Wizualizacja i kwantyfikacja interakcji wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis i ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena poziomu kolokalizacji zinternalizowanych bakterii RIA Meningitidis z białkiem cytoszkieletu Alfa Actinin. Osiąga się to poprzez zakażenie hodowanych komórek mikronaczyniowych ludzkiego mózgu nocną hodowlą bakterii przez trzy do ośmiu godzin, aby umożliwić bakteriom przedostanie się do komórek docelowych. W drugim etapie komórki z bakteriami wewnątrzkomórkowymi są myte, utrwalane, a następnie przenikane, co przygotowuje zakażoną kulturę do barwienia immunologicznego zinternalizowanych bakterii i wewnątrzkomórkowej alfa aktyniny.

Po obrazowaniu konfokalnym i zastosowaniu oprogramowania do kolokalizacji można obserwować obrazy kolokalizacji wewnątrzkomórkowej i uzyskuje się wyniki ilościowe, które pokazują, że Meninga Croci eksprymuje OPC, a także białko błonowe może specyficznie oddziaływać z wewnątrzkomórkową alfa aktyniną w oparciu o konfokalną wizualizację mikroskopową i ilościową analizę kolokalizacji. Cześć, nazywam się Isel Maria i pracuję w Professor Mata TI Lab na Wydziale Komórkowej Medycyny Molekularnej na Uniwersytecie w Bri. Dziś pokażemy Państwu procedurę szacowania poziomu col, stosunku bakterii wewnątrzkomórkowych do białek cytoszkieletu.

Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania interakcji grzybni zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wyrażającego białko autobłonowe OPC z białkiem cytoszkieletu alfa aktyną. Więc zacznijmy. Praca ta musi być wykonywana w odpowiednim laboratorium bezpieczeństwa.

Dwa dni przed zabiegiem barwienia immunologicznego należy zaszczepić interesujący nas barwnik bakteryjny we wlewie serca do mózgu. Płytki agarowe uzupełnione 10% podgrzaną krwią końską rosną przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla w dniu poprzedzającym barwienie immunologiczne. Użyj pętli hodowlanej o pojemności 10 mikrolitrów, aby zrobić zawiesinę nocnej kultury bakteryjnej.

W dwóch mililitrach PBSB pozostaw zawiesinę na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzenie się dużych agregatów bakteryjnych. Następnie przenieś górny jeden mililitr zawiesiny do sterylnej probówki bez naruszania granulki rozpuszczaj bakterie Dodając jeden mililitr 1% SDS 0,1 molowego wodorotlenku sodu do dwóch fiolek zawierających 20 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej i odwróć probówkę do wymieszania. Aby oszacować liczbę bakterii.

Zmierzyć zawartość kwasu nukleinowego, określając absorbancję roztworu. Przy 216 pyleniach dostosowuje zawiesinę bakteryjną do wymaganej gęstości w pożywce infekcyjnej do zakażenia komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu lub H-B-M-E-C-A wysiane dwa dni przed barwieniem immunologicznym umieszczają 16-milimetrową szklaną pokrywę w studzienkach 12-dołkowej płytki i zasiewają morza HBME przy 50% konfluencji na szkiełkach przykrywkowych, inkubują przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla następnego dnia.

Zainfekuj komórki świeżo przygotowaną zawiesiną bakteryjną w naszym laboratorium. Rutynowo stosuje się współczynnik infekcji wynoszący od 200 do 300 jednostek tworzących kolonie na komórkę docelową. Inkubować przez trzy do ośmiu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla pod koniec okresu infekcji.

Przemyć komórki trzykrotnie PBS i utrwalić 500 mikrolitrów 2% para formaldehydu przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej Po zmyciu paraformaldehydu, permować komórki utrwalone paraldehydem przez inkubację w 0,1% Triton X 100 rozcieńczonym w PBS przez 10 minut. Na koniec przemyj próbki trzykrotnie PBS i przystąp do barwienia immunologicznego, jak pokazano. Następnie można jednocześnie przeprowadzić barwienie bakterii wewnątrzkomórkowych i dfor aktyniny.

