Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu
August 4th, 2016
Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja proliferacji komórek i wzorców ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki w trzech wymiarach oraz dokładna ocena anatomii i patologii skóry. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mechanizmy komórkowe i molekularne kontrolują rozwój i regenerację naskórka oraz jak te mechanizmy są zaburzone podczas chorób skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to technicznie prosty protokół wizualizacji pojedynczych komórek w biopsjach skóry o pełnej grubości w trzech wymiarach z niespotykaną dotąd dokładnością.
Metoda ułatwia również badanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą w pełnych próbkach skóry. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć pewne trudności z przygotowaniem małych biopsji płaskiej skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych. Procedurę zademonstruje Betty Maclarios, doktorantka na Zakładzie Dermatologii Rozwojowej i Regeneracyjnej w UNSW Australia.
Zacznij od użycia trymerów do zgolenia włosów z szyi myszy poddanej eutanazji, uważając, aby nie zranić skóry. Następnie odkaż skórę za pomocą 70% etanolu i PBS. Następnie podnieś skórę grzbietu szyi za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby usunąć około 1,5 na 4 cm obszar grzbietowej skóry myszy.
Następnie spłaszcz skórę właściwą stroną do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej, zwracając uwagę na przednią tylną orientację próbki i przytnij bibułę wokół wypreparowanej skóry. Aby uzyskać optymalne obrazowanie, próbki skóry muszą pozostać płaskie ze stałą orientacją mieszków włosowych. Aby utrzymać próbki we właściwej przedniej tylnej pozycji, mocujemy kawałki skóry na bibule filtracyjnej w biopsjach prostokątnych.
Przenieść próbki do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej świeżo przygotowanymi 4% PFA i PBS. Następnie, gdy zostaną mocno przymocowane do bibuły filtracyjnej, przenieś próbki do nowej probówki PBS o pojemności 15 ml na dwa pięciominutowe płukania. Aby oczyścić biopsje skóry, po drugim umyciu użyj ostrej żyletki, aby pociąć tkanki na kawałki o wymiarach około 0,2 na 0,5 cm, uważając, aby dłuższe boki próbek zostały przecięte wzdłuż przedniej tylnej strony próbek.
Cięcie wzdłuż boku biopsji równolegle do orientacji mieszków włosowych pomaga również uniknąć rozległego uszkodzenia mieszków włosowych. Zanurzają biopsje w 5 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w nowej probówce o pojemności 15 ml i umieszczają probówkę na obrotowej platformie w piecu hybrydyzacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy kawałki tkanek staną się przezroczyste, umyj biopsje w 4 ml PBS przez cztery sześciogodzinne płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie czterogodzinne mycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 20% wagowo sacharozy i PBS.
Pod koniec inkubacji zamrozić każdą próbkę w związku o optymalnej temperaturze cięcia w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek dla przenikania przeciwciał. Następnego ranka zabarwić próbki skóry odpowiednimi przeciwciałami i interesującymi ich barwnikami. Następnie inkubować próbki w 1 ml świeżo przygotowanego sześciennego roztworu klarującego w probówkach o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyrównać współczynnik załamania światła tkanek.
Gdy tkanki są czyste, należy umieścić biopsje wzdłuż dłuższego boku poszczególnych szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby kierunek wzrostu mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Umieść jedną kroplę roztworu sześciennego dwa na chusteczce. Umieścić dwa paski niebieskiego kleju o wymiarach 1 ml na 2 cm na szkiełku nakrywkowym, a następnie przykryć biopsję drugim szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę na ścieżkę światła. Korzystając z odpowiedniego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych, zeskanuj próbkę, aby zidentyfikować fluorescencyjnie zabarwione obszary zainteresowania, a następnie uzyskaj fluorescencyjne obrazy konfokalne obszarów zainteresowania. Za pomocą tej metody można oczyścić biopsje grzbietowej skóry dorosłych myszy typu dzikiego o dowolnej grubości i wybarwić przeciwciałem przeciwko podstawnemu markerowi keratynocytów keratynie 14.
Jądra Dappy dodatnie są widoczne w całej próbce i pozwalają docenić niektóre cechy anatomiczne, takie jak brodawki skórne. Zabarwienie K14 jest widoczne w warstwie podstawnej naskórka międzymieszkowowego o grubości jednej komórki. Zarysowanie gruczołów łojowych i zewnętrznych osłonek korzeniowych mieszków włosowych oraz wtórnych zarodków włosa, przy czym w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych wykryto tylko niski poziom ekspresji K14.
Aby uwidocznić proliferujące komórki, biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości przy telogenie dorosłych myszy typu dzikiego można wyjaśnić i wybarwić, jak wykazano, ujawniając obecność proliferujących keratynocytów w naskórku podstawnym międzymieszkowym i w przesmyku, ale nie w obszarze wybrzuszenia mieszków włosowych. Aby uwidocznić gruczoły łojowe, można oczyścić i wybarwić biopsje grzbietowe skóry o pełnej grubości przy antygenie dorosłych myszy typu dzikiego, co ułatwia wykrywanie gruczołów łojowych w obszarze przesmyku mieszków włosowych. Aby uwidocznić zmiany morfologiczne w naskórku i zwierzętach transgenicznych, można wyjaśnić i wybarwić biopsje grzbietowej skóry o pełnej grubości, odsłaniając przerost naskórka międzymieszkowego i nieprawidłowe mieszki włosowe z masami komórkowymi znakowanymi K14 rozciągającymi się proksymalnie do skóry właściwej, reprezentującymi powiększone populacje transgenicznych komórek macierzystych.
Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak przygotować i oczyścić próbki skóry oraz jak wizualizować wzorce ekspresji białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w trzech wymiarach. Ta metoda jest prosta do wykonania i wykorzystuje stosunkowo bezpieczne i niedrogie odczynniki. W przyszłości więcej przeciwciał zostanie przetestowanych pod kątem ich kompatybilności z tą metodą, co pozwoli na rozszerzenie tej analizy w celu wizualizacji większej liczby białek i niektórych rodzajów zainteresowania.
Inne metody obrazowania, takie jak mikroskopia świetlna, mogą być wykonywane w celu wizualizacji anatomii skóry i wzorców ekspresji białek w większych próbkach skóry w trzech wymiarach. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie dermatologii do zbadania interakcji komórkowych i molekularnych między skórą właściwą a naskórkiem w homeostazie skóry, w genetycznie zmodyfikowanych modelach myszy oraz w jednym z naszych modeli chorób skóry.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To raport opisuje protokół CUBIC w celu klarowania pełnowymiarowych biopsji skóry myszy, umożliwiający wizualizacje wzorców ekspresji białek i komórek prolifeujących z rozdzielczością pojedynczych komórek w 3D. Ta metoda ułatwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry, szczególnie w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Dermatologia
- Biologia komórki
Tło
- Rozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych w rozwoju naskórka.
- Badanie procesów chorób skóry i regeneracji.
- Znaczenie dokładnej analizy biopsji skóry.
- Wyzwania w przygotowywaniu próbek skóry bez uszkodzenia mieszków włosowych.
Cel badania
- Wizualizacja proliferacji komórek i ekspresji białek w 3D.
- Dokładna ocena anatomii i patologii skóry.
- Zbadanie interakcji między naskórkiem a skórą właściwą.
Stosowane metody
- Protokół CUBIC do klarowania tkanek.
- Techniki wizualizacji 3D.
- Analiza z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Pełnowymiarowe biopsje skóry z mysich modeli.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja pojedynczych komórek w biopsjach skóry.
- Lepsze zrozumienie wzorców ekspresji białek.
- Wgląd w nienormalne fenotypy naskórka.
- Ułatwienie badań nad chorobami skóry.
Wnioski
- Protokół CUBIC jest prostą, ale skuteczną metodą analizy skóry.
- Zapewnia bezprecedensową dokładność w wizualizacji interakcji komórek skóry.
- Ta technika może posłużyć rozwojowi badań w dermatologii i medycynie regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The CUBIC protocol enables high-resolution 3D visualization of protein expression and cellular dynamics in full-thickness skin biopsies, supporting mechanistic de-risking in dermatology target validation. By providing single-cell resolution data on epidermal stem/progenitor populations and their interactions with the dermis, the method enhances predictive confidence in preclinical models of skin regeneration and disease. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing biological ambiguity in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell dynamics in intact tissue architecture.
- Scientific Value: Supports functional target validation through spatial mapping of proliferation (Ki67) and sebocyte differentiation (Nile Red) in genetically modified models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by quantifying abnormal epidermal phenotypes and stromal interactions in 3D without sectioning artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving epidermal-dermal architecture and appendage integrity.
- Operational Value: Enables reproducible quantitative outputs for protein expression and cell proliferation across conditions, supporting assay scalability.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a clear, intact tissue platform for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by visualizing hyperplasia, abnormal follicle morphology, and stem cell mass expansion in transgenic models.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlative analysis of K14, Ki67, and sebocyte markers with phenotypic outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into epidermal-dermal crosstalk during homeostasis and perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, enabling iterative assessment of skin-specific biological responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving spatial expression patterns of keratinocytes, proliferating cells, and sebocytes in intact skin.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized clearing and staining of full-thickness biopsies with consistent follicle orientation.
- Analytics: Generates quantitative 3D readouts on protein expression and cell density that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving disease-relevant epidermal and dermal structures for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing platform applicable across wild-type, mutant, and treatment-induced skin models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epidermal regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a simple, solvent-based clearing protocol compatible with conventional confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of on-target and off-target epidermal effects in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on stem cell dynamics and sebaceous gland function in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunofluorescence staining to preserve epidermal appendages during biopsy preparation.
- Depends on access to a hybridization oven, rotating platform, and confocal microscope with standard epifluorescence filters for 3D imaging.
- Necessitates cross-team standardization of biopsy orientation and clearing duration to ensure consistent refractive index matching and imaging quality.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to thicker human skin explants or alternative mammalian models due to lipid and collagen content.
- Involves practical limitations related to the duration of clearing and washing steps, which may extend timelines for high-throughput screening applications.
