Name: Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj zaawansowaną mikroskopię TIRF z dyskiem obrotowym do obrazowania żywych komórek w trzech wymiarach. Ta technika umożliwia precyzyjną lokalizację białek w błonie komórkowej i badanie dynamiki cytoszkieletu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo dziękujemy społeczności naukowej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf za wsparcie nas próbkami do oceny. Mianowicie dziękujemy Sabine Windhorst za komórki NIH3T3, Andrei Mordhorst za YFP-Vinculin i Maren Rudolph za RFP-Lifeact.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Dwa dni przed eksperymentem wysiewaj 3*105 komórek HeLa lub NIH3T3 w 2 ml pełnego podłoża wzrostowego na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Upewnij się, że komórki są obsługiwane w okapie z przepływem laminarnym przez cały czas trwania tego protokołu.</li>
	<li>Na dzień przed eksperymentem należy przygotować odczynniki do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta lub empirycznie ustalonym protokołem, np.:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 μg RFP-Lifeact i 1 μg YFP-Vinculin w sumie 200 μl zredukowanej pożywki surowicy. Krótko odczynnik do transfekcji należy krótko przemieszać, dodać 4 μl do 200 μl DNA i ponownie przetrząsnąć. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj całą mieszankę transfekcyjną kroplami bezpośrednio do komórek. Wymieszać, potrząsając płytką i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu eksperymentu przygotuj próbkę do obrazowania na żywo:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml w PBS, aby pokryć szklaną powierzchnię naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm. Używaj tylko wysokiej jakości szkiełek nakrywkowych ze szkła o grubości 0,17 mm, aby uzyskać optymalną wydajność TIRF i unikaj plastikowych naczyń dolnych. Pozostaw roztwór na szklanej powierzchni na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij go i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór kulek wielofluorescencyjnych o stężeniu 0,1 μm do gęstości 1,8 x10,9 cząstek na ml w wodzie destylowanej i dodawać roztwór przez 30-60 s do powierzchni szkła pokrytego fibronektyną. Natychmiast usuń roztwór i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu. 
		UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy płaszczyzna TIRF powinna zostać znaleziona przed zasiewem komórek i/lub w celu uzyskania 2-kolorowego obrazu referencyjnego do rejestracji obrazu opartego na koralikach.</li>
		<li>Przygotować 0,1 M roztwór kwasu askorbinowego (AA) i rozcieńczyć go do końcowego stężenia 0,1 mM w pożywce wzrostowej (pożywka AA). Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Jeśli to możliwe, użyj pożywki do hodowli komórkowych zoptymalizowanej pod kątem fluorescencji, takiej jak pożywka wolna od fenolronów i o zredukowanej (rybo-) flawinie. AA jest środkiem przeciwutleniającym, który może zmniejszyć efekty fototoksyczne podczas obrazowania na żywo14. Przetestowaliśmy to z powodzeniem w tym teście, tj. więcej komórek wydawało się zdrowych w zastosowanych warunkach niż bez dodatku AA. Jednak pH pożywki zostało obniżone o 0,17 jednostki pH.</li>
		<li>Umyj komórki 2 ml PBS, dodaj 250 μl trypsyny-EDTA i poczekaj, aż komórki całkowicie się odłączą (2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C). Ostrożnie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki AA za pomocą pipety i dodać ją do 4 ml pożywki AA w probówce do hodowli komórkowych o pojemności 15 ml. Umieścić zawiesinę komórek z lekko uchyloną pokrywką w inkubatorze nastawionym na 37 °C i 5% CO2 w pobliżu mikroskopu.</li>
		<li>Dodaj 1 ml podgrzanej pożywki AA do naczynia ze szklanym dnem i umieść je w uchwycie podgrzanego mikroskopu (patrz następny akapit).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Rozpocznij kontrolę otoczenia mikroskopu, aby uzyskać stabilną temperaturę 37 °C, 5% CO2 i wilgotną atmosferę. 
