Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV
12 stycznia 2016
Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian w sieciach naczyń włosowatych kory mózgowej po długotrwałej ekspozycji na wirotoksynę HIV, tat. Metoda ta może pomóc w zbadaniu kluczowych zmian w morfologii naczyń włosowatych kory, które mogą przyczyniać się do patogenezy zaburzeń neurpoznawczych związanych z HIV. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na fizjologicznie dokładną kwantyfikację wielu parametrów morfologicznych naczyń włosowatych.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat patogenezy zaburzeń neuropoznawczych powiązanych z HIV, można ją również zastosować w przypadku innych chorób, w których występują zmiany naczyniowe, takich jak choroba Alzheimera. Rozpocznij tę procedurę od nałożenia żelu do sztucznych łez na oczy znieczulonej myszy.
Następnie należy ogolić głowę zwierzęcia za pomocą golarki elektrycznej. Po tym należy zastosować roztwór jodyny w povidonie w celu sterylizacji skóry głowy i poczekać do jej wyschnięcia. Pod mikroskopem stereoskopowym należy usunąć skórę głowy zwierzęcia, aby całkowicie odsłonić kości ciemieniowe, tylne części kości czołowych oraz punkt bregma.
Nanieś niewielką ilość dziesięcioprocentowego roztworu chlorku żelaza na czaszkę, aby osuszyć błonę i ułatwić jej usunięcie. Następnie usuń osuszoną błonę, delikatnie zeskrobując ją z czaszki za pomocą pęsety. Potem nałóż cienką warstwę kleju wokół otworu w płytce mocującej głowę.
Delikatnie dociśnij płytkę głowową do czaszki myszy, aby obszar zainteresowania znajdował się w centrum okna. Następnie nanieś kroplę cementu stomatologicznego na płytkę głowową, aby spolimeryzować klej. W kolejnym kroku nanieś cienką warstwę kleju wzdłuż krawędzi okna płytki głowowej, aby stworzyć zbiornik na sól fizjologiczną.
Po wyschnięciu kleju przykręć płytkę głowową do uchwytu płytki głowowej myszy. Usuń nadmiar kleju z okna płytki głowowej, używając wiertła zamocowanego w mikrowiertarce, ustawionej na 6 000 rpm. Przerwij pracę co 10 do 15 sekund, aby zapobiec przegrzaniu czaszki myszy.
Następnie, używając nowego wiertła, należy rozpocząć ścieńczanie czaszki za pomocą mikro-wiertarki ustawionej na 4 000 rpm. Wiertłem należy delikatnie przesuwać po czaszce, nie wywierając bezpośredniego nacisku w dół. Po całkowitym ścieńczeniu czaszki należy odpiąć mysz z uchwytu i ułożyć ją na plecach.
Ostrożnie przyklej taśmą obie kończyny tylne, aby wyraźnie odsłonić przyśrodkową stronę ud. Następnie usuń owłosienie z obu przyśrodkowych stron ud i zdezynfekuj miejsce operacyjne, pokrywając uda powidonom jodem. Następnie ostrożnie usuń skórę z przyśrodkowej strony prawego uda, powyżej żyły i tętnicy udowej.
Nanieś około trzech do pięciu kropli 0.9% soli fizjologicznej na miejsce operacyjne. Następnie oddziel żyłę udową od tętnicy, wykonując tępe rozczłonkowanie wiązki naczyniowo-nerwowej uda. Teraz umieść dwa trzymilimetrowe odcinki nici chirurgicznej pod tętnicą udową, w odstępach około jednego centymetra.
Obróć górny szew zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby stworzyć stazę naczyniową, która zapobiegnie nadmiernej utracie krwi podczas kaniulacji. Następnie, używając nożyczek sprężynowych, wykonaj niewielkie nacięcie w tętnicy udowej, przez które zostanie później wprowadzony cewnik do monitorowania parametrów fizjologicznych myszy. W tej procedurze usuń skórę z przyśrodkowej części lewego uda myszy.
Następnie zlokalizuj żyłę udową. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 30 G nabierz 130 µL roztworu barwnika fluorescencyjnego. Powoli wstrzyknij 100 µL barwnika do żyły udowej.
Po wyjęciu igły należy wywierać stały, delikatny nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie i pozwolić barwnikowi rozprowadzić się przez pięć minut. Następnie miejsce operacyjne należy zamknąć szwami. Ostrożnie odwrócić mysz na brzuch i umieścić ją w uchwycie do płytki głowowej dla myszy.
W przypadku obrazowania dwufotonowego in vivo, przenieś aparat chirurgiczny do mikroskopu dwufotonowego i upewnij się, że poziom znieczulenia zwierzęcia jest utrzymany. Następnie wlej niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej do zbiorniczka płytki głowowej i opuść obiektyw mikroskopu tak, aby miał kontakt z solą fizjologiczną. Następnie zlokalizuj obszar zainteresowania, korzystając z obiektywu do obserwacji w jasnym polu.
