Name: Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj protokół CUBIC do wizualizacji ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych myszy. Ta metoda umożliwia dokładną analizę anatomii i patologii skóry w 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Australijskim Zasobom Biologicznym (Garvan Institute, Australia), Centrum Zasobów Biologicznych (UNSW Australia) oraz Komitetowi ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki za wsparcie w eksperymentach na zwierzętach. Prace te były wspierane przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (Project Grant APP1062720). Dr Cesar P. Canales jest stypendystą stypendium CONICYT-Becas Chile (#72101076). Pan Bassem Akladios jest laureatem University International Postgraduate Award przyznawanej przez UNSW Australia.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki (ACEC) w UNSW Australia zgodnie z zatwierdzonym protokołem ACEC 13/64B.
1. Przygotowanie przezroczystej tkanki skóry myszy
Uwaga: Wszystkie myszy użyte w tym badaniu miały podłoże genetyczne C57BL/6
<ol>
	<li>Pobieranie tkanki skórnej myszy.
	<ol>
		<li>Humanitarna eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Ostrożnie usuń włosy z odpowiedniego obszaru skóry za pomocą trymera, uważając, aby nie zranić skóry.</li>
		<li>Umyj skórę w celu odkażenia 70% etanolem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Podnieś skórę szyi grzbietowej za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami.</li>
		<li>Wypreparuj duży obszar grzbietowej skóry myszy (około 1,5 x 4 cm).</li>
		<li>Spłaszczyć skórę skórną do dołu na bibule filtracyjnej i zwrócić uwagę na orientację przednią i tylną próbki.</li>
		<li>Przyciąć bibułę filtracyjną wokół rozciętej skóry i umieścić w 15 ml probówce wypełnionej świeżo przygotowanym 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) w PBS.</li>
		<li>Utrwal na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Myć skórę 2 x 5 min w PBS w probówce o pojemności 15 ml. 
		Uwaga: Poniższe czynności (1.1.10 - 1.1.12) są opcjonalnymi krokami długotrwałego przechowywania tkanki.</li>
		<li>Odwodnić wypreparowaną skórę w PBS ze zwiększonym stężeniem etanolu (25%, 50%, 70%) w tubce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnego mycia w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwodnioną skórę należy przechowywać w 70% etanolu w PBS w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Na 4 godziny przed oczyszczeniem należy nawodnić tkankę skórną w PBS ze zmniejszającym się stężeniem etanolu (70%, 50%, 25%, 0%) w probówce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnych etapów mycia w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie biopsji skóry myszy
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór czyszczący CUBIC1, rozpuszczając 3,85 g mocznika i 3,85 g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy w 5,38 ml wody destylowanej na podgrzewaczu ustawionym na 60 - 70 °C. Użyj gorącego mieszadła.</li>
		<li>Dodać 2,31 g eteru mono-p-izooktylofenylowego glikolu polietylenowego/Triton X-100 do roztworu, gdy będzie klarowny i ostygnie do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Przeciąć skórę myszy ostrą żyletką do biopsji o przybliżonych wymiarach 0,2 x 0,5 cm i zanurzyć w 5 ml roztworu oczyszczającego CUBIC1 w probówce o pojemności 15 ml. Aby zoptymalizować wizualizację mieszków włosowych, należy upewnić się, że dłuższy bok biopsji jest przecięty wzdłuż przednio-tylnego kierunku próbki.</li>
		<li>Umieścić na obrotowej platformie w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zmień roztwór czyszczący po 7 dniach. Przed użyciem należy przygotować świeży roztwór CUBIC1.</li>
		<li>Sprawdź przezroczystość tkanki po 7 dniach. W razie potrzeby należy pozostawić biopsje w roztworze oczyszczającym CUBIC1, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta.</li>
		<li>Gdy biopsja skóry stanie się przezroczysta, należy usunąć roztwór CUBIC1 i dodać 4 ml 1× PBS, aby przemyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyć tkankę skóry w 20% w/v sacharozy w PBS w probówce o pojemności 15 ml przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zamrozić tkankę w podłożu montażowym Optymalna temperatura cięcia (OCT) Związek w probówce o pojemności 15 ml przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
		Uwaga: Ten krok zwiększy przepuszczalność biopsji dla penetracji przeciwciał w kolejnych krokach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Rozmrozić tkankę od 1.2.9) do temperatury pokojowej przez 2 - 3 godziny.</li>