	UWAGA: W tym przypadku zastosowano małą komorę inkubacyjną z górnym stopniem, która umożliwiła stabilne ustawienia w ciągu około 15 minut. Większe inkubatory będą potrzebowały więcej czasu, aby osiągnąć stabilne warunki.</li>
	<li>Ustal wszystkie ustawienia akwizycji pod mikroskopem przed nałożeniem zawiesiny komórek:
	<ol>
		<li>Ustaw przedział czasowy na 30 s, a czas trwania na 60-90 min. Aktywuj funkcję automatycznego ustawiania ostrości sprzętowego autofokusa dla każdego punktu czasowego (wartość "1").</li>
		<li>Dostosuj ekspozycję i wzmocnienie kamery, a także moc lasera dla każdego kanału. Wysokie poziomy wzmocnienia, krótki czas naświetlania i niska moc lasera są zalecane w celu zmniejszenia fototoksyczności. 
		UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały uzyskane przy ekspozycji 200 ms, poziomie wzmocnienia 500 i 20% mocy lasera, która odpowiada intensywności wzbudzenia odpowiednio 0,5 W/cm² dla 488 nm i 1 W/cm² dla 561 nm.</li>
		<li>Ustaw stos z dla kanałów wirującego dysku na 10 μm z odstępem 0,4 μm. Dezaktywuj stosy z dla kanałów TIRF. Ustaw dolne przesunięcie na "0", tj. najniższa płaszczyzna będzie pozycją ostrości sprzętowego autofokusa.</li>
		<li>Aktywuj funkcję wielopunktową "pozycje stolika". 
		UWAGA: W 30-sekundowym przedziale czasu można zarejestrować do 3 pozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź koraliki fluorescencyjne z oświetleniem epifluorescencyjnym przy oczce lub na ekranie komputera, a następnie aktywuj jeden kanał TIRF i ustaw kąt oświetlenia na wartość oznaczającą oświetlenie TIRF. Aktywuj autofokus, naciskając przycisk na panelu mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła offsetowego. Uzyskaj zestaw danych 2-kolorowych, tj. TIRF-488 i TIRF-561, w celu późniejszej rejestracji obrazu na podstawie koralików (patrz punkt 3.1).
	<ol>
		<li>Opcjonalnie: Aby zapewnić oświetlenie TIRF, dodać kilka mikrolitrów swobodnie unoszącej się zawiesiny fluorescencyjnych wielokolorowych kulek (patrz punkt 1.3.2.). Aktywuj podgląd na żywo kanału TIRF i zwiększ kąt oświetlenia. Nieprzylegające koraliki znikną poza kątem krytycznym, zapewniając prawidłowe oświetlenie TIRF8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając zamkniętą probówkę 2-3 razy i nałóż 1 ml komórek do naczynia do obrazowania.</li>
	<li>Szybko znajdź podwójnie transfekowane komórki z niskim poziomem oświetlenia epifluorescencyjnego. Wyśrodkuj komórki w podglądzie kamery na żywo za pomocą jasnego oświetlenia pola i zaznacz pozycję. Znajdź kolejne 1-2 interesujące miejsca i zapisz je na liście pozycji. 
	UWAGA: Na początku komórki mogą łatwo się odłączyć z powodu ruchu sceny, dlatego ustaw 4-5 pozycji i ponownie sprawdź wszystko przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. Następnie odrzuć 1-2 pozycje.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie danych, klikając przycisk "Sekwencja".</li>
</ol>
3. Przetwarzanie końcowe obrazu w ImageJ
<ol>
	<li>W celu wygenerowania hiperstosu bez rejestracji w FIJI15, napisano makro o nazwie "SD-TIRF_helper", które można zastosować do 2-4 kanałowych zestawów danych poklatkowych SD-TIRF. Zapisz plik "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" w podfolderze FIJI "makra" i uruchom makro klikając na polecenie menu "Wtyczki>Makra>Uruchom...".
	<ol>
		<li>Jeśli kanały kolorów wymagają korekty pasowania, wybierz tę opcję i utwórz nowe odniesienie pasowania oparte na ściegach (plik punktu orientacyjnego) lub użyj istniejącego pliku, który został utworzony wcześniej. 
		UWAGA: Wtyczka turboreg 16 zostanie zastosowana do obrazów referencyjnych koralików fluorescencyjnych. Zainstaluj wtyczkę w oprogramowaniu FIJI zgodnie z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi instalacji wtyczek.</li>
		<li>Zaimportuj dane za pomocą importera formatów biologicznych i wybierz hyperstack jako opcję przeglądania. Załaduj zestaw danych obrazu, wybierz serię SD w pierwszym kroku i serię TIRF w drugim kroku. FIJI wyświetli dane posortowane według kanału i pozycji etapu, tj. zwykle wszystkie kanały SD i wszystkie kanały TIRF pojawiają się jako jeden hyperstack dla każdej wybranej pozycji etapu. 