Następnie rozpocznij obrazowanie dwufotonowe. Zlokalizuj łożysko kapilar na ekranie podglądu i powiększ ten obszar, korzystając również z zoomu optycznego. Pozyskaj obrazy naczyń włosowatych przy użyciu oprogramowania do obrazowania dwufotonowego.
W celu obrazowania dwufotonowego ex vivo, należy wykonać nacięcie skóry głowy od kości międzyciemieniowych do kości czołowych u odgłowionej myszy. Przytrzymać skórę przy bokach czaszki palcem wskazującym i kciukiem, umieścić nożyczki extra fine pod przyśrodkową częścią kości międzyciemieniowej i przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego do miejsca oddalonego o około 3 mm za punkt bregma. Następnie oddzielić czaszkę od mózgu i ostrożnie usunąć pęsetą wszelkie opony mózgowe z powierzchni mózgu.
Ostrożnie wsuń pęsetę pod mózg, aby uwolnić go z czaszki. Następnie umieść mózg w matrycy do mózgu, przeznaczonej dla myszy, i przemyj go kroplami ACSF. Następnie pobierz coronalny przekrój mózgu o grubości jednego milimetra.
Umieść przekrój mózgu na wklęsłym szkiełku przedmiotowym zawierającym ACSF, tak aby najbardziej przednia część przekroju była skierowana ku górze. Następnie delikatnie przykryj plaster mózgu szkiełkiem nakrywką. Przenieś szkiełko na stolik mikroskopu i nanieś niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej na szkiełko nakrywkę.
Obniż obiektyw mikroskopu, aż zetknie się on z solą fizjologiczną. Następnie, korzystając z obiektywu do pola jasnego, zlokalizuj linię środkową mózgu. Teraz rozpocznij obrazowanie dwufotonowe i ponownie zlokalizuj linię środkową, używając obiektywu 25x.
Należy to zrobić, wyszukując bruzdę podłużną na powierzchni kory w przekroju czołowym. Następnie należy ustawić prawą krawędź ekranu obrazowania na linii środkowej i przesuwać ekran podglądu bocznie przez trzy pełne klatki. Należy określić głębokość, przy której naczynia włosowate są ledwo widoczne na ekranie podglądu.
Następnie obniż płaszczyznę ogniskowania o dodatkowe 20 micrometers, aby wyznaczyć górną granicę stosu z (z-stack). Ustaw grubość obrazu na one micrometer. Obniż ekran podglądu o 100 micrometers i dostosuj moc lasera w taki sposób, aby mniej niż jeden procent pikseli był przesycony.
Na koniec wykonaj obrazowanie stosu z (z-stack). Na tym rysunku, po przygotowaniu skrawka mózgu, zlokalizowano obszar obrazowania w odległości około 1,5 milimetra od linii środkowej. Stos z o grubości 100 mikrometrów pozwala na uzyskanie obrazu trójwymiarowego wykorzystywanego do analizy w oprogramowaniu analitycznym Amira.
Następnie sieć kapilarna jest ręcznie śledzona poprzez umieszczanie węzłów na początku i końcu kapilary lub w każdym miejscu, w którym jedna kapilara rozgałęzia się w kolejną. W ten sposób powstaje w pełni zszkieletowany obraz, z którego automatycznie wyodrębniane są parametry morfologiczne. Liczbę węzłów kapilarnych, segmentów, średnią długość segmentu oraz całkowitą długość segmentów można wyodrębnić za pomocą obrazowania ex vivo dwufotonowego skrawków mózgu myszy.
W niniejszej procedurze za pomocą obrazowania in vivo uzyskuje się dwuwymiarowy obraz sieci naczyń włosowatych, z którego można wyznaczyć średnicę kapilar, a następnie obliczyć całkowitą objętość naczyń włosowatych, wykorzystując średnicę kapilar oraz całkowitą długość segmentów uzyskaną z obrazowania ex vivo. Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w ciągu trzech i pół godziny, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas realizacji procedury ważne jest sprawne działanie przy jednoczesnym utrzymaniu stałego poziomu znieczulenia, ponieważ izofluran może powodować rozszerzenie naczyń włosowatych kory, co prowadzi do zniekształcenia danych.
W trakcie tej procedury można uzyskać inne parametry kapilarne, takie jak prędkość erytrocytów lub strumień erytrocytów, co może zapewnić głębsze zrozumienie zmian patogennych obserwowanych w zaburzeniach neuropoznawczych związanych z HIV oraz innych chorobach neurodegeneracyjnych. Powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można ilościowo określić architekturę naczyniową mózgu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo. Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian w sieciach kapilar kory mózgowej po długotrwałej ekspozycji na wirotoksynę HIV, tat.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Zaburzenia neuropoznawcze
Wstęp
- Metoda ta pomaga zbadać kluczowe zmiany w morfologii naczyń włosowatych kory mózgu.
- Mogą one przyczyniać się do patogenezy zaburzeń neur poznawczych związanych z HIV.