	<li>Umyj chusteczkę w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml PBS przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, aby usunąć związek OCT.</li>
	<li>Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml i inkubować tkankę w 1 ml króliczego przeciwciała anty-keratynowego14 lub króliczego przeciwciała anty-Ki67, oba rozcieńczone w stosunku 1:100 w PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść biopsję do probówki o pojemności 15 ml i myć tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml przeciwciała drugorzędowego anty-królika Alexa594 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PBST i inkubować przez 3 dni na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść biopsje do probówki o pojemności 15 ml i umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) (1:1,000) jądrowego roztworu barwnika jądrowego w PBST i inkubować przez noc na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwbarwiący DAPI i dodać 1 ml PBST do probówki o pojemności 2 ml, aby umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje można przechowywać w ciemności w 1x PBS z 0,02% azydkiem sodu przez co najmniej 3 tygodnie.</li>
</ol>
3. Czerwone zabarwienie Nilu
<ol>
	<li>Rozpuścić proszek czerwieni nilowej w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 1 mg/ml</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu czerwieni nilowej do 1 ml PBS do końcowego stężenia 1 μg/ml.</li>
	<li>Rozmrażać tkanki z 1.2.9) do temperatury pokojowej przez 2 - 3 godziny i myć 5 ml PBS przez 8 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś biopsje do probówki o pojemności 2 ml i zanurz tkankę w 1 ml roztworu barwiącego czerwienią nilową na 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć biopsje skóry w probówce o pojemności 2 ml z 1 ml PBST 4 razy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór PBST z probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu do barwienia jądrowego DAPI (1:1 000) w PBST i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór przeciwbarwiący DAPI i dodaj 1 ml PBST do probówki o pojemności 2 ml, aby umyć tkankę skóry 4 razy przez 6 godzin w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje można przechowywać w ciemności w 1x PBS z 0,02% azydkiem sodu przez co najmniej 3 tygodnie.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór czyszczący CUBIC2, który zawiera 50% (m/v) sacharozy, 25% (w/v) mocznika, 10% (w/v) 2,2′,2′'-nitrylotriotrietanolu i 0,1% (v/v) Triton X-100.</li>
	<li>Inkubować tkankę skórną w 1 ml roztworu CUBIC2 w probówce o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 °C. Ten krok wyrówna współczynnik załamania światła tkanki.</li>
	<li>Sprawdź przejrzystość tkanki. Gdy jest czysty, umieść całą biopsję skóry (0,2 x 0,5 cm) na dłuższym boku na szklanym szkiełku nakrywkowym, tak aby kierunek długości mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego (#1 24 x 60 mm) 
	Uwaga: Krok opcjonalny: Biopsje barwione przeciwciałami można przechowywać w roztworze CUBIC2 przez około 7 dni. Biopsje zabarwione czerwienią nilową mogą być przechowywane w roztworze CUBIC2 tylko przez okres do 1 dnia i powinny być zobrazowane tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Przygotować komorę obrazowania (rysunek 1) 
	Uwaga: Materiały eksploatacyjne wymagane do przygotowania komory obrazowania to: niebieska tacka, ciastolina lub podobna oraz 2 szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) (Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Przygotować dwa cienkie paski niebieskiego kleju (średnica około 1 mm x 2 cm) i dwa szkiełka nakrywkowe (ryc. 1B).</li>
		<li>Umieść niebieskie paski przyklejające się na jednym szkiełku nakrywkowym, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na biopsję skóry (Rysunek 1C). 4.4.3)</li>
		<li>Umieścić biopsję skóry między paskami na szkiełku nakrywkowym w kropli roztworu CUBIC2 (ryc. 1C).</li>
		<li>Pokryj biopsję skóry drugim szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść komorę obrazowania z zamontowaną biopsją skóry na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę do ścieżki świetlnej.</li>
	<li>Zeskanuj próbkę za pomocą rtęciowego lub halogenowego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych (np. DAPI/GFP/CY3/CY5) w celu zidentyfikowania obszarów zainteresowania wybarwionych fluorescencyjnie.</li>
	<li>Obrazuj obszary zainteresowania za pomocą obiektywu 10X i 20X (NA 0,75) i standardowych technik obrazowania fluorescencji konfokalnej (np. w przypadku próbek barwionych DAPI oświetlaj laserem 405 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 425 - 475 nm, a w przypadku Alexa Fluor 594 lub próbek barwionych czerwienią Nilową oświetlaj laserem 561 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 570 - 620 nm).</li>