		UWAGA: Import danych jest możliwy z różnych typów plików, na przykład serii TIFF lub typów plików zależnych od platformy, takich jak *.nd. Typ pliku nie może zostać rozpoznany tylko wtedy, gdy nie został wyeksportowany przez oprogramowanie do akwizycji jako niezależny format TIFF bez kompresji.</li>
		<li>Zastosuj korektę rejestracji do odpowiednich kanałów, wczytując wcześniej określony plik punktów orientacyjnych.</li>
		<li>Wybierz żądaną tabelę wyszukiwania kolorów (LUT) dla każdego kanału SD i TIRF i połącz je w jeden, wielowymiarowy hyperstack. 
		UWAGA: Podczas przetwarzania kanałów TIRF pewna liczba płaszczyzn z o zerowych wartościach intensywności jest dodawana na górze dolnej płaszczyzny, która jest zgodna z liczbą płaszczyzn z w zestawie danych SD. Ten krok jest ważny dla wizualizacji końcowego hyperstacka. Ta metodologia jest poprawna, ponieważ głębokość oświetlenia TIRF (mniej niż 200 nm7) jest mniejsza niż rozmiar kroku z stosu SD (400 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li>
<li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).</li>
<li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li>
<li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+%CE%B1-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li>
<li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
<li>Chen, B. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li>
<li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy przedstawiono pierwsze udane zastosowanie mikroskopii SD i TIRF w konfiguracji odpowiedniej do wykonywania eksperymentów obrazowania żywych komórek, tj. uzyskano wysokie wskaźniki akwizycji, takie jak 2 stosy obrazów SD-TIRF na minutę w 3 różnych pozycjach stolika, co odpowiada łącznie 168 klatkom (około 3 klatki na sekundę). Nieliczne mikroskopy SD-TIRF, które zostały opisane wcześniej12,13, to przede wszystkim brak wystarczająco dużej prędkości...

W naszych czasach techniki mikroskopii świetlnej zapewniające obrazowanie w wysokiej/super rozdzielczości w nieruchomych i żywych próbkach szybko się rozwijają. Techniki superrozdzielcze, takie jak odpowiednio wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM) i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM) lub bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), są dostępne na rynku i umożliwiają obrazowanie struktur subkomórkowych ukazujących szczegóły niemal w skali molekularnej1,2,3,4,5,6. Jednak podejścia te nadal mają ograniczone zastosowanie w eksperymentach obrazowania na żywo, w których duże objętości muszą być wizualizowane z prędkością akwizycji wielu klatek na sekundę. Odmiany wysoce dynamicznych procesów regulowanych przez błonę plazmatyczną, np. endo-/egzocytoza, adhezja, migracja lub sygnalizacja, zachodzą z dużą prędkością w dużych objętościach komórkowych. Niedawno, aby wypełnić tę lukę, zaproponowano zintegrowaną technikę mikroskopii o nazwie spinning disk-TIRF (SD-TIRF)7. Szczegółowo, mikroskopia TIRF pozwala na specyficzną izolację i lokalizację błony plazmatycznej8,9, podczas gdy mikroskopia SD jest jedną z najbardziej czułych i szybkich technik obrazowania na żywo do wizualizacji i śledzenia organelli subkomórkowych w cytoplazmie10,11. Połączenie obu technik obrazowania w jednym ustawieniu zostało już zrealizowane w przeszłości12,13, jednak prezentowany tutaj mikroskop (Rysunek 1) ostatecznie spełnia kryteria wykonywania eksperymentów obrazowania na żywo SD-TIRF wyżej wymienionych procesów z prędkością 3 klatek na sekundę. Ponieważ mikroskop ten jest dostępny na rynku, celem tego manuskryptu jest szczegółowe opisanie i dostarczenie narzędzi i protokołów open source do akwizycji, rejestracji i wizualizacji obrazów związanych z mikroskopią SD-TIRF.