- Technika ta umożliwia fizjologicznie dokładną kwantyfikację wielu parametrów morfologicznych naczyń włosowatych.
- Można ją również zastosować w przypadku innych chorób przebiegających ze zmianami naczyniowymi, takich jak choroba Alzheimera.
Cel badania
- Ilościowe określenie zmian w sieciach kapilar kory mózgu.
- Zbadanie wpływu wirurotoksyny HIV, tat, na morfologię naczyń kapilarnych.
- Dostarczenie informacji na temat patogenezy zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.
Zastosowane metody
- Mikroskopia dwufotonowa in vivo i ex vivo.
- Aplikacja żelu do sztucznych łez do oczu znieczulonych myszy.
- Kwantyfikacja parametrów morfologicznych naczyń kapilarnych.
- Analiza sieci kapilarnych kory mózgowej.
Główne wyniki
- Osiągnięto fizjologicznie dokładną kwantyfikację parametrów naczyń włosowatych.
- Po ekspozycji na wirotoksynę HIV zaobserwowano istotne zmiany w morfologii naczyń włosowatych.
- Metoda ta pozwoliła na uzyskanie informacji o zmianach naczyniowych związanych z zaburzeniami neuropoznawczymi.
- Odnotowano potencjalną możliwość zastosowania metody w przypadku innych chorób.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu architektury naczyniowej mózgu.
- Może ona przyczynić się do lepszego zrozumienia zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne choroby neurodegeneracyjne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza architektury naczyń mózgowych dostarcza mechanistycznych wglądów w modele chorób neurozapalnych, wspierając walidację celów w procesie odkrywania leków na OUN. Metoda ta umożliwia przedkliniczną ocenę zmian naczyniowych, które mogą przyczyniać się do dysfunkcji poznawczych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w portfelach projektów dotyczących chorób neurodegeneracyjnych. Dzięki dostarczaniu fizjologicznie dokładnych parametrów morfometrycznych kapilar zwiększa ona pewność predykcyjną w procesie ograniczania ryzyka (de-risking) wczesnych etapów walidacji celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje hipotezy terapeutyczne łączące neurouszkodzenia zapalne z rzadkością naczyń w zaburzeniach neuropoznawczych związanych z HIV.
- Wartość operacyjna: Umożliwia walidację funkcjonalnych celów terapeutycznych poprzez kwantyfikację gęstości naczyń włosowatych, długości segmentów i złożoności sieci.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez identyfikację mechanizmów naczyniowych odpowiedzialnych za spadek funkcji poznawczych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych badań przesiewowych związków poprzez ustalenie bazowych fenotypów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe, w tym liczbę węzłów kapilarnych, średnią długość segmentu oraz całkowitą długość naczyń.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach chorobowych, takich jak choroba Alzheimera, w których zaangażowana jest patologia naczyniowa.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Utrzymuje istotność w kontekście choroby poprzez bezpośredni pomiar zmian w naczyniach włosowatych kory w transgenicznym modelu mysim ekspresji Tat HIV-1.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od fazy odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki spójnym odczytom morfologicznym.
- Mitygacja ryzyka: Wspiera decyzje o postępach w badaniach skorygowane o ryzyko poprzez kwantyfikację parametrów zmniejszających ryzyko naczyniowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów badawczych, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w przypadku terapeutyków celowanych w OUN, gdzie integralność naczyniowa stanowi modyfikator mechanistyczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dysfunkcji jednostki naczyniowo-nerwowej oraz wyjaśnianie szlaków w modelach neurozapalnych.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej akwizycji stosu z (z-stack) i zautomatyzowanej ekstrakcji parametrów morfologicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów, takich jak średnica naczyń włosowatych, przepływ erytrocytów i przepływ objętościowy do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wskaźniki naczyniowe zbieżne z biomarkerami, które pozwalają przewidzieć wyniki poznawcze.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Służy jako reużywalna metoda w programach badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi z jednoczesnym występowaniem schorzeń naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną dzięki mechanistycznemu ograniczaniu ryzyka związanego z udziałem naczyń krwionośnych w neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność w obrębie procesów obrazowania in vivo i ex vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez redukcję biologicznego ryzyka w późnych etapach, wynikającego z nieprzewidzianej toksyczności naczyniowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o modulację fenotypu naczyniowego.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie przygotowania neurochirurgicznego, mikroskopii dwufotonowej oraz wewnątrznacznego wstrzykiwania barwników.
- Zależne od dostępności skaningowych mikroskopów dwufotonowych, uchwytów do płytek głowowych oraz oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Amira.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie chirurgii, obrazowania i analizy w celu zapewnienia spójnego pozyskiwania stosów obrazów z-stack.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu wyników z modeli mysich na skalę naczyniową istotną dla ludzi.
- Ograniczone przez umiejętności techniczne niezbędne do utrzymania stabilnej anestezji bez wywoływania artefaktów w postaci skurczu lub rozszerzenia naczyń.
