Name: Wizualizacja i kwantyfikacja interakcji wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis i ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji interakcji Neisseria meningitidis z α-aktyniną w komórkach śródbłonka mózgu człowieka przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia ilościową analizę kolokalizacji bakterii z białkiem cytoszkieletowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania zostały sfinansowane przez Wellcome Trust oraz Meningitis UK. Linia komórkowa HBMEC została udostępniona przez dr. K.S. Kima. Obrazowanie konfokalne i mikroskopia elektronowa zostały wykonane w Wolfson Bioimaging Facility na Uniwersytecie w Bristolu. Chcielibyśmy również podziękować panu Alanowi Leardowi, dr. Markowi Jepsonowi (Uniwersytet w Bristolu) oraz panu Alanowi Tilleyowi (PerkinElmer) za pomoc i doradztwo.

1. Protokół immunofluorescencji
Wysiewanie, zakażanie i immunobarwienie
Następujące procedury wymagają odpowiedniego poziomu bezpieczeństwa w laboratoriach hodowli tkankowych i mikrobiologicznych.
DZIEŃ 1
A. Przygotowanie komórek docelowych do infekcji
<ol>
	<li>Wysiać HBMEC do uzyskania 50% konfluencji (~1,5x104 komórek/cm2) na szkiełkach nakrywkowych (średnica 16 mm) umieszczonych w płytce 12-dołkowej (3,8 cm2 obszar wzrostu/dołek). Pożywka wzrostowa: RPMI 1640 uzupełniona o 15% inaktywowanego ciepłem (56 °C, 30 min) FBS, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 J/ml penicyliny/streptomycyny, 1% (v/v) roztworu nieistotnych aminokwasów MEM oraz 1% roztworu witamin MEM.</li>
	<li>Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37°C, w 5% CO22 inkubator</li>
</ol>
B. Hodowla bakteryjna
<ol>
	<li>Hodować wybrany szczep przez noc (16-18 h) na odpowiedniej pożywce, np. płytkach z agarem Brain Heart Infusion (BHI) uzupełnionym o 10% podgrzewanej krwi koni w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO24.</li>
</ol>
DZIEŃ 2
A. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej (N. meningitidis)
<ol>
	<li>Za pomocą pętli do posiewu 10 μL przygotować zawiesinę nocnej hodowli bakterii w 2 mL PBSB (PBS z jonami wapnia i magnezu).</li>
	<li>Pozostawić zawiesinę na 5 min w temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić osadzenie się dużych agregatów bakteryjnych.</li>
	<li>Bez naruszania osadu przenieść górną 1 mL zawiesiny (szczep macierzysty) do sterylnej probówki.</li>
	<li>Aby oszacować liczbę bakterii w szczepie macierzystym, dodać alikwoty (20-50 μL) do probówek zawierających 1 mL 1% SDS w 0,1M NaOH i delikatnie wymieszać w celu solubilizacji.</li>
	<li>Zmierzyć zawartość kwasów nukleinowych w roztworze, określając absorbancję przy 260 nm (A260). W naszych warunkach A260 równa 1 odpowiada 5x108 jednostkom tworzącym kolonie na ml (cfu/mL). Można to zweryfikować, przygotowując szereg rozcieńczeń szczepu macierzystego w PBSB, wysiewając je na płytki agarowe i licząc kolonie po inkubacji przez noc (O/N).</li>
	<li>Rozcieńczyć alikwot szczepu macierzystego w medium infekcyjnym [M199 uzupełniony o 2% zdekomplementowaną (56°C, 30 min) normalną ludzką surowicę (NHS)], aby uzyskać wymaganą gęstość bakterii do infekcji komórek docelowych.
 <ol>
 	<li>W naszym laboratorium rutynowo stosuje się stosunek infekcji wynoszący 200-300 bakterii na jedną komórkę docelową.</li>
	</ol>
 </li>
</ol>
B. Infekcja hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Przemyj 3 razy szkiełka podstawowe z hodowanymi komórkami docelowymi za pomocą pożywki Hanksa, aby usunąć wszelkie ślady antybiotyków. </li>
	<li>Zainfekuj komórki świeżo przygotowanymi zawiesinami bakteryjnymi (opisanymi powyżej), inkubując przez 3 h do 8 h w temperaturze 37°C, w 5%CO2. </li>
	<li>Po zakończeniu okresu infekcji przemyj komórki trzykrotnie PBS i utrwal w 500 μL 2% paraformaldehydu (PFA) przez 30-45 min w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
 <ol>
		<li>Ustalono, że utrwalanie paraformaldehydem w powyższym stężeniu i czasie jest odpowiednie do zachowania morfologii bakterii i komórek.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Po wypłukaniu paraformaldehydu przeprowadź permeabilizację utrwalonych komórek poprzez inkubację w 0,1% Triton X-100 rozpuszczonym w PBS przez 10 min. </li>
	<li>Przemyj próbki 3 razy PBS. </li>
	<li>Przystąp do immunobarwienia lub alternatywnie pozostaw próbki w 500 μL 1%BSA/PBST przez noc w 4°C.</li>
</ol>
DZIEŃ 3
Immunobarwienie
Barwienie bakterii wewnątrzkomórkowych oraz α-aktyniny można przeprowadzić sekwencyjnie lub jednocześnie, stosując odpowiednie przeciwciała pierwotne i wtórne w następujący sposób; wszystkie procedury można wykonać w płytkach 12-dołkowych.
