalone od siebie. Pokazujemy, jak zmierzyć geometryczną lokalizację białek w 3D, ale na podstawie tych danych można obliczyć inne informacje, takie jak rozmiar zespołów białek znaczników.
Przegląd
Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakteryjne do żywego, trójwymiarowego obrazowania oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów. Metoda ta umożliwia dokładne wizualizowanie zarówno płaskich, jak i zakrzywionych komórek bakteryjnych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Bakteria są trójwymiarowymi obiektami, jednak często badane w dwóch wymiarach.
- Dokładna rekonstrukcja kształtu jest istotna dla zrozumienia morfologii bakterii.
- Ten protokół wykorzystuje standardowe sprzęt mikroskopiczny z modyfikacjami.
- Białka fluorescencyjne mogą być użyte do wizualizowania określonych składników komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie metody rekonstrukcji 3D kształtów E. coli.
- Badanie lokalizacji białek w komórkach bakteryjnych.
- Zgłębienie rozumienia morfologii komórek bakteryjnych.
Stosowane metody
- Przygotowanie podkładek agarozowych do zamontowania próbek bakteryjnych.
- Użycie mikroskopu do uzyskania Z stacków obrazów.
- Analiza obrazów w celu zrekonstruowania kształtów komórek na podstawie uzyskanych obrazów.
- Zastosowanie skryptów MATLAB do przetwarzania i analizy danych.
Główne wyniki
- Skuteczna rekonstrukcja 3D kształtów komórek E. coli typu dzikiego i mutantów.
- Lokalizacja białka MreB była wzbogacona w małych krzywiznach Gaussa.
- Metoda skutecznie uchwytuje złożoność zakrzywionych kształtów bakteryjnych.
- Wykazano znaczenie 3D obrazowania w badaniu morfologii bakterii.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę 3D obrazowania bakterii.
- Umożliwia szczegółową analizę lokalizacji białek w odniesieniu do kształtu komórki.
- To podejście może być zastosowane do różnych badań dotyczących morfologii bakterii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of bacterial cell shape and protein localization addresses a critical gap in microbiology research where 2D imaging obscures morphological and spatial functional relationships. This capability enables mechanistic de-risking in target validation by linking protein behavior to geometric cell features such as Gaussian curvature, which cannot be resolved in 2D. The method supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, spatially resolved data on protein distribution in native-like cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating protein localization with 3D cell shape parameters like Gaussian curvature.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target proteins in physiologically relevant cellular morphologies.
- Predictive Value: Improves target confidence by revealing spatial regulation of proteins in native 3D cellular environments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D shape and protein enrichment profiles suitable for high-content screening applications.
- Reproducibility: Uses standardized Z-stack acquisition and MATLAB-based processing to ensure consistent shape reconstruction across experiments.
- Scalability: Compatible with common fluorescent microscopes and adaptable to multiple bacterial species and mutants, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing spatially resolved protein localization data that informs functional studies in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein phenotypes are shape-dependent, reducing false positives in target validation.
- Biomarker Alignment: Enables identification of curvature-associated protein patterns that may serve as translational biomarkers in morphologically distinct bacterial states.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification and preclinical evaluation through mechanistically informed protein localization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking protein localization to 3D morphological features, clarifying functional relationships in cellular pathways.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative outputs including Gaussian curvature maps and protein enrichment profiles for comparative condition analysis.
- Analytics: Delivers shape-based protein enrichment curves that allow teams to quantify spatial dependencies and compare genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing spatially resolved data that can validate target engagement in morphologically relevant bacterial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability applicable across multiple projects studying bacterial morphology and protein function.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling precise protein localization in 3D, improving target validation accuracy.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sample preparation, Z-stack acquisition, and automated MATLAB-based reconstruction.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether protein localization is shape-dependent, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on spatially validated functional data in native cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and MATLAB-based computational processing.
- Needs access to a fluorescent microscope with piezo stage capability and sufficient computational resources for 3D reconstruction.
- Demands standardization of sample preparation, Z-stack parameters, and image processing workflows across teams.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different bacterial species, shapes, or fluorescent labels.
- Limited by the computational intensity of 3D reconstruction, though high-throughput resources are recommended rather than required.