	<li>Generuj stosy obrazów Z każdego obszaru zainteresowania za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów ze stosu Z mikroskopu (np. za pomocą oprogramowania do obrazowania elementów NIS 4.13, jak opisano poniżej).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wybrano optymalną moc lasera i ustawienia PMT HV/Offset, aby zebrać fluorescencję próbki.</li>
		<li>Otwórz pasek narzędzi "ND Acquisition" z "Acquisition Controls".</li>
		<li>Wybierz zakładkę "Ustawienia serii Z" (upewnij się, że wszystkie inne karty są odznaczone).</li>
		<li>Podczas skanowania na żywo ustaw ostrość na górze próbki i naciśnij przycisk "Góra".</li>
		<li>Ustaw ostrość na dole próbki i naciśnij przycisk "Dół".</li>
		<li>Wprowadź wymagany rozmiar kroku (lub naciśnij przycisk zoptymalizowanego rozmiaru kroku).</li>
		<li>Naciśnij przycisk "Uruchom teraz".</li>
		<li>Zapisywanie wynikowych stosów obrazów Z jako indywidualnych stosów obrazów TIFF (1 fluorochrom na stos obrazów Z).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj stosów Z-stacks obrazu, aby zrekonstruować interesujące obszary objętości 3D za pomocą oprogramowania do analizy 3D (np. przy użyciu Imaris x64 7.2.3, jak opisano poniżej).
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do analizy.</li>
		<li>Wybierz przycisk "Prześcignij" na pasku narzędzi, aby wygenerować objętość 3D.</li>
		<li>Otwórz pierwszy kolorowy obraz Z-stack (np. DAPI).</li>
		<li>Użyj narzędzia "dodaj kanał", aby dodać dodatkowe kanały kolorów, po jednym kanale na fluorochrom. Tak więc próbka zawierająca zarówno fluorochromy DAPI, jak i Alexa Fluor 594 będzie wymagała dwóch kanałów.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Właściwości obrazu", aby ustawić prawidłowe wymiary pikseli (woksela) (XYZ), jak określono w punkcie 4.7 powyżej.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Regulacja wyświetlania", aby zmienić kolory kanałów w razie potrzeby (np. ustaw kanał DAPI na niebieski, kanał Alexa Fluor 594 na czerwony).</li>
		<li>Aby ustawić wolumin 3D w oknie obrazu, użyj myszy komputerowej, aby kliknąć i przeciągnąć wolumin zgodnie z wymaganiami.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Migawka" na pasku narzędzi, aby wygenerować zrzuty ekranu obrazu 3D.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Animacja" na pasku narzędzi, aby wygenerować filmy z obracaniem próbki 3D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
<li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li>
<li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secret+life+of+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li>
<li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+skin+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+controls+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li>
<li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li>
<li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Kinet%22%5BJournal%5D)">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li>
<li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li>
<li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mechanizmy regulacyjne kontrolujące rozwój i homeostazę skóry są najczęściej badane w 2D przy użyciu sekcji tkanek i barwienia histologicznego lub znakowania przeciwciałami, co umożliwia jedynie ograniczoną ocenę morfologii skóry, populacji komórek lub ekspresji białek. Opracowano szereg metod poprawiających wizualizację organizacji przestrzennej komórek i białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3 wymiarach w całych wierzchowcach naskórka10-13. Niektóre z nich wiążą się jednak z oddzieleniem naskórka od ...

Skóra jest niezbędna dla naszego przetrwania. Składa się z trzech głównych warstw: zewnętrznego naskórka, skóry właściwej i tkanki podskórnej. Naskórek jest tkanką silnie regenerującą. Jest to płaskonabłonkowy nabłonek warstwowy, składający się głównie z keratynocytów. Keratynocyty rodzą się w warstwie podstawnej i przemieszczają się w górę przez warstwy nadpodstawne podczas różnicowania, a ostatecznie są zrzucane w zewnętrznej warstwie rogowej około miesiąca po urodzeniu. W naskórku rozwija się wiele przydatków, w tym mieszki włosowe i gruczoły łojowe. Mieszki włosowe również regenerują się w sposób cykliczny przez całe życie1. Zdolność regeneracyjna naskórka jest możliwa dzięki obecności komórek macierzystych i progenitorowych, które znajdują się w warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowego i mieszka włosowego2.