W płytkach 12-dołkowych zatkać szkiełka nakrywkowe zawierające przepuszczalne komórki 500 mikrolitrami 3% B-S-A-P-B-S-T na 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej po przemyciu transferem PBS, każde szkiełko nakrywkowe umieścić w nowej suchej studzience na płytce 12-dołkowej przy pierwotnych przeciwciałach przeciwko bakteriom i alfa-aktininie jednocześnie 80 do 100 mikrolitrów przeciwciała na szkiełko nakrywkowe jest wystarczające, jeśli dodaje się ostrożnie, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego, inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej Pod koniec inkubacji, dodać 200 mikrolitrów PBS do, dobrze podnieść szkiełko nakrywkowe i umieścić je w nowej studzience zawierającej 500 mikrolitrów PBS Po pięciu minutach usunąć PBS przez pipetowanie, a następnie dodać świeży PBS. Powtórz dwa razy i przenieś szkiełka nakrywkowe do nowego suchego dołka.

Następnie dodaj odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluorochromami, rozcieńczone w 1% B-S-A-P-B-S-T Inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w ciemności, pod koniec inkubacji pokazano wcześniej mycie, a następnie przeciwbarwić DNA DPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, pod koniec tej inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe w PBS raz, a następnie zamontować z kroplą mocowania. Średnio zamontowane szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w ciemności, dopóki nie będą gotowe do obserwacji. Pod mikroskopem obserwujemy i rejestrujemy obrazy naszych próbek znakowanych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego podłączonego do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego epi.

Aby rozpocząć procedurę CLSM od momentu zanurzenia w obiektywie i umieścić osłonę preparatu, zsunąć się na stolik mikroskopu, ustawić mikroskop w trybie wizualnym i znaleźć obszar zainteresowania za pomocą okularów mikroskopu, jesteśmy teraz gotowi do korzystania z oprogramowania Leica. Wybierz tryb akwizycji XY zed. Wybierz format pięć 12 na pięć 12 dla badań kolokalizacyjnych.

Im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz. Następnie wybierz dwukierunkowy tryb X, który zwiększy szybkość skanowania i pomoże zmniejszyć wybielanie zdjęć. Skonfiguruj ustawienia skanowania sekwencyjnego.

Kliknij funkcję SEC, a następnie wybierz opcję między wierszami. Wybierz wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami drugorzędowymi. 4 0 5 nanometrów dla DPI 4 88 nanometrów dla Alexa, Fluor 4 88 i 5 61 nanometrów.

Dla trixy aktywuj fotopowielacz rurkę odpowiednio pierwszą, drugą i trzecią. Skonfiguruj górę i dół stosu lub serii Z. Następny zestaw, rozmiar kroku Zed do 0,2 mikrometra.

RIA Mencius jest diplo occus, a ponieważ każdy caucus ma przybliżoną średnicę 0,5 mikrometra, rozmiar kroku Z wynoszący 0,2 mikrometra zwiększa prawdopodobieństwo przeskanowania każdego caucus co najmniej dwukrotnie. Ustaw końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii z trzech, aby poprawić stosunek sygnału do szumu, klikając start. Podwójnie lub potrójnie barwione obrazy uzyskuje się przez sekwencyjne skanowanie na różnych długościach fal i przy użyciu trybu między liniami dla każdego kanału w celu wyeliminowania przesłuchów między różnymi chromoforami.

Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybierz funkcję nakładania, aby scalić wybrane kanały w jeden obraz. Na przykład, gdy zarówno Alexa 4 88, jak i trissy Fluor Chromes wspólnie lokalizują żółty kolor, pojawi się na nałożonym obrazie do rekonstrukcji 2D wymaganej do wizualizacji możliwej kolokalizacji, kompilacji stosu lub serii Zed przy użyciu funkcji maksymalnej projekcji. Po uzyskaniu stosu lub serii Z przetwarzaj swoje dane, aby uzyskać ortogonalny obraz do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji różnych elementów.

Kwantyfikacja kolokalizacji odbywa się za pomocą oprogramowania Vol City firmy IMP provision. Aby rozpocząć tworzenie biblioteki z obrazami CLSM, wybierz opcję Rozszerzony fokus z obrazu na górnym pasku. To narzędzie połączy Zacksa w obraz 2D, który ma zostać przeanalizowany.

