Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian w korowych sieciach naczyń włosowatych po długotrwałym narażeniu na wirotoksynę HIV, tat. Metoda ta może pomóc w zbadaniu kluczowych zmian w morfologii naczyń włosowatych kory mózgowej, które mogą przyczyniać się do patogenezy zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na fizjologicznie dokładne określenie ilościowe wielu parametrów morfologicznych naczyń włosowatych.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w patogenezę zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV. Może być również stosowany w innych chorobach, w których zachodzą zmiany naczyniowe, takich jak choroba Alzheimera. Rozpocznij tę procedurę od nałożenia sztucznego żelu łzowego na oczy znieczulonej myszy.

Następnie ogol głowę za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Następnie nałóż roztwór jodu powidonu, aby wysterylizować skórę głowy i pozostawić do wyschnięcia. Pod mikroskopem świetlnym usuń skórę głowy zwierzęcia, aby całkowicie odsłonić kości ciemieniowe, kości czołowe ogona i punkt bregma.

Nałóż niewielką ilość dziesięcioprocentowego roztworu chlorku żelaza na czaszkę, aby wysuszyć błonę i ułatwić usunięcie. Następnie usuń wysuszoną błonę, delikatnie zeskrobując czaszkę kleszczami. Następnie nałóż cienką warstwę kleju wokół okienka płyty czołowej.

Delikatnie dociśnij płytkę głowy do czaszki myszy, aby obszar zainteresowania znajdował się na środku okna. Następnie nałóż kroplę cementu dentystycznego na płytę głowicy, aby spolimeryzować klej. Następnie nałóż cienką warstwę kleju wzdłuż krawędzi okienka płyty głowicy, aby utworzyć zbiornik do przechowywania soli fizjologicznej.

Po wyschnięciu kleju przykręć płytkę głowicy do uprzęży płyty głowicy myszy. Usuń klej z okienka płyty czołowej za pomocą wiertła dołączonego do wiertarki z mikrotorpem, ustawionej na 6 000 obr./min. Zatrzymuj się co 10 do 15 sekund, aby zapobiec przegrzaniu czaszki myszy.

Następnie, używając nowego wiertła, zacznij rozrzedzać czaszkę za pomocą zestawu wierteł z mikrotorpem o prędkości 4 000 obr./min. Delikatnie przesuwaj wiertło po czaszce bez bezpośredniego nacisku w dół. Gdy czaszka zostanie całkowicie przerzedzona, odłącz mysz od uchwytu i połóż ją na plecach.

Delikatnie przyklej taśmą obie tylne kończyny, aby wyraźnie odsłonić przyśrodkowe uda. Następnie usuń włosy z obu przyśrodkowych ud i zdezynfekuj miejsce operacji, pokrywając uda jodowidonem. Następnie delikatnie usuń skórę na przyśrodkowym prawym udzie, powyżej żyły udowej i tętnicy.

Nałóż około trzech do pięciu kropli 0,9% soli fizjologicznej na miejsce operowane. Następnie oddziel żyłę udową od tętnicy, tępo preparując na pęczek nerwowo-naczyniowy kości udowej. Teraz umieść dwa trzycentymetrowe kawałki szwu chirurgicznego pod tętnicą udową, w odległości około jednego centymetra od siebie.

Przekręć górny szew zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby utworzyć naczyniową opaskę uciskową, która pomoże zapobiec nadmiernej utracie krwi podczas cewnikowania. Następnie wykonaj małe nacięcie w tętnicy udowej za pomocą nożyczek sprężynowych, gdzie później zostanie wprowadzony cewnik w celu monitorowania parametrów fizjologicznych myszy. W tej procedurze usuń skórę na przyśrodkowym lewym udzie myszy.

Następnie zlokalizuj żyłę udową. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra i igły o rozmiarze 30 pobrać 130 mikrolitrów roztworu barwnika fluorescencyjnego. Powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów barwnika do żyły udowej.

Po wyjęciu igły należy wywierać stały, delikatny nacisk na miejsce wstrzyknięcia, aby zatrzymać krwawienie i pozwolić barwnikowi krążyć przez pięć minut. Następnie zamknij miejsce operacyjne szwami. Ostrożnie przełóż mysz na brzuch i umieść ją w uprzęży płyty głowy myszy.

W przypadku obrazowania dwufotonowego in vivo przenieś aparat chirurgiczny do mikroskopu dwufotonowego i upewnij się, że utrzymany jest poziom znieczulenia zwierzęcia. Następnie umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej w zbiorniku płyty głównej i opuść obiektyw mikroskopu, tak aby zetknął się z solą fizjologiczną. Następnie zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą obiektywu do oglądania w jasnym polu.