Konfiguracja opiera się na odwróconym mikroskopie podłączonym do dwóch jednostek skanujących za pomocą niezależnych portów - lewy port jest połączony z modułem SD, a tylny port z modułem skanera dla eksperymentów TIRF i fotoaktywacji/wybielania. Do wzbudzenia można użyć do 6 laserów (405/445/488/515/561/640 nm). Do wzbudzenia i detekcji sygnału fluorescencji zastosowano odpowiednio obiektyw TIRF 100x/NA1.45 oil lub 60x/NA1.49 oil. Emitowane światło jest rozdzielane przez zwierciadło dichroiczne (561 nm długoprzepustowe lub 514 nm długoprzepustowe) i filtrowane przez różne filtry pasmowo-przepustowe (o szerokości 55 nm wyśrodkowane przy 525 nm, o szerokości 54 nm wyśrodkowane przy 609 nm odpowiednio dla zielonej i czerwonej fluorescencji) umieszczone przed dwiema kamerami EM-CCD. Należy pamiętać, że więcej szczegółów technicznych dotyczących konfiguracji znajduje się w Zobiak i wsp.7. W konfiguracji TIRF, jednostka SD jest przesuwana poza ścieżkę światła w ciągu około 0,5 sekundy, dzięki czemu te same dwie kamery mogą być używane do wykrywania, co pozwala na szybsze przełączanie między dwoma modalnościami obrazowania w porównaniu do około 1 s, które było zgłaszane w przeszłości13. Ta funkcja umożliwia jednoczesną akwizycję dwukanałową, dzięki czemu można wykonać 4-kanałowe obrazowanie SD-TIRF z niespotykaną wcześniej szybkością i dokładnością. Co więcej, wyrównanie między obrazami SD i TIRF nie jest konieczne. Wyrównanie obrazu między dwiema kamerami musi być jednak sprawdzone przed rozpoczęciem eksperymentu i w razie potrzeby skorygowane. W poniższym protokole procedura korekcji rejestracji została zaimplementowana w samodzielnie napisanym makrze ImageJ. Co więcej, makro zostało zaprojektowane głównie tak, aby umożliwić jednoczesną wizualizację zbiorów danych SD i TIRF pomimo ich różnej wymiarowości. Samo oprogramowanie do akwizycji nie zapewniało tych funkcji.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop i akcesoria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-TIRF Mikroskop</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti z doskonałym systemem ustawiania ostrości</td><td>Nikon</td><td></td><td>Odwrócony statyw</td></tr><tr><td>mikroskopowy CSU-W1 T2</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Wirujący dysk w konfiguracji z dwoma kamerami</td></tr><tr><td>iLAS2&nbsp;</td><td>Skaner TIRF/FRAP</td> <td>firmy Roper Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Evolve&nbsp;</td><td>Kamery Photometrix</td><td></td><td>EM-CCD</td></tr><tr><td>Stopień PiezoZ</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>Zmotoryzowany stopień</td></tr><tr><td>Z Bioprecision2 Stopień XY</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>Zmotoryzowany stopień XY</td></tr><tr><td>Górna komora inkubacyjna</td><td>Okolab</td><td>Bold Line</td><td>Temperatura, CO2 i wilgotność</td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa komórki raka szyjki macicy</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 fibroblasty</td><td>DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle + GlutaMAX-I (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Zredukowana pożywka w surowicy</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (PenStrep)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Pełna pożywka (DMEM uzupełniona o 10% FCS i 1% PenStrep)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td>Transfekcja odczynnik</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy (AA)</td><td>Sigma</td><td>A544-25G</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>35mm, 0.17mm szkło nakrywkowe</td></tr><tr><td>Fibronektyna, osocze bydlęce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer ulepszona komora</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki TetraSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RFP-Lifeact</td><td></td><td></td><td>Maren Rudolph, Instytut Mikrobiologii Medycznej, Uniwersyteckie Centrum Medyczne Hamburg Eppendorf, Niemcy</td></tr><tr><td>YFP-Vinculin</td><td></td><td></td><td>Andrea