<ol>
	<li>Zablokować szkiełka podstawowe zawierające permeabilizowane komórki za pomocą 500 μL 3% BSA/PBST (PBS zawierający 0,05% Triton X-100) przez 30-60 min w RT</li>
	<li>Po przemyciu PBS przenieść każde szkiełko do nowej suchej studzienki w płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko bakteriom i α-actininie; 80 do 100 μL przeciwciała na szkiełko jest wystarczające, jeśli zostanie dodane ostrożnie tak, aby pokryło powierzchnię szkiełka. Inkubować przez 1h w temperaturze pokojowej.
 <ol>
 	<li>Użyto jednocześnie króliczego poliklonalnego antyserum przeciwko Neisseria meningitidis (hodowane laboratoryjnie) oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) przeciwko α-actininie (Abcam). W niektórych eksperymentach, zamiast przeciwciał anty-α-actinin, zastosowano mAb przeciwko aktynie lub wimentynie (Sigma).</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji dodać do studzienki 200 μL PBS, podnieść szkiełko i umieścić je w nowej studni zawierającej 500 μL PBS.</li>
	<li>Po 5 min usunąć PBS za pomocą pipety, a następnie dodać świeży PBS. Powtórzyć dwukrotnie. Przenieść szkiełka do nowej suchej studzienki.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluorochromami, rozcieńczone w 1% BSA/PBST; inkubować w RT przez 1h w ciemności.
 <ol>
		<li>Do detekcji bakterii użyto przeciwciał anty-króliczych Ig sprzężonych z TRITC, a do detekcji α-actinin i innych białek cytoszkieletu użyto przeciwciał anty-mysich Ig sprzężonych z FITC (Sigma) lub Alexa Fluor 488 (Invitrogen).</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji przemyć zgodnie z krokami 4 i 5.</li>
	<li>Przeprowadzić barwienie kontrastowe za pomocą 0,6 μg/mL DAPI w PBS (barwnik DNA) przez 5 min w RT w ciemności.</li>
	<li>Przepłukać PBS.</li>
	<li>Zamontować szkiełka podstawowe (komórkami skierowanymi w dół) na preparatach za pomocą kropli medium montażowego (np. Mowiol lub Vectashield).</li>
	<li>Przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Próbki są gotowe do obserwacji pod mikroskopem.</li>
</ol>
2. Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM)
Aby zaobserwować i zarejestrować obrazy bakterii wewnątrzkomórkowych oraz elementów cytoszkieletu, wykorzystano próbki poddane immunoznakowaniu, a obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica SP5-AOBS sprzężonego z odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym Leica DM I6000. Wszystkie obrazy pozyskano z użyciem obiektywu imersyjnego olejowego 63x NA 1.4 i przetworzono za pomocą oprogramowania Leica.
Procedura CLSM:
<ol>
	<li>Aby rozpocząć procedurę CLSM, nanieść kroplę olejku imersyjnego na obiektyw i umieścić preparat na stole mikroskopu stroną z szkiełkiem nakrywkowym do dołu.</li>
	<li>Ustawić mikroskop w trybie wizualnym i zlokalizować obszar zainteresowania, korzystając z okularów mikroskopu.</li>
	<li>W oprogramowaniu Leica wybrać tryb akwizycji xyz.</li>
	<li>Wybrać format 512 x 512 (rozmiar ramki). W badaniach kolokalizacji im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz, przy czym należy pamiętać o granicy rozdzielczości mikroskopu. Następnie wybrać dwukierunkowy tryb X, co zwiększy prędkość skanowania i pomoże ograniczyć fotowyblakanie.</li>
	<li>Skonfigurować ustawienia skanowania sekwencyjnego. Kliknąć funkcję „seq” i wybrać jeden z trybów skanowania. Stosujemy tryb „between lines”.</li>
	<li>Wybrać wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami wtórnymi: 405 nm dla DAPI (niebieski), 488 nm dla Alexa Fluor 488 (zielony) oraz 561 nm dla TRITC (czerwony). Aktywować odpowiednio fotopowielacz (PMT) 1, 2 i 3. Dostosować ustawienia PMT, aby wykryć prawidłową długość fali emisji.</li>
	<li>Ustawić górną („begin”) i dolną („end”) granicę stosów z lub serii. Następnie określić wymaganą „wielkość kroku z”. 