Wiele szlaków sygnałowych zostało zaangażowanych w rozwój i regenerację naskórka. Niektóre z nich występują tylko w naskórku, na przykład szlak jeża. Inne zdarzenia sygnalizacyjne zachodzą między skórą właściwą a naskórkiem3. Na przykład uważa się, że sygnały Wnt ze skóry właściwej są ważne dla rozwoju mieszków włosowych i są wydzielane przez brodawkę skórną na początku anagenu w celu aktywacji proliferacji komórek macierzystych / progenitorowych wybrzuszenia mieszków włosowych i wzrostu mieszków włosowych4. Ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne, które kontrolują rozwój i regenerację naskórka, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób mogą one być zaburzone w regeneracyjnych chorobach skóry, takich jak rak skóry.
Ten artykuł opisuje koktajle Clear, Unobstructed Brain Imaging oraz protokółanalizy C (CUBIC)5-7 w celu wyjaśnienia preparatów skóry całego wierzchowca i wizualizacji wzorców ekspresji białek w 3 wymiarach w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda CUBIC polega na zanurzeniu tkanki skórnej w dwóch koktajlach chemicznych na bazie aminoalkoholu. Roztwory te dostosowują współczynniki załamania światła w próbce skóry, pozostawiając tkankę przezroczystą i nienaruszone białka, umożliwiając immunodetekcję w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Korzystając z tego protokołu CUBIC, podstawowe i proliferujące populacje keratynocytów w naskórku międzypęcherzykowym i w mieszku włosowym zostały zobrazowane w biopsjach skóry pełnej grubości myszy typu dzikiego przy użyciu przeciwciał anty-Keratyny14 (K14) i anty-Ki67. Gruczoły łojowe w biopsjach skóry typu dzikiego były również wizualizowane za pomocą barwienia czerwienią nilową. Na koniec porównano podstawowe populacje keratynocytów w biopsjach skóry typu dzikiego i hiperplastycznego YAP2-5SA-ΔC8.
Ten protokół CUBIC umożliwia wizualną ocenę ekspresji białka w biopsjach skóry pełnej grubości w rozdzielczości pojedynczej komórki i jest ważnym narzędziem do zrozumienia anatomii naskórka i defektów morfologicznych w skórze genetycznie modyfikowanych myszy, a także do zbadania komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i regeneracji naskórka.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96% (nieskażony)</td><td>Dostawa chemiczna</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Nil Red</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiamina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>Eter mono-p-izooktylofenylowy glikolu polietylenowego</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura skrawania (OCT)</td><td>Compound Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Keratynę14</td><td>Przeciwciało anty-Ki67 Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;,2&prime; '-nitrilotriethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - Mikroskop</td><td></td>konfokalny</tr><tr><td>cruZer6 Trymer do twarzy</td><td>Braun</td><td>Braun cruZer6 Azydek</td> sodu do twarzy <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

protokół cubic wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Skóra jest niezbędna dla naszego przetrwania. Zewnętrzna warstwa naskórka składa się z naskórka międzymieszkowego, który jest warstwowym nabłonkiem płaskonabłonkowym pokrywającym większość naszego ciała, oraz przydatkami naskórka, takimi jak mieszki włosowe i gruczoły potowe. Naskórek ulega regeneracji przez całe życie i w odpowiedzi na urazy. Jest to możliwe dzięki populacjom podstawowych komórek macierzystych / progenitorowych naskórka z ekspresją K14, które są ściśle regulowane przez wiele mechanizmów regulacyjnych aktywnych w naskórku oraz między naskórkiem a skórą właściwą. W tym artykule opisano prostą metodę wyjaśniania biopsji skóry myszy o pełnej grubości i wizualizacji wzorców ekspresji białka K14, komórek proliferujących znakowanych Ki67, sebocytów znakowanych czerwienią Nilową i znakowania jądrowego DAPI w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę i ilościowe określenie anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy. Protokół CUBIC jest najlepszą dostępną do tej pory metodą badania interakcji molekularnych i komórkowych w biopsjach skóry o pełnej grubości w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Biopsje skóry grzbietowej pełnej grubości pobrane od dorosłych myszy typu dzikiego poddano procesowi klarowania, barwieniu przeciwciałem wiążącym marker keratynocytów podstawnych Keratin14 (K14), a jądra komórkowe wybarwiono roztworem barwiącym DAPI (Rycina 2 i Film 1).