Mordhorst, Instytut Mikrobiologii Medycznej, Uniwersyteckie Centrum Medyczne w Hamburgu Eppendorf, Niemcy<</td></tr><tr><td>strong>Software i wtyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td>Version 3</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Version 1.52c</td></tr><tr><td>Wtyczka</td><td></td><td></td> Turboreg <td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr> <tr><td>Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"</td><td>ta publikacja</td><td></td><td>https://github.com/bzobiak/ImageJ</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Wersja 6.2.2</td></tr></tbody></table>

wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

W żywych komórkach procesy takie jak tworzenie się adhezji obejmują rozległe zmiany strukturalne w błonie plazmatycznej i wnętrzu komórki. Aby zobrazować te wysoce dynamiczne zdarzenia, połączono dwie uzupełniające się techniki mikroskopii świetlnej, które umożliwiają szybkie obrazowanie żywych próbek: mikroskopię wirującego dysku (SD) do szybkiego rejestrowania objętości w wysokiej rozdzielczości oraz mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do precyzyjnej lokalizacji i wizualizacji błony plazmatycznej. Zaprezentowany zostanie kompleksowy i kompletny protokół obrazowania, który poprowadzi nas przez proces przygotowania próbki, kalibracji mikroskopu, tworzenia i akwizycji obrazu, co zaowocuje wielokolorowymi seriami obrazowania na żywo SD-TIRF o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Wszystkie niezbędne kroki przetwarzania obrazu w celu wygenerowania wielowymiarowych zestawów danych obrazowania na żywo, tj. rejestracja i kombinacja poszczególnych kanałów, są dostarczane w samodzielnie napisanym makrze dla oprogramowania open source ImageJ. Obrazowanie białek fluorescencyjnych podczas inicjacji i dojrzewania kompleksów adhezyjnych, a także tworzenie sieci cytoszkieletu aktyny, wykorzystano jako dowód słuszności tego nowatorskiego podejścia. Połączenie mikroskopii 3D o wysokiej rozdzielczości i TIRF zapewniło szczegółowy opis tych złożonych procesów zachodzących w środowisku komórkowym, a jednocześnie precyzyjną lokalizację cząsteczek związanych z błoną, wykrytych przy wysokim stosunku sygnału do tła.

Aby wykazać potencjał obrazowania SD-TIRF, opracowano test, który miał ujawnić organizację przestrzennie-czasową kompleksów adhezyjnych komórka-macierz oraz ich interakcję z cytoszkieletem podczas adhezji komórkowej. W związku z tym adherentne komórki HeLa lub alternatywnie NIH3T3 przetransfekowano plazmidami YFP-Vinculin oraz RFP-Lifeact na 18-24 h, poddano trypsynizacji, a następnie wysiano na szalki z dna szklanego pokryte fibronektyną. Linie komórkowe te wybrano ze względu na wyraźny ...

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Mikroskopia TIRF z wirującym dyskiem może być użytecznym narzędziem do badania roli białka podczas tworzenia sieci cytoszkieletu. Technika ta pozwoliła na trójwymiarowe obrazowanie szybkich podejść komórkowych zachodzących w komórce, a jednocześnie precyzyjną lokalizację cząsteczek fluorescencyjnych, które są umieszczane na błonie plazmatycznej. Ta metoda może zapewnić wgląd w obszary badawcze, takie jak mikrobiologia, biologia komórki i wszystkie te gałęzie, w których ważne jest badanie interakcji między błoną plazmatyczną a środowiskiem komórkowym.Metodę tę można rozszerzyć na te eksperymenty obrazowania na żywo, w których ważne jest zlokalizowanie struktur w błonie plazmatycznej i gdzie również chcesz utrzymać wysoką rozdzielczość pozostałej objętości komórkowej. Kluczowymi rzeczami, które należy wziąć pod uwagę, jest wybór odpowiedniej linii komórkowej do ustawienia oświetlenia TIRF i innych parametrów obrazowania oraz znalezienie ogniska transfekowanych komórek. Wizualna demonstracja tego protokołu z pewnością pomogłaby uniknąć problemów z obsługą komórek podczas akwizycji obrazu.Dwa dni przed eksperymentem należy wysiać 3 000 komórek HELA lub NIH 3T3 w dwóch mililitrach pełnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Następnego dnia przygotuj odczynniki do transfekcji. Najpierw rozcieńczyć jeden mikrogram RFP Livact i jeden mikrogram YFP Vinculin w sumie 200 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy.Krótko wymieszaj odczynnik do transfekcji. Następnie dodaj cztery mikrolitry mieszaniny do 200 mikrolitrów DNA. Ponownie zwirować odczynniki, a następnie inkubować mieszaninę transfekcji przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji dodaj całą mieszankę transfekcyjną kroplami bezpośrednio do komórek. Wymieszaj studzienki, potrząsając płytką, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze. W dniu eksperymentu przygotuj próbkę do obrazowania na żywo, najpierw pokrywając 35-milimetrowe szklane naczynie dolne roztworem fibronektyny o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS.Pozostaw roztwór na szklanej powierzchni na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij go i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu. Następnie rozcieńczyć wielofluorescencyjny roztwór kulek o średnicy 0,1 mikrona do gęstości 1,8 miliarda cząstek na mililitr w wodzie destylowanej. Dodaj roztwór do szklanej powierzchni pokrytej fibronektyną na 30 do 60 sekund.Następnie usuń roztwór i pozostaw naczynie do wyschnięcia na powietrzu. Wstępne powlekanie naczyń koralikami fluorescencyjnymi jest konieczne tylko z dwóch powodów, po pierwsze, jeśli chcesz znaleźć płaszczyznę TIRF przed zasiewem komórek lub uzyskać dwukolorowy obraz koralików w celu rejestracji obrazu. Teraz przygotuj przeciwutleniającą pożywkę wzrostową, dodając 0,1 molowego roztworu kwasu askorbinowego o końcowym stężeniu 0,1 milimola w pożywce wzrostowej.Podgrzej podłoże, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki dwoma mililitrami PBS i dodaj 250 mikrolitrów trypsyny EDTA do każdego dołka płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i odczekaj dwie do trzech minut, aż komórki zostaną całkowicie odłączone.Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki przeciwutleniającej i dodać je do dodatkowych czterech mililitrów pożywki w 15-mililitrowej probówce do hodowli komórkowej. Umieść zawiesinę komórek z lekko uchyloną pokrywką w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza buforowanym 5% dwutlenkiem węgla. Na początek rozpocznij kontrolę środowiskową mikroskopu, aby uzyskać stabilne warunki hodowli komórek.Następnie umieścić naczynie ze szklanym dnem zawierające jeden mililitr podgrzanego przeciwutleniającego podłoża wzrostowego w uchwycie na próbkę podgrzanego mikroskopu. Następnie w oprogramowaniu do obrazowania skonfiguruj ustawienia akwizycji w mikroskopie. Ustaw interwał czasu akwizycji na 30 sekund, a czas trwania na od 60 do 90 minut.Aktywuj także funkcję autofokusa sprzętowego autofokusa dla każdego punktu czasowego, ustawiając wartość na jeden. Teraz dostosuj ekspozycję kamery do 200 milisekund, poziom wzmocnienia do 500, a moc lasera do 20% dla każdego kanału. Wysokie poziomy wzmocnienia, krótki czas ekspozycji i niska moc lasera są zalecane w celu zmniejszenia fototoksyczności.Następnie ustaw stos Z dla kanałów wirujących dysków na 10 mikronów z odstępem 0,4 mikrona, a następnie ustaw dolne przesunięcie na zero, tak aby najniższa płaszczyzna była pozycją ostrości sprzętowego autofokusa i dezaktywuj stosy Z dla kanałów TIRF. Na koniec aktywuj pozycje stolików z funkcją wielopunktową. Pozwoli to na zarejestrowanie do trzech pozycji w 30-sekundowym interwale.Teraz znajdź koraliki fluorescencyjne z oświetleniem epifluorescencyjnym, aktywuj jeden kanał TIRF i ustaw kąt oświetlenia na wartość oznaczającą oświetlenie TIRF. Następnie aktywuj autofokus, naciskając przycisk na panelu mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą pokrętła offsetowego. Po ustawieniu ostrości uzyskaj dwukolorowy zestaw danych za pomocą TIRF 488 i TIRF 561 w celu późniejszej rejestracji obrazu na podstawie koralików.Wyjmij komórki z inkubatora i wymieszaj zawiesinę komórek, odwracając zamkniętą probówkę dwa do trzech