	<ol>
		<li>Neisseria meningitidis jest diplokokiem (Rysunek 1G) i ponieważ każdy kok ma przybliżoną średnicę 0.5 μm, wybrano wielkość kroku z wynoszącą 0.20 μm, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zeskanowania każdego kokka co najmniej dwukrotnie. Wartość ta mieści się również w zakresie wielkości kroku dla optymalnej rozdzielczości 0.1 - 0.2 μm.</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Ustawić końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii (line averaging) równe 3, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Po kliknięciu „start” uzyskiwane są obrazy barwione podwójnie lub potrójnie poprzez sekwencyjne skanowanie przy różnych długościach fal, co pozwala wyeliminować interferencje (cross-talk) między różnymi chromoforami.</li>
	<li>Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybrać funkcję „overlay”, aby połączyć wybrane kanały w jeden obraz; na przykład, gdy fluorochromy Alexa 488 (zielony) i TRITC (czerwony) kolokalizują, na obrazie nałożonym pojawi się kolor żółty.</li>
	<li>Skompilować stosy z lub serie za pomocą funkcji „maximum projection” w celu stworzenia obrazu 2D niezbędnego do wizualizacji ewentualnej kolokalizacji. Bardziej szczegółową analizę kolokalizacji można uzyskać poprzez analizę każdego przekroju optycznego.</li>
	<li>Po uzyskaniu stosów z lub serii, przetworzyć dane w celu otrzymania obrazu ortogonalnego do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji różnych elementów (Rysunek 1E).</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja kolokalizacji
Analizy statystyczne obrazów z konfokalnego mikroskopu skaningowego są przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Volocity (Improvision, PerkinElmer). Oprogramowanie to oferuje narzędzie zaprojektowane specjalnie do analizy kolokalizacji zgodnie z opisem Manders et al.(1993)5. Kolokalizacja w kontekście cyfrowego obrazowania fluorescencyjnego może być opisana jako detekcja sygnału w tym samym voxelu (objętości piksela) w każdym kanale. Dwa kanały składają się z obrazów dwóch różnych fluorochromów pobranych z tego samego obszaru próbki (podręcznik użytkownika Volocity). Analizy statystyczne wykonuje się w oprogramowaniu Volocity (Improvision, PerkinElmer), stosując opisaną poniżej ilościową analizę kolokalizacji.
Ilościowa analiza kolokalizacji
<ol>
	<li>Utwórz bibliotekę obrazów CLSM za pomocą oprogramowania Volocity.</li>
	<li>Z górnego paska w menu obrazu wybierz opcję „extended focus”. Narzędzie to złączy stosy z (z-stacks) w obraz 2D do analizy.</li>
	<li>Wybierz narzędzie „Colocalization”. Dwa analizowane kanały powinny mieć taką samą głębię kolorów.</li>
	<li>Zaznacz obszar, który ma zostać poddany kwantyfikacji. Ustaw próg (threshold), aby usunąć tło.</li>
	<li>Wygeneruj wyniki kolokalizacji, wybierając opcję „generate colocalization”. Statystyki kolokalizacji zostaną wygenerowane dla wcześniej wybranych obszarów zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Wybierz współczynniki Mandersa R (współczynnik nakładania) oraz My (współczynnik kolokalizacji).
	<ol>
		<li>Współczynniki Mandersa nie są wrażliwe na intensywność barwienia, ponieważ są normalizowane względem całkowitej intensywności pikseli; mogą zatem być stosowane, gdy barwienie jednego antygenu jest silniejsze od drugiego.</li>
		<li>Współczynnik nakładania R według Mandersa5,6 reprezentuje rzeczywiste stopień kolokalizacji, tzn. liczbę pikseli kolokalizujących w stosunku do całkowitej liczby pikseli.</li>
		<li>Z kolei współczynnik kolokalizacji My opisuje wkład fluorescencyjny składnika występującego w większej ilości (w tym przypadku α-actinin, zielony) w stosunku do składnika występującego w mniejszej ilości (w tym przypadku bakterie, czerwony), tzn. liczbę czerwonych pikseli nakładających się na zielone piksele w stosunku do całkowitej liczby czerwonych pikseli.</li>
		<li>Współczynniki Mandersa mieszczą się w zakresie od 0 do 1, gdzie 1 oznacza wysoką kolokalizację, a 0 jej brak; dla łatwiejszej interpretacji mogą być one wyrażone w procentach.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Wyeksportuj wartości statystyczne do dokumentu Excel w celu prezentacji danych.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Lokalizacja wewnątrzkomórkowa Neisseria meningitidis wykazującej ekspresję Opc oraz α-aktyniny
Obrazowanie konfokalne ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu zainfekowanych Nm przez 3 i 8 godzin, przeprowadzone zgodnie z powyższym opisem, wykazało kolokalizację α-aktyniny i Nm, która wydawała się występować rzadziej w eksperymentach z 3-godzinną infekcją (nie pokazano) w porównaniu z kulturami zainfekowanymi przez 8 h (Rysunek 1 A-F). Wyraźna kolokalizacja α-aktyniny z meningokokami wykazującymi ekspresję Opc była obserwowana za każdym razem w &gt;5 powtórzonych eksperymentach. Analiza statystyczna kolokalizacji z wykorzystaniem kilku obrazów konfokalnych została przeprowadzona zgodnie z powyższym opisem. Ogółem, w HBMEC zainfekowanych meningokokami wykazującymi ekspresję Opc, uzyskano &gt;25% nakładania się zielonych (α-aktynina) i czerwonych (Nm) pikseli (Rysunek 2B, współczynnik nakładania R). W przeciwieństwie do α-aktyniny, w eksperymentach, w których przeprowadzono znakowanie zinternalizowanych bakterii oraz aktyny lub wimentyny, zaobserwowano sporadyczną kolokalizację z aktyną, natomiast kolokalizacja z wimentyną była rzadka (Rysunek 2B).
