Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu
4 sierpnia 2016
Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja proliferacji komórek i wzorców ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki w trzech wymiarach oraz dokładna ocena anatomii i patologii skóry. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolują rozwój i regenerację naskórka oraz jak te mechanizmy są zaburzone podczas chorób skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to technicznie prosty protokół wizualizacji pojedynczych komórek w biopsjach skóry o pełnej grubości w trzech wymiarach z niespotykaną dotąd dokładnością.
Metoda ułatwia również badanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą w pełnych próbkach skóry. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć pewne trudności z przygotowaniem małych biopsji płaskiej skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych. Procedurę zademonstruje Betty Maclarios, doktorantka na Zakładzie Dermatologii Rozwojowej i Regeneracyjnej w UNSW Australia.
Zacznij od użycia trymerów do zgolenia włosów z szyi myszy poddanej eutanazji, uważając, aby nie zranić skóry. Następnie odkaż skórę za pomocą 70% etanolu i PBS. Następnie podnieś skórę grzbietu szyi za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby usunąć około 1,5 na 4 cm obszar grzbietowej skóry myszy.
Następnie spłaszcz skórę właściwą stroną do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej, zwracając uwagę na przednią tylną orientację próbki i przytnij bibułę wokół wypreparowanej skóry. Aby uzyskać optymalne obrazowanie, próbki skóry muszą pozostać płaskie ze stałą orientacją mieszków włosowych. Aby utrzymać próbki we właściwej przedniej tylnej pozycji, mocujemy kawałki skóry na bibule filtracyjnej w biopsjach prostokątnych.
Przenieść próbki do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej świeżo przygotowanymi 4% PFA i PBS. Następnie, gdy zostaną mocno przymocowane do bibuły filtracyjnej, przenieś próbki do nowej probówki PBS o pojemności 15 ml na dwa pięciominutowe płukania. Aby oczyścić biopsje skóry, po drugim umyciu użyj ostrej żyletki, aby pociąć tkanki na kawałki o wymiarach około 0,2 na 0,5 cm, uważając, aby dłuższe boki próbek zostały przecięte wzdłuż przedniej tylnej strony próbek.
Cięcie wzdłuż boku biopsji równolegle do orientacji mieszków włosowych pomaga również uniknąć rozległego uszkodzenia mieszków włosowych. Zanurzają biopsje w 5 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w nowej probówce o pojemności 15 ml i umieszczają probówkę na obrotowej platformie w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kawałki tkanek staną się przezroczyste, umyj biopsje w 4 ml PBS przez cztery sześciogodzinne płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie czterogodzinne mycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% wagowo sacharozy i PBS.
Pod koniec inkubacji zamrozić każdą próbkę w związku o optymalnej temperaturze cięcia w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek dla przenikania przeciwciał. Następnego ranka zabarwić próbki skóry odpowiednimi przeciwciałami i interesującymi ich barwnikami. Następnie inkubować próbki w 1 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w probówkach o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanek.
Gdy tkanki są czyste, należy umieścić biopsje wzdłuż dłuższego boku poszczególnych szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kierunek wzrostu mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Umieść jedną kroplę roztworu sześciennego dwa na chusteczce. Umieścić dwa paski niebieskiego kleju o wymiarach 1 ml na 2 cm na szkiełku nakrywkowym, a następnie przykryć biopsję drugim szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła. Korzystając z odpowiedniego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych, zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować fluorescencyjnie zabarwione obszary zainteresowania, a następnie uzyskaj fluorescencyjne obrazy konfokalne obszarów zainteresowania. Za pomocą tej metody można oczyścić biopsje grzbietowej skóry dorosłych myszy typu dzikiego o dowolnej grubości i wybarwić przeciwciałem przeciwko podstawnemu markerowi keratynocytów keratynie 14.
Jądra Dappy dodatnie są widoczne w całej próbce i pozwalają docenić niektóre cechy anatomiczne, takie jak brodawki skórne. Zabarwienie K14 jest widoczne w warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowowego o grubości jednej komórki. Zarysowanie gruczołów łojowych i zewnętrznych osłonek korzeniowych mieszków włosowych oraz wtórnych zarodków włosa, przy czym w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych wykryto tylko niski poziom ekspresji K14.
Aby uwidocznić proliferujące komórki, biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości przy telogenie dorosłych myszy typu dzikiego można wyjaśnić i wybarwić, jak wykazano, ujawniając obecność proliferujących keratynocytów w naskórku podstawnym międzymieszkowym i w przesmyku, ale nie w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych. Aby uwidocznić gruczoły łojowe, można oczyścić i wybarwić biopsje grzbietowe skóry o pełnej grubości przy antygenie dorosłych myszy typu dzikiego, co ułatwia wykrywanie gruczołów łojowych w obszarze przesmyku mieszków włosowych. Aby uwidocznić zmiany morfologiczne w naskórku i zwierzętach transgenicznych, można wyjaśnić i wybarwić biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości, odsłaniając przerost naskórka międzymieszkowego i nieprawidłowe mieszki włosowe z masami komórkowymi znakowanymi K14 rozciągającymi się proksymalnie do skóry właściwej, reprezentującymi powiększone populacje transgenicznych komórek macierzystych.
Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić próbki skóry oraz jak wizualizować wzorce ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w trzech wymiarach. Ta metoda jest prosta do wykonania i wykorzystuje stosunkowo bezpieczne i niedrogie odczynniki. W przyszłości więcej przeciwciał zostanie przetestowanych pod kątem ich kompatybilności z tą metodą, co pozwoli na rozszerzenie tej analizy w celu wizualizacji większej liczby białek i niektórych rodzajów zainteresowania.
