Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Mikroskopia TIRF z wirującym dyskiem może być użytecznym narzędziem do badania roli białka podczas tworzenia sieci cytoszkieletu. Technika ta pozwoliła na trójwymiarowe obrazowanie szybkich podejść komórkowych zachodzących w komórce, a jednocześnie precyzyjną lokalizację cząsteczek fluorescencyjnych, które są umieszczane na błonie plazmatycznej. Ta metoda może zapewnić wgląd w obszary badawcze, takie jak mikrobiologia, biologia komórki i wszystkie te gałęzie, w których ważne jest badanie interakcji między błoną plazmatyczną a środowiskiem komórkowym.

Metodę tę można rozszerzyć na te eksperymenty obrazowania na żywo, w których ważne jest zlokalizowanie struktur w błonie plazmatycznej i gdzie również chcesz utrzymać wysoką rozdzielczość pozostałej objętości komórkowej. Kluczowymi rzeczami, które należy wziąć pod uwagę, jest wybór odpowiedniej linii komórkowej do ustawienia oświetlenia TIRF i innych parametrów obrazowania oraz znalezienie ogniska transfekowanych komórek. Wizualna demonstracja tego protokołu z pewnością pomogłaby uniknąć problemów z obsługą komórek podczas akwizycji obrazu.

Dwa dni przed eksperymentem należy wysiać 3 000 komórek HELA lub NIH 3T3 w dwóch mililitrach pełnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Następnego dnia przygotuj odczynniki do transfekcji. Najpierw rozcieńczyć jeden mikrogram RFP Livact i jeden mikrogram YFP Vinculin w sumie 200 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy.

Krótko wymieszaj odczynnik do transfekcji. Następnie dodaj cztery mikrolitry mieszaniny do 200 mikrolitrów DNA. Ponownie zwirować odczynniki, a następnie inkubować mieszaninę transfekcji przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji dodaj całą mieszankę transfekcyjną kroplami bezpośrednio do komórek. Wymieszaj studzienki, potrząsając płytką, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze. W dniu eksperymentu przygotuj próbkę do obrazowania na żywo, najpierw pokrywając 35-milimetrowe szklane naczynie dolne roztworem fibronektyny o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS.

Pozostaw roztwór na szklanej powierzchni na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij go i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu. Następnie rozcieńczyć wielofluorescencyjny roztwór kulek o średnicy 0,1 mikrona do gęstości 1,8 miliarda cząstek na mililitr w wodzie destylowanej. Dodaj roztwór do szklanej powierzchni pokrytej fibronektyną na 30 do 60 sekund.

Następnie usuń roztwór i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu. Wstępne powlekanie naczyń koralikami fluorescencyjnymi jest konieczne tylko z dwóch powodów, po pierwsze, jeśli chcesz znaleźć płaszczyznę TIRF przed zasiewem komórek lub uzyskać dwukolorowy obraz koralików w celu rejestracji obrazu. Teraz przygotuj przeciwutleniającą pożywkę wzrostową, dodając 0,1 molowego roztworu kwasu askorbinowego o końcowym stężeniu 0,1 milimola w pożywce wzrostowej.

Podgrzej podłoże, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki dwoma mililitrami PBS i dodaj 250 mikrolitrów trypsyny EDTA do każdego dołka płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i odczekaj dwie do trzech minut, aż komórki zostaną całkowicie odłączone.

Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki przeciwutleniającej i dodać je do dodatkowych czterech mililitrów pożywki w 15-mililitrowej probówce do hodowli komórkowej. Umieść zawiesinę komórek z lekko uchyloną pokrywką w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza buforowanym 5% dwutlenkiem węgla. Na początek rozpocznij kontrolę środowiskową mikroskopu, aby uzyskać stabilne warunki hodowli komórek.

Następnie umieścić naczynie ze szklanym dnem zawierające jeden mililitr podgrzanego przeciwutleniającego podłoża wzrostowego w uchwycie na próbkę podgrzanego mikroskopu. Następnie w oprogramowaniu do obrazowania skonfiguruj ustawienia akwizycji w mikroskopie. Ustaw interwał czasu akwizycji na 30 sekund, a czas trwania na od 60 do 90 minut.

Aktywuj także funkcję autofokusa sprzętowego autofokusa dla każdego punktu czasowego, ustawiając wartość na jeden. Teraz dostosuj ekspozycję kamery do 200 milisekund, poziom wzmocnienia do 500, a moc lasera do 20% dla każdego kanału. Wysokie poziomy wzmocnienia, krótki czas ekspozycji i niska moc lasera są zalecane w celu zmniejszenia fototoksyczności.

Następnie ustaw stos Z dla kanałów wirujących dysków na 10 mikronów z odstępem 0,4 mikrona, a następnie ustaw dolne przesunięcie na zero, tak aby najniższa płaszczyzna była pozycją ostrości sprzętowego autofokusa i dezaktywuj stosy Z dla kanałów TIRF. Na koniec aktywuj pozycje stolików z funkcją wielopunktową. Pozwoli to na zarejestrowanie do trzech pozycji w 30-sekundowym interwale.