Dane przeanalizowano również z wykorzystaniem współczynnika My, który uwzględnia względną liczebność każdej z części. My jest miarą częstotliwości występowania sygnału o większej liczebności (w tym przypadku zielonego, α-aktyniny) za każdym razem, gdy pojawia się sygnał o mniejszej liczebności (w tym przypadku czerwony, bakterie). Miara ta wykazuje uderzający poziom występowania α-aktyniny w sąsiedztwie zinternalizowanych meningokoków (Rysunek 2A i C).
<img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig1.jpg" alt="Schemat mikroskopii konfokalnej przedstawiający struktury komórkowe i markery fluorescencyjne w znakowaniu wielokolorowym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa do oceny wewnątrzkomórkowych interakcji N. meningitidis z α-aktyniną. A-H. Konfluencyjne monowarstwy śródbłonka hodowane na szkiełkach przedmiotowych zainfekowano szczepem N. meningitidis wykazującym ekspresję białka Opc (A-F). Po 8 h wypłukano bakterie nieprzylegające, komórki utrwalono paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Tritonem X-100. Następnie bakterie i α-aktyninę barwiono zgodnie z opisem powyżej (α-aktynina, kolor zielony; bakterie, kolor czerwony).
A-C. Jedno pole widzenia przedstawiające obrazy x-y lokalizacji Nm (A) lub α-aktyniny (B). Obraz nałożony w (C) wskazuje kilka obszarów, w których pojawia się kolor żółto-pomarańczowy, co sugeruje kolokalizację. Strzałki w (A) i (B) pokazują obszary, w których prawdopodobnie nastąpiła wysoka akumulacja α-aktyniny wokół bakterii.
D. Sekcja optyczna zainfekowanej monowarstwy HBMEC wskazująca na kolokalizację wokół bakterii wewnątrzkomórkowych zlokalizowanych u podstawy komórki.
Ponownie, kolokalizacja ta nie wynika z przypadkowej bliskości α-aktyniny, ponieważ ogólne barwienie α-aktyniny w tym obszarze jest słabe.
E i F. Trójwymiarowe obrazy zainfekowanych monowarstw HBMEC przetworzonych w opisany wyżej sposób. Widok pod kątem powierzchni apikalnej (E) pokazuje przylegające bakterie zabarwione na czerwono (czerwona strzałka), podczas gdy kilka bakterii zlokalizowanych w kierunku powierzchni bazalnych komórek śródbłonka (żółta strzałka) ma wyraźny kolor pomarańczowo-żółty. Lokalizacja bazalna jest widoczna wyraźniej na obrazie (F), który stanowi przekrój poprzeczny X-Z widok z końcówki.
G. Obraz z mikroskopu elektronowego N. meningitidis po barwieniu negatywowym, przedstawiający jego przeważającą postać diplokokową. Każdy kok każdy kok ma średnicę około 0,5 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2045/2045fig2.jpg" alt="Mikroskopia lokalizacji białek; α-actinin, Vimentin, Actin; współczynnik nakładania, ekspresja względna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Lokalizacja i rozkład α-actinin, actin oraz vimentin w komórkach HBMEC.
A. Zainfekowane monowarstwy HBMEC traktowano zgodnie z opisem w powyższej legendzie, jednak oprócz α-aktyniny, niektóre szkiełka podstawowe wykorzystano do wykrywania aktyny lub wimentyny w procedurze podobnej do tej zastosowanej dla α-aktyniny. Jak wyżej, α-aktynina skoncentrowała się wokół kilku zinternalizowanych bakterii (białe strzałki). Wimentyna i aktyna nie kolokalizowały z bakteriami w zauważalnym stopniu. Pasek reprezentuje 20 μm.