Jądra komórkowe wykazujące pozytywną reakcję z DAPI były widoczne w całej próbce (Rycina 2A, C), natomiast barwienie K14 było widoczne wyłącznie w jednowarstwiej warstwie podst...

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja proliferacji komórek oraz wzorców ekspresji białek na poziomie pojedynczych komórek w trzech wymiarach, a także dokładna ocena anatomii i patologii skóry. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolują rozwój i regenerację naskórka oraz w jaki sposób mechanizmy te ulegają zaburzeniu podczas chorób skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona technicznie prosty protokół wizualizacji pojedynczych komórek w biopsjach skóry o pełnej grubości w trzech wymiarach z niespotykaną dotąd dokładnością.Metoda ta ułatwia również badanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą w pełnych próbkach skóry. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć pewne trudności z przygotowaniem małych, płaskich biopsji skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych. Procedurę zademonstruje Betty Maclarios, doktorantka w Jednostce Dermatologii Rozwojowej i Regeneracyjnej na UNSW Australia.Zacznij od użycia trymera do ogolenia włosów z karku uśpistej myszy, dbając o to, aby nie zranić skóry. Następnie odkaź skórę 70% etanolem oraz PBS. Następnie unieś pęsetą skórę na grzbiecie karku i za pomocą nożyczek usuń fragment skóry grzbietowej myszy o wymiarach około 1,5 na 4 cm.Następnie należy rozłożyć skórę stroną skóry właściwej do dołu na arkuszu papieru filtrującego, odnotowując orientację przednio-tylną próbki, a następnie przyciąć papier wokół wypreparowanej skóry. Dla zapewnienia optymalnego obrazowania próbki skóry muszą pozostać płaskie, z zachowaniem spójnej orientacji mieszków włosowych. Aby utrzymać próbki w odpowiedniej pozycji przednio-tylnej, utrwalamy fragmenty skóry na papierze filtrującym w formie prostokątnych biopsji.Przenieś próbki do probówki o pojemności 15 mL wypełnionej świeżo przygotowanym 4% PFA i PBS. Następnie, gdy zostaną one mocno utrwalone na papierze filtracyjnym, przenieś preparaty do nowej probówki o pojemności 15 mL z PBS w celu przeprowadzenia dwóch pięciominutowych przemyć. Aby przejrzyć biopsje skóry, po drugim przemyciu użyj ostrego ostrza żyletki, aby pociąć tkankę na kawałki o wymiarach około 0,2 na 0,5 cm, dbając o to, aby dłuższe krawędzie próbek zostały przecięte wzdłuż kierunku przednio-tylnego.Przecinanie biopsji wzdłuż boku, równolegle do orientacji mieszków włosowych, pomaga również uniknąć rozległego uszkodzenia tych struktur. Następnie biopsje zanurza się w 5 mL świeżo przygotowanego roztworu klarującego Cubic One w nowej probówce o pojemności 15 mL i umieszcza probówkę na platformie rotacyjnej w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C. Po uzyskaniu przez fragmenty tkanki przezroczystości, biopsje przemywa się w 4 mL PBS w czterech sześciogodzinnych cyklach płukania w temperaturze 37 °C, a następnie wykonuje czterogodzinne płukanie w temperaturze 37 °C w 20% w/v sacharozy i PBS.Po zakończeniu inkubacji zamrozić każdą próbkę w związku OCT (optimal cutting temperature compound) w oddzielnych probówkach 15 mL przez noc w temperaturze -80 °C, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek dla przeciwciał. Następnego dnia rano zbarwić próbki skóry odpowiednimi przeciwciałami i wybranymi barwnikami witalnymi. Następnie inkubować preparaty w 1 mL świeżo przygotowanego roztworu przejaśniającego CuBx 2 w probówkach 2 mL na wytrząsarce przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu wyrównania współczynnika załamania światła tkanek.Gdy tkanki staną się przejrzyste, należy ułożyć biopsaty wzdłuż dłuższego boku poszczególnych szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kierunek wzrostu mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka. Na tkankę należy nanieść jedną kroplę roztworu cubic two. Na szkiełku nakrywkowym należy umieścić dwa paski masy mocującej blue tack o wymiarach 1 mL na 2 cm, a następnie przykryć biopsat drugim szkiełkiem nakrywkowym.Następnie umieść komorę obrazową na stole mikroskopu konfokalnego i przesuń tkankę do drogi światła. Używając