Następnie rozpocznij obrazowanie dwoma fotonami. Zlokalizuj złoże kapilarne na ekranie podglądu i powiększ ten obszar również za pomocą zoomu optycznego. Uzyskuj obrazy naczyń włosowatych za pomocą dwóch programów do obrazowania fotonów.

W przypadku obrazowania dwufotonowego ex vivo należy wykonać nacięcie w skórze głowy od kości międzyciemieniowych do kości czołowych myszy pozbawionej głowy. Przymocuj skórę do boków czaszki palcem wskazującym i kciukiem, umieść bardzo cienkie nożyczki pod przyśrodkową kością międzyciemieniową i przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego do około trzech milimetrów za punktem bregma. Następnie oddziel czaszkę od mózgu i ostrożnie usuń wszelkie opony mózgowe z powierzchni mózgu za pomocą kleszczy.

Delikatnie wsuń kleszcze pod mózg, aby uwolnić go od czaszki. Następnie umieść mózg w macierzy mózgowej, specyficznej dla myszy, i umyj go kroplami ACSF. Następnie usuń milimetrowy wycinek koronalny mózgu.

Umieść wycinek mózgu na wklęsłym szkiełku zawierającym ACSF, tak aby najbardziej przednia część sekcji była skierowana do góry. Następnie delikatnie przykryj plasterek mózgu szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Przenieś szkiełko do stolika mikroskopowego i umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej na szkiełku nakrywkowym.

Obniż obiektyw mikroskopu, aż wejdzie w kontakt z solą fizjologiczną. Następnie zlokalizuj linię środkową mózgu za pomocą obiektywu jasnego pola. Teraz rozpocznij obrazowanie dwoma fotonami i ponownie zlokalizuj linię środkową za pomocą obiektywu 25x.

Osiągnij to, szukając podłużnej szczeliny na korowej powierzchni odcinka koronalnego. Następnie umieść prawą krawędź ekranu obrazowania na linii środkowej i przesuń ekran przeglądarki na boki po trzech pełnych klatkach. Zlokalizuj głębokość, na której naczynia włosowate są ledwo widoczne na ekranie widoku.

Następnie obniż płaszczyznę ostrości o dodatkowe 20 mikrometrów, aby określić górną część stosu z. Ustaw grubość obrazu na jeden mikrometr. Obniż ekran widoku o 100 mikrometrów i dostosuj moc lasera w całym obszarze tak, aby mniej niż jeden procent pikseli było przesyconych.

Na koniec zdobądź z-stack. Na tym rysunku, po przygotowaniu wycinka mózgu, znajduje się obszar obrazowania w odległości około 1,5 milimetra od linii środkowej. Stos Z o średnicy 100 mikrometrów tworzy trójwymiarowy obraz używany do analizy w oprogramowaniu analitycznym Amira.

Sieć kapilarna jest następnie ręcznie śledzona poprzez umieszczenie węzłów na początku i na końcu kapilary lub w dowolnym miejscu, w którym jedna kapila rozgałęzia się w drugą. W ten sposób powstaje w pełni szkieletowy obraz, z którego automatycznie wyodrębniane są parametry morfologiczne. Liczbę węzłów kapilarnych, segmenty, średnią długość segmentu i całkowitą długość segmentu można wyodrębnić za pomocą obrazowania ex vivo dwóch fotonów wycinków mózgu myszy.

W tym przypadku dwuwymiarowy obraz sieci kapilarnych jest uzyskiwany za pomocą obrazowania in vivo, w którym można wyodrębnić średnicę kapilary i obliczyć całkowitą objętość kapilary na podstawie średnicy kapilary i całkowitej długości segmentu uzyskanej z obrazowania ex vivo. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w trzy i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby poruszać się szybko, utrzymując stały poziom znieczulenia, ponieważ izofluran może powodować rozszerzenie naczyń włosowatych kory mózgowej, zniekształcając w ten sposób dane.

Podczas tej procedury można uzyskać inne parametry naczyń włosowatych, takie jak prędkość czerwonych krwinek lub strumień czerwonych krwinek, co może zapewnić głębsze zrozumienie zmian patogennych obserwowanych w zaburzeniach neuropoznawczych związanych z HIV i innych chorobach neurodegeneracyjnych. Powodzenia w eksperymentach.