B. i C. Wartości współczynników R oraz My uzyskano w ponad trzech eksperymentach z wykorzystaniem oprogramowania Volocity zgodnie z powyższym opisem.

<ol><li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells%3B+the+role+of+integrins+in+apical+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li>
<li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells%3A+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li>
<li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li>
<li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li>
<li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li>
<li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images%3A+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Możliwość wiązania wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis wykazujących ekspresję Opc z α-aktyniną zbadano z wykorzystaniem HBMEC, analizując kolokalizację bakterii i białka cytoszkieletowego w zainfekowanych komórkach po 3 i 8 h inkubacji. Za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazano kolokalizację Neisseria meningitidis z α-aktyniną. Warto zauważyć, że choć bakterie zostały wchłonięte do wnętrza komórek w 3 h, w tym punkcie czasowym stwierdzono niewielką kolokalizację z α-aktyniną. Powiązanie bakterii z białkiem cytoszkieletowym wydawało się wymagać dłuższego okresu przebywania wewnątrzkomórkowego, ponieważ po 8 h infekcji znaczna liczba bakterii wykazywała ewidentne bliskie powiązanie z α-aktyniną. Alfa-aktynina jest białkiem wielofunkcyjnym i oddziaływania bakterii z tym elementem cytoszkieletu mogą mieć istotny wpływ na funkcję komórki docelowej, co jest przedmiotem aktualnych badań.
Ilościowe określenie kolokalizacji opisane powyżej wymaga starannego przygotowania preparatów. Szczególną uwagę należy zwrócić na fiksację preparatów, czas blokowania oraz rozcieńczenia przeciwciał. Aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu, każde przeciwciało pierwszo- i drugorzędowe powinno zostać mianowane w eksperymentach wstępnych w celu ustalenia optymalnych stężeń. W naszym doświadczeniu medium montażowe Mowiol pozwoliło na uzyskanie lepszych obrazów.

<table><tbody><tr><td>płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>BC311</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR International</td><td>631-0152</td><td></td></tr><tr><td>AGAR BHI</td><td>LAB M</td><td>LAB048</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE12-167E</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niezbędne Aminokwasy Nieessentialne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>HANK&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWhittaker</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór witamin MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>PBSB</td><td>Lonza Inc.</td><td>BE17-513F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9564</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało&amp;#8209;anty-Nm serum</td><td>Hodowlane</td><td></td><td>Surowica królika</td></tr><tr><td>TRITC przeciwciało przeciwko Ig królika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6778</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała &amp;alpha;&amp;#8209;przeciwciało monoklonalne (mAb) przeciwko aktyninie [7H6]</td><td>Abcam</td><td>Ab32816</td><td>IgG</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne przeciwko aktynie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4700</td><td>IgG2a</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-wimentyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6630</td><td>IgG1</td></tr><tr><td>ALEXA FLUOR 488 przeciwciało&amp;#8209;mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwko mysiej IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;tytuł_jove&quot;&gt;1. Konfokalna mikroskopia skaningowa (CLSM):&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;System obrazowania konfokalnego Leica SP5: system ten, dzięki zastosowaniu kombinacji AOTF (akustooptycznego filtra strojonego) oraz AOBS (akustooptycznego dzielnika wiązki), upraszcza wzbudzanie przy użyciu specyficznych długości fal.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;tytuł_jove&quot;&gt; 2-Oprogramowanie:&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt; Oprogramowanie do mikroskopii konfokalnej Leica LCS, Leica Microsystems, Niemcy.&lt;br/&gt;Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Białko Opc bakterii Neisseria meningitidis (Nm, meningokoki) jest integralnym białkiem błony zewnętrznej eksponowanym na powierzchni, które może pełnić funkcję adhezyny i skutecznej inwazyny dla ludzkich komórek nabłonkowych i śródbłonka. Zidentyfikowaliśmy zlokalizowane na powierzchni śródbłonka integryny jako główne receptory dla Opc; proces ten wymaga, aby Opc najpierw związało się z ligandami integryn, takimi jak witronektyna, a za ich pośrednictwem z receptorami eksponowanymi przez komórkę1. Proces ten prowadzi do inwazji bakteryjnej do komórek śródbłonka2. Niedawno zaobserwowaliśmy interakcję Opc z białkiem o masie 100kDa znalezionym w lizatach całych ludzkich komórek3. Interakcję tę zauważyliśmy początkowo, gdy białka komórek gospodarza rozdzielone elektroforezą i przeniesione na nitrocelulozę poddano inkubacji z Nm eksponującym Opc. Interakcja była bezpośrednia i nie wymagała udziału cząsteczek pośredniczących. Za pomocą spektrometrii mas ustaliliśmy tożsamość tego białka jako α-aktynina. Ponieważ nie stwierdzono obecności α-aktyniny na powierzchni żadnej z ośmiu badanych linii komórkowych, a interakcje Opc z komórkami śródbłonka w obecności surowicy prowadzą do wniknięcia bakterii do komórek docelowych, zbadaliśmy możliwość wewnątrzkomórkowej interakcji tych dwóch białek. W tym celu hodowlane ludzkie komórki śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs) zainfekowano Nm eksponującym Opc przez dłuższy czas, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej badano lokalizację zinternalizowanych bakterii oraz α-aktyniny. Zaobserwowaliśmy zależny od czasu wzrost kolokalizacji Nm z białkiem cytoszkieletowym, który był znaczący po ośmiogodzinnym okresie internalizacji bakterii. Ponadto zastosowanie oprogramowania do obrazowania ilościowego pozwoliło nam uzyskać względną miarę kolokalizacji Nm z α-aktyniną oraz innymi białkami cytoszkieletu. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji i kwantyfikacji kolokalizacji bakterii z białkami wewnątrzkomórkowymi po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka, choć procedura ta ma zastosowanie również do ludzkich komórek nabłonkowych.