Teraz wybierz narzędzie do kolokalizacji. Dwa analizowane kanały powinny mieć tę samą głębię kolorów. Wybierz obszar, który ma zostać określony ilościowo.

Ustaw próg, aby usunąć dowolne tło. Utwórz dane wyjściowe kolokalizacji, wybierając opcję generuj kolokalizację. Statystyki kolokalizacji zostaną wygenerowane dla wybranych wcześniej regionów zainteresowania.

Następnie wybierz współczynniki mandra R i ny. Na koniec eksport lub wartości statystyczne do dokumentu Excel w celu prezentacji danych pokazały tutaj reprezentatywne wyniki obrazowania konfokalnego komórek śródbłonka ludzkiego mózgu zakażonych kogutem oponowym przez osiem godzin. Lokalizacja bakterii jest pokazana na czerwono.

Podczas gdy lokalizacja alfa aktyniny jest pokazana w zielonych strzałkach, wskazują regiony, w których wydaje się, że wokół bakterii wystąpił wysoki stopień akumulacji alfa-aktyniny. Na tym obrazie nakładki znajduje się kilka obszarów, w których pojawia się żółty pomarańczowy kolor, co sugeruje kolokalizację między oponami mózgowo-ujściymi a alfa aktyniną. Na następnym zdjęciu optyczne rozwarstwienie zakażonej monowarstwy H-B-M-E-C wskazuje na kolokalizację wokół bakterii wewnątrzkomórkowych znajdujących się u podstawy komórki.

Gdy przetworzono trójwymiarowe obrazy zainfekowanych monowarstw H-B-M-E-C, UKOŚNY WIDOK POWIERZCHNI WIERZCHOŁKOWEJ POKAZUJE BAKTERIĘ DURANT ZABARWIONĄ NA CZERWONO, WSKAZANĄ CZERWONĄ STRZAŁKĄ, WSKAZANĄ CZERWONĄ STRZAŁKĄ, GDZIE KILKA BAKTERII ZNAJDUJE SIĘ W KIERUNKU PODSTAWOWYCH POWIERZCHNI KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA WSKAZANYCH ŻÓŁTĄ STRZAŁKĄ. Wyraźnie pomarańczowo-żółte położenie podstawowe można wyraźniej zobaczyć w tym przekroju poprzecznym endon XZ. W przeciwieństwie do dalekiej odległości, eksperymenty z aktyniną, w których przeprowadzono znakowanie zinternalizowanych bakterii i mentonu lub aktyny, ujawniają sporadyczną kolokalizację z aktyną, ale rzadką kolokalizację z fermentacją w komórkach H-B-M-E-C.

Jak zaobserwowano w poprzednich eksperymentach, Retin był skoncentrowany wokół kilku zinternalizowanych bakterii wskazanych białymi strzałkami. Dane zostały również przeanalizowane w celu uzyskania względnego nakładania się. Współczynnik R, który według Mandy reprezentuje prawdziwy stopień kolokalizacji IE, liczbę pikseli, które kolokalizują się w porównaniu z całkowitą liczbą pikseli i wartościami NY dla alfa aktyniny, mentingu i aktyny ogólnie w H-B-M-E-C zakażonym OPC eksprymującym meningokoki, uzyskano więcej niż 25% nakładanie się wodzy w meningokokach.

Współczynnik i Y są miarą częstotliwości waluty bardziej obfitego sygnału wodzy za każdym razem, gdy występuje mniej obfity sygnał kakaowy opon mózgowych. Pomiar ten pokazuje uderzający poziom występowania alfa aktyniny w pobliżu zinternalizowanego koguta oponowego. Pokażemy tylko, jak zwizualizować i określić ilościowo wprowadzenie zinternalizowanych bakterii z elementami cytoszkieletu w tym eksperymencie.

Ważne jest, aby pamiętać o ścisłym przestrzeganiu protokołów utrwalania i immunologicznego pnia, aby zachować integralność struktur i uniknąć wysokiego tła. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.