odpowiedniego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych, przeskanuj próbkę, aby zidentyfikować fluorescencyjnie barwione obszary zainteresowania, a następnie wykonaj konfokalne obrazy fluorescencyjne tych obszarów. Metodą tą można przejrzystym uczynić i zbarwić przeciwciałem przeciwko markerowi keratynocytów podstawnych keratyna 14 grube biopsje skóry grzbietowej dorosłych myszy typu dzikiego.Jądra wybarwione na DAPI są widoczne w całej próbce i pozwalają na dostrzeżenie niektórych cech anatomicznych, takich jak brodawki skóry właściwej. Barwienie K14 jest widoczne w jednowarstwowej warstwie podstawnej naskórka międzyfolikularnego. Obrysowuje ono gruczoły łojowe oraz zewnętrzne pochewki korzeniowe mieszków włosowych, a także wtórne pączki włosowe, przy czym w obszarze wybrzuszenia (bulge) mieszków włosowych stwierdzono jedynie niski poziom ekspresji K14.Aby zwizualizować proliferujące komórki, pełnowarstwowe biopsje skóry grzbietowej myszy dorosłych typu dzikiego w fazie telogenu można przejrzyścić i zabarwić zgodnie z instrukcją, co ujawni obecność proliferujących keratynocytów w podstawnej warstwie naskórka międzyfolikularnego oraz w przesmyku, lecz nie w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych. Aby zwizualizować gruczoły łojowe, pełnowarstwowe biopsje skóry grzbietowej myszy dorosłych typu dzikiego w fazie antigen można przejrzyścić i zabarwić, co ułatwia wykrycie gruczołów łojowych w obszarze przesmyku mieszków włosowych. Aby zwizualizować zmiany morfologiczne w naskórku zwierząt transgenicznych, pełnowarstwowe biopsje skóry grzbietowej można przejrzyścić i zabarwić, co ujawni hiperplazję naskórka międzyfolikularnego oraz nieprawidłowe mieszki włosowe z masami komórek oznakowanych K14 rozciągającymi się proksymalnie w głąb skóry właściwej, co reprezentuje powiększone populacje transgenicznych komórek macierzystych.Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze rozumieć, jak przygotowywać i klarować próbki skóry oraz jak wizualizować wzorce ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczych komórek w trzech wymiarach. Metoda ta jest prosta w wykonaniu i wykorzystuje stosunkowo bezpieczne i niedrogie odczynniki. W przyszłości przetestowane zostaną kolejne przeciwciała pod kątem ich kompatybilności z tą metodą, co pozwoli na rozszerzenie analizy o wizualizację większej liczby białek i konkretnych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.W celu wizualizacji anatomii skóry oraz wzorców ekspresji białek w większych próbkach skóry w trzech wymiarach można zastosować inne metody obrazowania, takie jak mikroskopia arkusza światła. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę badaczom z dziedziny dermatologii do analizy interakcji komórkowych i molekularnych między skórą właściwą a naskórkiem w procesach homeostazy skóry, w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich oraz w jednym z naszych modeli chorób skóry.

cubic-protocol-visualizes-protein-expression-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę wizualizacji opartą na CUBIC, technikę obrazowania zależnej od oczyszczania tkanek do wizualnej oceny ekspresji białka w biopsjach skóry z całego montażu w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Ten prosty technicznie protokół pozwala na wizualizację białek skóry bez przygotowywania skrawków skóry.

Wizualizacja ekspresji białek w oparciu o CUBIC: procedura wizualizacji ekspresji białek w biopsjach skóry myszy o pełnej grubości

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Ta praca przedstawia nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubej, trójwymiarowej analizy przekroju poprzecznego tkanki, który umożliwia pełne wykorzystanie modalności obrazowania konfokalnego. Protokół ten zachowuje antygenowość i stanowi solidny system do analizy histologii skóry i potencjalnie innych typów tkanek.

Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Poznaj protokół CUBIC do wizualizacji ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych myszy. Ta metoda umożliwia dokładną analizę anatomii i patologii skóry w 3D.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Przeglądaj więcej filmów