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Białko Opc bakterii Neisseria meningitidis (Nm, meningokok) jest integralnym białkiem błony zewnętrznej ekspresowanym na powierzchni, które może pełnić funkcję adhezyny oraz...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena poziomu kolokalizacji zinternalizowanych bakterii, RIA Meningitidis, z białkiem cytoszkieletowym Alpha Actinin. Osiąga się to poprzez zakażanie hodowlanych ludzkich mikro naczyniowych komórek mózgu nocną kulturą bakterii przez okres od trzech do ośmiu godzin, aby umożliwić bakteriom wniknięcie do komórek docelowych. W drugim kroku komórki zawierające wewnątrzkomórkowe bakterie są płukane, utrwalane, a następnie permeabilizowane, co przygotowuje zakażoną kulturę do immunobarwienia zinternalizowanych bakterii oraz wewnątrzkomórkowej alpha actinin.Po wykonaniu obrazowania konfokalnego i zastosowaniu oprogramowania do analizy kolokalizacji można zaobserwować obrazy wewnątrzkomórkowej kolokalizacji oraz uzyskać wyniki ilościowe, które wykazują, że Meninga Croci wykazująca ekspresję OPC, a także białko błonowe, mogą specyficznie oddziaływać z wewnątrzkomórkową alfa-aktyniną na podstawie wizualizacji mikroskopowej konfokalnej i ilościowej analizy kolokalizacji. Cześć, jestem Isel Maria z laboratorium profesora Mata TI w Katedrze Medycyny Komórkowej i Molekularnej na Uniwersytecie w Bri. Dzisiaj przedstawimy procedurę szacowania poziomu kolokalizacji bakterii wewnątrzkomórkowych z białkami cytoszkieletu.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania interakcji grzybni meningitis wykazującej ekspresję białka błonowego OPC z białkiem cytoszkieletowym alfa aktyną. Zatem możemy zacząć. Praca ta powinna być przeprowadzona w odpowiednim laboratorium bezpieczeństwa.Na dwa dni przed procedurą barwienia immunologicznego zaszczep badany szczep bakteryjny na podłożu BHI (brain heart infusion). Płytki agarowe uzupełnione 10% podgrzewaną krwią konia należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w dniu poprzedzającym barwienie immunologiczne. Użyj pętli do posiewów o pojemności 10 µL, aby przygotować zawiesinę z nocnej kultury bakterii.W dwóch mililitrach PBSB pozostaw zawiesinę na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić opadnięcie dużych agregatów bakteryjnych. Następnie przenieś górny jeden mililitr zawiesiny do sterylnej probówki, nie naruszając osadu. Rozpuść bakterie, dodając jeden mililitr 1% SDS i 0,1 M wodorotlenku sodu do dwóch probówek zawierających 20 µL zawiesiny bakteryjnej, a następnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. W celu oszacowania liczby bakterii.Zmierz zawartość kwasów nukleinowych, określając absorbancję roztworu. Przy 216 anters dostosuj gęstość zawiesiny bakteryjnej do wymaganej wartości w medium infekcyjnym przeznaczonym do zakażania ludzkich mikro naczyniowych komórek śródbłonka mózgu. Ludzkie mikro naczyniowe komórki śródbłonka mózgu lub H-B-M-E-C-A wysiane dwa dni przed immunobarwieniem umieść na 16 milimetrowych szklanych lamelkach w dołkach płytki 12-dołkowej i wysiej komórki HBME z 50% konfluencją na lamelkach; inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, a następnego dnia.Zakaź komórki świeżo przygotowaną zawiesiną bakteryjną w naszym laboratorium. Rutynowo stosuje się stosunek zakażenia od 200 do 300 jednostek tworzących kolonie na jedną komórkę docelową. Inkubuj od trzech do ośmiu godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 do końca okresu zakażenia.Przemyj komórki trzykrotnie za pomocą PBS i utrwal je, dodając 500 µL 2% paraformaldehydu na 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu paraformaldehydu przeprowadź permeabilizację utrwalonych komórek, inkubując je w 0,1% Tritonie X 100 rozcieńczonym w PBS przez 10 minut. Na koniec przemyj próbki trzykrotnie PBS i przystąp do immunobarwienia zgodnie z instrukcją. Następnie można jednocześnie przeprowadzić barwienie bakterii wewnątrzkomórkowych oraz α-aktyniny.W płytkach 12-dołkowych zablokować szkiełka przykrywowe zawierające przepuszczalne komórki, używając 500 µl 3% B-S-A-P-B-S-T przez 30 do 60 minut. W temperaturze pokojowej, po przemyciu PBS, przenieść każde szkiełko przykrywowe do nowego suchego dołka w płytce 12-dołkowej. Przeciwciała pierwotne przeciwko bakteriom oraz alfa-aktyninie dodać jednocześnie; wystarczające jest 80 do 100 µL przeciwciała na szkiełko przykrywowe, pod warunkiem ostrożnego dodania w celu pokrycia powierzchni szkiełka. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji dodać 200 µL PBS do dołka, podnieść szkiełko przykrywowe i umieścić je w nowym dołku zawierającym 500 µL PBS. Po pięciu minutach usunąć PBS za pomocą pipety, a następnie dodać świeży PBS. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie i przenieść szkiełka przykrywowe do nowego suchego dołka.Następnie należy dodać odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z różnymi fluorochromami, rozcieńczone w 1%B-S-A-P-B-S-T. Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w ciemności; po zakończeniu inkubacji należy przeprowadzić przemywanie zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, a następnie wybarwić DNA za pomocą DPI przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zakończeniu tej inkubacji należy przemyć szkiełka nakrywki raz w PBS, a następnie zamontować je za pomocą kropli medium montażowego. Zamontowane szkiełka nakrywki powinny być przechowywane w ciemności do momentu ich obserwacji. Próbki z immunoznakowaniem obserwujemy i obrazujemy przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem, połączonego z odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym.Aby rozpocząć procedurę CLSM, nanieś kroplę medium immersyjnego na obiektyw i umieść preparat z szkiełkiem nakrywką na stoliku mikroskopu, przełącz mikroskop w tryb wizualny i zlokalizuj obszar zainteresowania, korzystając z okularów mikroskopu; w tym momencie można przejść do obsługi oprogramowania Leica. Wybierz tryb akwizycji XY z. Do badań kolokalizacji wybierz format 512 na 512.Im wyższa rozdzielczość, tym dokładniejszy obraz. Następnie należy wybrać dwukierunkowy tryb X, który zwiększy prędkość skanowania i pomoże ograniczyć fotoblaknięcie. Skonfiguruj ustawienia skanowania sekwencyjnego.Kliknij w funkcję SEC, a następnie wybierz zakres linii. Wybierz wiązki laserowe zgodnie z fluorochromami sprzężonymi z przeciwciałami wtórnymi: 405 nm dla DPI, 488 nm dla Alexa Fluor 488 oraz 561 nm.W przypadku trixy aktywuj odpowiednio fotopowielacze jeden, dwa i trzy. Ustaw górną i dolną granicę stosu Z lub serii. Następnie ustaw wielkość kroku Z na 0.2 µm.RIA Mencius jest dyplokusm, a ponieważ każdy kaukus ma przybliżoną średnicę 0,5 micrometers, rozmiar kroku Z wynoszący 0,2 micrometers zwiększa prawdopodobieństwo zeskanowania każdego kaukusa co najmniej dwukrotnie. Ustaw końcowe parametry skanowania, wybierając uśrednianie linii dla trzech powtórzeń w celu poprawy stosunku sygnału do szumu, a następnie kliknij start. Obrazy z podwójnym lub potrójnym barwieniem uzyskuje się poprzez sekwencyjne skanowanie przy różnych długościach fal oraz stosując tryb między liniami dla każdego kanału, aby wyeliminować przesłuchy między różnymi chromoforami.Aby wskazać kolokalizację dwóch fluorochromów, wybierz funkcję nakładania (overlay), aby połączyć wybrane kanały w jeden obraz. Na przykład, gdy Alexa 488 oraz trissy Fluor Chromes kolokalizują, w obrazie nałożonym pojawi się kolor żółty. W przypadku konieczności wykonania rekonstrukcji 2D w celu wizualizacji potencjalnej kolokalizacji, skompiluj stos Z lub serię, korzystając z funkcji maksymalnej projekcji (maximum projection). Po uzyskaniu stosu Z lub serii przetwórz dane, aby uzyskać obraz ortogonalny do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji poszczególnych elementów.Ilościowe określenie kolokalizacji jest przeprowadzane przy użyciu oprogramowania Vol City dostarczonego przez IMP. Aby rozpocząć, należy utworzyć bibliotekę z obrazami CLSM, a następnie wybrać opcję