Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja proliferacji komórek i wzorców ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki w trzech wymiarach oraz dokładna ocena anatomii i patologii skóry. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolują rozwój i regenerację naskórka oraz jak te mechanizmy są zaburzone podczas chorób skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to technicznie prosty protokół wizualizacji pojedynczych komórek w biopsjach skóry o pełnej grubości w trzech wymiarach z niespotykaną dotąd dokładnością.

Metoda ułatwia również badanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą w pełnych próbkach skóry. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć pewne trudności z przygotowaniem małych biopsji płaskiej skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych. Procedurę zademonstruje Betty Maclarios, doktorantka na Zakładzie Dermatologii Rozwojowej i Regeneracyjnej w UNSW Australia.

Zacznij od użycia trymerów do zgolenia włosów z szyi myszy poddanej eutanazji, uważając, aby nie zranić skóry. Następnie odkaż skórę za pomocą 70% etanolu i PBS. Następnie podnieś skórę grzbietu szyi za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby usunąć około 1,5 na 4 cm obszar grzbietowej skóry myszy.

Następnie spłaszcz skórę właściwą stroną do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej, zwracając uwagę na przednią tylną orientację próbki i przytnij bibułę wokół wypreparowanej skóry. Aby uzyskać optymalne obrazowanie, próbki skóry muszą pozostać płaskie ze stałą orientacją mieszków włosowych. Aby utrzymać próbki we właściwej przedniej tylnej pozycji, mocujemy kawałki skóry na bibule filtracyjnej w biopsjach prostokątnych.

Przenieść próbki do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej świeżo przygotowanymi 4% PFA i PBS. Następnie, gdy zostaną mocno przymocowane do bibuły filtracyjnej, przenieś próbki do nowej probówki PBS o pojemności 15 ml na dwa pięciominutowe płukania. Aby oczyścić biopsje skóry, po drugim umyciu użyj ostrej żyletki, aby pociąć tkanki na kawałki o wymiarach około 0,2 na 0,5 cm, uważając, aby dłuższe boki próbek zostały przecięte wzdłuż przedniej tylnej strony próbek.

Cięcie wzdłuż boku biopsji równolegle do orientacji mieszków włosowych pomaga również uniknąć rozległego uszkodzenia mieszków włosowych. Zanurzają biopsje w 5 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w nowej probówce o pojemności 15 ml i umieszczają probówkę na obrotowej platformie w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kawałki tkanek staną się przezroczyste, umyj biopsje w 4 ml PBS przez cztery sześciogodzinne płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie czterogodzinne mycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% wagowo sacharozy i PBS.

Pod koniec inkubacji zamrozić każdą próbkę w związku o optymalnej temperaturze cięcia w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek dla przenikania przeciwciał. Następnego ranka zabarwić próbki skóry odpowiednimi przeciwciałami i interesującymi ich barwnikami. Następnie inkubować próbki w 1 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w probówkach o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanek.

Gdy tkanki są czyste, należy umieścić biopsje wzdłuż dłuższego boku poszczególnych szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kierunek wzrostu mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Umieść jedną kroplę roztworu sześciennego dwa na chusteczce. Umieścić dwa paski niebieskiego kleju o wymiarach 1 ml na 2 cm na szkiełku nakrywkowym, a następnie przykryć biopsję drugim szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła. Korzystając z odpowiedniego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych, zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować fluorescencyjnie zabarwione obszary zainteresowania, a następnie uzyskaj fluorescencyjne obrazy konfokalne obszarów zainteresowania. Za pomocą tej metody można oczyścić biopsje grzbietowej skóry dorosłych myszy typu dzikiego o dowolnej grubości i wybarwić przeciwciałem przeciwko podstawnemu markerowi keratynocytów keratynie 14.

Jądra Dappy dodatnie są widoczne w całej próbce i pozwalają docenić niektóre cechy anatomiczne, takie jak brodawki skórne. Zabarwienie K14 jest widoczne w warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowowego o grubości jednej komórki. Zarysowanie gruczołów łojowych i zewnętrznych osłonek korzeniowych mieszków włosowych oraz wtórnych zarodków włosa, przy czym w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych wykryto tylko niski poziom ekspresji K14.

Aby uwidocznić proliferujące komórki, biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości przy telogenie dorosłych myszy typu dzikiego można wyjaśnić i wybarwić, jak wykazano, ujawniając obecność proliferujących keratynocytów w naskórku podstawnym międzymieszkowym i w przesmyku, ale nie w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych. Aby uwidocznić gruczoły łojowe, można oczyścić i wybarwić biopsje grzbietowe skóry o pełnej grubości przy antygenie dorosłych myszy typu dzikiego, co ułatwia wykrywanie gruczołów łojowych w obszarze przesmyku mieszków włosowych. Aby uwidocznić zmiany morfologiczne w naskórku i zwierzętach transgenicznych, można wyjaśnić i wybarwić biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości, odsłaniając przerost naskórka międzymieszkowego i nieprawidłowe mieszki włosowe z masami komórkowymi znakowanymi K14 rozciągającymi się proksymalnie do skóry właściwej, reprezentującymi powiększone populacje transgenicznych komórek macierzystych.

Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić próbki skóry oraz jak wizualizować wzorce ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w trzech wymiarach. Ta metoda jest prosta do wykonania i wykorzystuje stosunkowo bezpieczne i niedrogie odczynniki. W przyszłości więcej przeciwciał zostanie przetestowanych pod kątem ich kompatybilności z tą metodą, co pozwoli na rozszerzenie tej analizy w celu wizualizacji większej liczby białek i niektórych rodzajów zainteresowania.

Inne metody obrazowania, takie jak mikroskopia świetlna, mogą być wykonywane w celu wizualizacji anatomii skóry i wzorców ekspresji białek w większych próbkach skóry w trzech wymiarach. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie dermatologii do zbadania interakcji komórkowych i molekularnych między skórą właściwą a naskórkiem w homeostazie skóry, w genetycznie zmodyfikowanych modelach myszy oraz w jednym z naszych modeli chorób skóry.