razy. Następnie nałóż jeden mililitr komórek na naczynie do obrazowania. Szybko znajdź podwójnie transfekowane komórki z niskim poziomem oświetlenia epifluorescencyjnego.Po znalezieniu wyśrodkuj komórki w podglądzie kamery na żywo, korzystając z oświetlenia jasnego pola i zaznacz pozycję. Następnie znajdź dodatkowe jedno lub dwa interesujące miejsca, zapisz je na liście pozycji i rozpocznij zbieranie danych, klikając przycisk sekwencji. Na początku komórki mogą się łatwo odłączyć z powodu ruchu sceny, więc lepiej jest ustawić cztery do pięciu pozycji, a później odrzucić jedną lub dwie.Aby wygenerować hyperstack bez rejestracji na Fidżi, najpierw pobierz i zapisz dostarczony plik SD-TIRF_helper_jove. ijm w podfolderze Fidżi makra. Uruchom makro, klikając polecenie menu, zaczynając od wtyczek, następnie makra i na końcu uruchom.Jeśli kanały kolorów wymagają korekty pasowania, wybierz tę opcję i utwórz nowe odniesienie pasowania oparte na ściegach, znane jako plik punktu orientacyjnego. Następnie zaimportuj dane za pomocą importera bioformatów i wybierz hyperstack jako opcję przeglądania. Załaduj zestaw danych obrazu, wybierz serię obracających się dysków w pierwszym kroku i serię TIRF w drugim kroku.W tym momencie Fidżi wyświetli dane posortowane według kanału i pozycji etapu. Zastosuj korektę rejestracji do odpowiednich kanałów, wczytując wcześniej określony plik punktu orientacyjnego. Następnie wybierz żądaną tabelę wyszukiwania kolorów dla każdego obracającego się dysku i kanału TIRF i połącz je w jeden wielowymiarowy hiperstos.Podczas przetwarzania obrazów TIRF, pewna liczba płaszczyzn zed jest dodawana do dolnej płaszczyzny, a liczba ta odpowiada liczbie płaszczyzn w zestawach danych obracającego się dysku. Jest to bardzo ważne dla wizualnej reprezentacji końcowego hyperstacku. Korzystając z konfiguracji opisanej w tym filmie, wybrano komórki z ekspresją YFP i RFP, a proces ich adhezji obserwowano podczas 60-minutowego timelapse.Zgodnie z oczekiwaniami, komórki miały okrągły kształt i tylko na początku słabo przylegały, a wypukłości błony wyczuwały otoczenie i stykały się z podłożem. Kontakt z macierzą komórkową wzmacniał się szybko po powstaniu tzw. powstających zrostów. Z biegiem czasu kompleksy adhezyjne powiększały się i dojrzewały do zrostów ogniskowych.Te wydłużone struktury były widoczne głównie na obrzeżach komórki. Wynikało to z sił wywieranych przez włókna aktomiozyny, które indukowały wzmacnianie zrostów macierzy komórkowej, a także wiązanie włókien aktynowych. Komórka również spłaszczyła się w wyniku tworzenia sieci aktyny.Szybkość akwizycji jest zależna od następujących parametrów: interwału czasowego, czasu naświetlania, liczby płaszczyzn zena i liczby pozycji. Dlatego bardzo ważne jest, aby zoptymalizować te parametry pod kątem wysokich wskaźników akwizycji. Wdrożenie najnowszej technologii wirującego dysku zamieni mikroskopię TIRF z wirującym dyskiem w nową technikę mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, która umożliwi obrazowanie w wysokich szybkościach czasowych.Mikroskopia wirującego dysku jest bardzo potężną techniką badania procesów zachodzących między wnętrzem komórki a błoną komórkową. Pokazano nam, że możemy śledzić dynamikę pęcherzyków, uzyskując bardzo duże stosy obrazów w ciągu kilku sekund. Skolimowane światło lasera jest niebezpieczne dla oczu.Nigdy nie patrz bezpośrednio w wiązkę i stosuj środki ostrożności instrumentu, aby uniknąć bezpośredniej ekspozycji na światło.

visualizing-adhesion-formation-cells-means-advanced-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Topologię adhezji komórek do podłoża mierzy się z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM).

Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj zaawansowaną mikroskopię TIRF z dyskiem obrotowym do obrazowania żywych komórek w trzech wymiarach. Ta technika umożliwia precyzyjną lokalizację białek w błonie komórkowej i badanie dynamiki cytoszkieletu.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Przeglądaj więcej filmów