Inne metody obrazowania, takie jak mikroskopia świetlna, mogą być wykonywane w celu wizualizacji anatomii skóry i wzorców ekspresji białek w większych próbkach skóry w trzech wymiarach. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie dermatologii do zbadania interakcji komórkowych i molekularnych między skórą właściwą a naskórkiem w homeostazie skóry, w genetycznie zmodyfikowanych modelach myszy oraz w jednym z naszych modeli chorób skóry.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy raport opisuje protokół CUBIC służący do przejrzyszczania pełnowarstwowych biopsji skóry myszy, co umożliwia wizualizację wzorców ekspresji białek oraz proliferujących komórek w 3D z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta ułatwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry, szczególnie w przypadku genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Dermatologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych w rozwoju naskórka.
- Badanie chorób skóry i procesów regeneracji.
- Znaczenie dokładnej analizy biopsji skóry.
- Wyzwania w przygotowaniu próbek skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych.
Cel badania
- Wizualizacja proliferacji komórek i ekspresji białek w 3D.
- Dokładna ocena anatomii i patologii skóry.
- Badanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą.
Zastosowane metody
- Protokół CUBIC do klarowania tkanek.
- Techniki wizualizacji 3D.
- Analiza z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Biopsje skóry o pełnej grubości z modeli mysich.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja pojedynczych komórek w biopsjach skóry.
- Lepsze zrozumienie wzorców ekspresji białek.
- Wgląd w nieprawidłowe fenotypy naskórka.
- Usprawnienie badań nad chorobami skóry.
Wnioski
- Protokół CUBIC jest prostą, a zarazem skuteczną metodą analizy skóry.
- Zapewnia on niespotykaną dotąd dokładność w wizualizacji interakcji komórek skóry.
- Technika ta może przyczynić się do postępów w badaniach nad dermatologią i medycyną regeneracyjną.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Protokół CUBIC umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację 3D ekspresji białek i dynamiki komórkowej w pełnowarstwowych biopsjach skóry, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów terapeutycznych w dermatologii. Dostarczając dane o rozdzielczości pojedynczych komórek w odniesieniu do populacji komórek macierzystych i progenitorowych naskórka oraz ich interakcji z skórą właściwą, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach regeneracji i chorób skóry. Zdolność ta pomaga w ustalaniu priorytetów dla hipotez terapeutycznych i zmniejsza niejednoznaczność biologiczną we wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki podstawowych komórek macierzystych i progenitorowych naskórka wykazujących ekspresję K14 w nienaruszonej architekturze tkankowej.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie przestrzenne proliferacji (Ki67) i różnicowania sebocytów (Nile Red) w modelach modyfikowanych genetycznie.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację nieprawidłowych fenotypów naskórka i oddziaływań stromalnych w 3D, bez artefaktów związanych z sekcjonowaniem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej standaryzacji testów poprzez zachowanie architektury naskórkowo-skórnej oraz integralności przydatków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników ilościowych dla ekspresji białek i proliferacji komórek w różnych warunkach, co wspiera skalowalność analiz.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość do badań przesiewowych, zapewniając przejrzystą, nienaruszoną platformę tkankową do wiarygodnej oceny wpływu związków chemicznych lub perturbacji genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na zachowanie integralności systemu istotnego dla przebiegu choroby poprzez wizualizację hiperplazji, nieprawidłowej morfologii mieszków włosowych oraz ekspansji masy komórek macierzystych w modelach transgenicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez analizę korelacyjną markerów K14, Ki67 i sebocytów z efektami fenotypowymi.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając wglądu w mechanizmy interakcji naskórkowo-skórnych podczas homeostazy oraz zaburzeń.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celu po walidację przedkliniczną – umożliwiając iteracyjną ocenę biologicznych odpowiedzi specyficznych dla skóry.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez rozdzielenie przestrzennych wzorców ekspresji keratynocytów, komórek proliferujących oraz sebocytów w nienaruszonej skórze.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność analiz dzięki standaryzowanemu przejaśnianiu i barwieniu biopsji o pełnej grubości z zachowaniem spójnej orientacji mieszków włosowych.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty 3D dotyczące ekspresji białek i gęstości komórek, co umożliwia porównywanie różnych warunków i ranking celów terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowanie istotnych dla choroby struktur naskórka i skóry właściwej do analiz podłużnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę przetwarzania tkanek, możliwą do zastosowania w modelach skóry typu dzikiego, mutantów oraz modeli indukowanych leczeniem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach regeneracji naskórka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki prostemu, opartemu na rozpuszczalnikach protokołowi klarowania, kompatybilnemu z konwencjonalną mikroskopią konfokalną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania efektów celowanych i poza-celowych w naskórku w modelach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając danych mechanistycznych na temat dynamiki komórek macierzystych i funkcji gruczołów łojowych w kontekstach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu tkanek i barwieniu immunofluorescencyjnym w celu zachowania przydatków naskórka podczas przygotowania biopsji.
- Zależy od dostępu do pieca do hybrydyzacji, platformy rotacyjnej oraz mikroskopu konfokalnego ze standardowymi filtrami epifluorescencyjnymi do obrazowania 3D.
- Wymaga standaryzacji orientacji biopsji i czasu przejrzyszczania między zespołami w celu zapewnienia spójnego dopasowania współczynnika załamania światła i jakości obrazowania.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu protokołu w przypadku grubszych eksplantatów ludzkiej skóry lub alternatywnych modeli ssaków ze względu na zawartość lipidów i kolagenu.
- Wiąże się z ograniczeniami praktycznymi dotyczącymi czasu trwania etapów przejrzyszczania i płukania, co może wydłużyć harmonogram w zastosowaniach do wysokoprzepustowych przesiewów.