rozszerzonego ogniska (extended focus) dla obrazu w górnym pasku. Narzędzie to połączy przekroje Z w jeden obraz 2D przeznaczony do analizy.Teraz wybierz narzędzie KOLOKALIZACJA. Dwa analizowane kanały powinny mieć taką samą głębokość koloru. Wybierz obszar, który ma zostać poddany kwantyfikacji.Ustaw próg odcięcia w celu usunięcia tła. Utwórz wynik kolokalizacji, wybierając opcję generowania kolokalizacji. Statystyki kolokalizacji zostaną wygenerowane dla wcześniej wybranych obszarów zainteresowania.Następnie wybierz współczynniki Mandera R i ny. Na koniec wyeksportuj wartości statystyczne do dokumentu Excel w celu prezentacji danych; przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki obrazowania konfokalnego ludzkich komórek śródbłonka mózgu zainfekowanych meningokokami przez osiem godzin. Lokalizacja bakterii zaznaczona jest kolorem czerwonym.Podczas gdy lokalizacja alfa-aktyniny jest pokazana, zielone strzałki wskazują obszary, w których prawdopodobnie doszło do znacznej akumulacji alfa-aktyniny wokół bakterii. Na tym obrazie nałożonym widocznych jest kilka regionów o kolorze żółto-pomarańczowym, co sugeruje kolokalizację między meninga occi a alfa-aktyniną. Na następnym obrazie sekcja optyczna zainfekowanej monowarstwy H-B-M-E-C wskazuje kolokalizację wokół bakterii wewnątrzkomórkowych znajdujących się u podstawy komórki.Podczas przetwarzania obrazów trójwymiarowych zainfekowanych monowarstw H-B-M-E-C, widok skośny powierzchni apikalnej ukazuje bakterię Durant zabarwioną na czerwono, wskazaną czerwoną strzałką, podczas gdy kilka bakterii zlokalizowanych w kierunku powierzchni bazalnych komórek śródbłonka wskazano żółtą strzałką. Wyraźnie pomarańczowe i żółte zabarwienie w lokalizacji bazalnej jest widoczne bardziej przejrzyście w tym przekroju endon XZ. W przeciwieństwie do eksperymentów z aktyniną, w których przeprowadzono znakowanie zinternalizowanych bakterii oraz mentonu lub aktyny, wykazano sporadyczną kolokalizację z aktyną, lecz rzadką kolokalizację z fermentującymi w komórkach H-B-M-E-C.Jak zaobserwowano w poprzednich eksperymentach, Retin skoncentrował się wokół kilku zinternalizowanych bakterii wskazanych białymi strzałkami. Dane przeanalizowano również w celu uzyskania względnego stopnia pokrycia. Współczynnik R, który według Manda reprezentuje rzeczywiste stopień kolokalizacji IE, czyli liczbę pikseli kolokalizujących się w stosunku do całkowitej liczby pikseli i wartości NY dla alfa-aktyniny, mentingu i aktyny ogółem w H-B-M-E-C zainfekowanych dwojnikami OPC, wykazał pokrycie rein w dwojnikach przekraczające 25%.Współczynnik Y jest miarą częstotliwości występowania sygnału bardziej obfitego rein w każdym przypadku pojawienia się mniej obfitego sygnału meninga cocoa. Pomiar ten wykazuje uderzający poziom występowania alfa aktyniny w sąsiedztwie zinternalizowanych meninga cockeye. Przedstawiamy sposób wizualizacji i kwantyfikacji kolokalizacji zinternalizowanych bakterii z elementami cytoszkieletu w ramach niniejszego eksperymentu.Ważne jest, aby ściśle przestrzegać protokołów utrwalania i barwienia immunocytochemicznego, aby zachować integralność struktur i uniknąć wysokiego tła. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

visualisation-quantification-intracellular-interactions-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualizację i ilościową analizę interakcji wewnątrzkomórkowych między Neisseria meningitidis a ludzkim alfa-aktyniniem przy użyciu konfokalnego obrazowań

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.

Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Poznaj metodę wizualizacji interakcji Neisseria meningitidis z α-aktyniną w komórkach śródbłonka mózgu człowieka przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia ilościową analizę kolokalizacji bakterii z białkiem cytoszkieletowym.

Wizualizacja i kwantyfikacja interakcji wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis i ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Przeglądaj więcej filmów