Teraz znajdź koraliki fluorescencyjne z oświetleniem epifluorescencyjnym, aktywuj jeden kanał TIRF i ustaw kąt oświetlenia na wartość oznaczającą oświetlenie TIRF. Następnie aktywuj autofokus, naciskając przycisk na panelu mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła offsetowego. Po ustawieniu ostrości uzyskaj dwukolorowy zestaw danych za pomocą TIRF 488 i TIRF 561 w celu późniejszej rejestracji obrazu na podstawie koralików.

Wyjmij komórki z inkubatora i wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając zamkniętą probówkę dwa do trzech razy. Następnie nałóż jeden mililitr komórek na naczynie do obrazowania. Szybko znajdź podwójnie transfekowane komórki z niskim poziomem oświetlenia epifluorescencyjnego.

Po znalezieniu wyśrodkuj komórki w podglądzie kamery na żywo, korzystając z oświetlenia jasnego pola i zaznacz pozycję. Następnie znajdź dodatkowe jedno lub dwa interesujące miejsca, zapisz je na liście pozycji i rozpocznij zbieranie danych, klikając przycisk sekwencji. Na początku komórki mogą się łatwo odłączyć z powodu ruchu sceny, więc lepiej jest ustawić cztery do pięciu pozycji, a później odrzucić jedną lub dwie.

Aby wygenerować hyperstack bez rejestracji na Fidżi, najpierw pobierz i zapisz dostarczony plik SD-TIRF_helper_jove. ijm w podfolderze Fidżi makra. Uruchom makro, klikając polecenie menu, zaczynając od wtyczek, następnie makra i na końcu uruchom.

Jeśli kanały kolorów wymagają korekty pasowania, wybierz tę opcję i utwórz nowe odniesienie pasowania oparte na ściegach, znane jako plik punktu orientacyjnego. Następnie zaimportuj dane za pomocą importera bioformatów i wybierz hyperstack jako opcję przeglądania. Załaduj zestaw danych obrazu, wybierz serię obracających się dysków w pierwszym kroku i serię TIRF w drugim kroku.

W tym momencie Fidżi wyświetli dane posortowane według kanału i pozycji etapu. Zastosuj korektę rejestracji do odpowiednich kanałów, wczytując wcześniej określony plik punktu orientacyjnego. Następnie wybierz żądaną tabelę wyszukiwania kolorów dla każdego obracającego się dysku i kanału TIRF i połącz je w jeden wielowymiarowy hiperstos

Podczas przetwarzania obrazów TIRF, pewna liczba płaszczyzn zed jest dodawana do dolnej płaszczyzny, a liczba ta odpowiada liczbie płaszczyzn w zestawach danych obracającego się dysku. Jest to bardzo ważne dla wizualnej reprezentacji końcowego hyperstacku. Korzystając z konfiguracji opisanej w tym filmie, wybrano komórki z ekspresją YFP i RFP, a proces ich adhezji obserwowano podczas 60-minutowego timelapse.

Zgodnie z oczekiwaniami, komórki miały okrągły kształt i tylko na początku słabo przylegały, a wypukłości błony wyczuwały otoczenie i stykały się z podłożem. Kontakt z macierzą komórkową wzmacniał się szybko po powstaniu tzw. powstających zrostów. Z biegiem czasu kompleksy adhezyjne powiększały się i dojrzewały do zrostów ogniskowych.

Te wydłużone struktury były widoczne głównie na obrzeżach komórki. Wynikało to z sił wywieranych przez włókna aktomiozyny, które indukowały wzmacnianie zrostów macierzy komórkowej, a także wiązanie włókien aktynowych. Komórka również spłaszczyła się w wyniku tworzenia sieci aktyny.

Szybkość akwizycji jest zależna od następujących parametrów: interwału czasowego, czasu naświetlania, liczby płaszczyzn zena i liczby pozycji. Dlatego bardzo ważne jest, aby zoptymalizować te parametry pod kątem wysokich wskaźników akwizycji. Wdrożenie najnowszej technologii wirującego dysku zamieni mikroskopię TIRF z wirującym dyskiem w nową technikę mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, która umożliwi obrazowanie w wysokich szybkościach czasowych.

Mikroskopia wirującego dysku jest bardzo potężną techniką badania procesów zachodzących między wnętrzem komórki a błoną komórkową. Pokazano nam, że możemy śledzić dynamikę pęcherzyków, uzyskując bardzo duże stosy obrazów w ciągu kilku sekund. Skolimowane światło lasera jest niebezpieczne dla oczu.

Nigdy nie patrz bezpośrednio w wiązkę i stosuj środki ostrożności instrumentu, aby uniknąć bezpośredniej ekspozycji na światło.