Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z podwójnie rezonansowym koherentnym rozpraszaniem Ramana antystokesa (CARS)

Ten film przedstawia procedurę przeprowadzania obrazowania różnicowego dwóch rezonansów ramenu związanych ze strukturami biologicznymi ze spójnymi sygnałami rozpraszania ramen. Pierwsze trzy zsynchronizowane lasery o krótkich impulsach nakładają się na siebie w czasie i przestrzeni. Nakładające się na siebie impulsy są następnie przesyłane do standardowego mikroskopu odwróconego, który pozwala na generowanie spójnych sygnałów ramen z mikroskopijnych obiektów.

Sygnały są konwertowane na obrazy za pomocą komercyjnego oprogramowania w celu porównania różnych sygnałów ramen, które są produkowane. Wyniki wskazują, że różnica między obrazami uzyskanymi z podwójnie i pojedynczo rezonansowych sygnałów ramen zapewnia zwiększoną czułość dla słabych sygnałów ramen. Cześć, nazywam się Tyler Weeks i pracuję w Centrum Biofotoniki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

Nazywam się Thomas ER i pracuję w Centrum Biofotoniki i na Wydziale Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wykorzystania podwójnie rezonansowego, koherentnego rozpraszania ramenu anty-stokesa do tworzenia chemicznie specyficznych obrazów komórek. Używamy tej procedury do wykrywania sygnałów z cząsteczek, które są zbyt słabe, aby można je było wykryć bezpośrednio za pomocą samej koherentnej spektroskopii anty-Stokesa Ramona.

Więc zacznijmy: Aby jednocześnie generować sygnał samochodów i samochodów Dr, potrzebne są trzy przestrajalne i zsynchronizowane źródła lasera o krótkich impulsach, aby uzyskać te zsynchronizowane impulsy. Zacznij od pojedynczego lasera o krótkim impulsie o mocy wyjściowej 10 watów. Stała długość fali 1064 nanometry, stała długość impulsu wynosząca siedem pikosekund i stała częstotliwość powtarzania 76 megaherców.

Za pomocą serii płyt półfalowych i polaryzacyjnych kostek rozdzielacza wiązki, wiązka jest dzielona na trzy części. Półkierunkowa płytka w połączeniu z polaryzacyjną kostką rozdzielacza wiązki umożliwia regulację ilości mocy w każdym elemencie wiązki bez zmiany jej kierunku. Zazwyczaj dwie wiązki są ustawione na około 4,5 wata każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały jeden wat.

Dwie wiązki o dużej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych lub OPO. OPO wykorzystują różne generacje częstotliwości do przekształcania fotonu o wysokiej energii w dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fal. Kontrolując temperaturę kryształu użytego do osiągnięcia tego efektu, długości fal powstałych fotonów mogą być kontrolowane z dokładnością do 0,1 nanometra.

Podwajając częstotliwość tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nanometrów może teraz zostać przekształcony w wiązkę laserową, którą można dostroić w dowolnym miejscu w zakresie od 780 nanometrów do 910 nanometrów, pompując dwa oddzielne OPO tym samym źródłem 1064 nanometrów. Uzyskuje się dwa niezależnie przestrajalne źródła lasera, które są automatycznie synchronizowane z naszym oryginalnym laserem pompującym. Trzecia wiązka z lasera pompującego o długości fali 1064 nm jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji zwierciadeł dielektrycznych, dzięki czemu wszystkie trzy wiązki mogą być później ponownie połączone.

Aby efektywnie wytworzyć spójne fotony sygnału ramen, zrekombinowane impulsy muszą nakładać się na siebie zarówno czasowo, jak i przestrzennie, ponieważ OPO zawierają wnęki pierścieniowe, dzięki którym każdy impuls laserowy przechodzi przez kryształ wielokrotnie niż wiązka wysyłana przez OPO pokonuje dodatkową odległość, co powoduje znaczne opóźnienie w stosunku do oryginalnej wiązki pompy. Odległość ta musi być skompensowana trzecią wiązką poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które zmuszają tę wiązkę do pokonania tej samej odległości co pozostałe dwie, zanim zostaną ponownie połączone za pomocą lusterek dichroicznych, aby zapewnić precyzyjną regulację długości ścieżki. Każda wiązka jest wysyłana przez regulowane stopnie opóźniające, które pozwalają na regulację czasowego nakładania się różnych impulsów laserowych.

Do każdej wiązki dodawany jest kolejny zestaw płytek półdrożnych i kostek rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej, aby umożliwić niezależną regulację mocy lasera każdej wiązki. Zwierciadła dichroiczne służą najpierw do łączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie należy zadbać o wiązkę o długości 1064 nanometrów, aby wiązki dokładnie zachodziły na siebie w przestrzeni. Można to zweryfikować, porównując nakładanie się wiązek w promieniu kilku centymetrów od zwierciadła dichroicznego z tymi w odległości około jednego metra od zwierciadła dichroicznego.

Ponieważ narażenie na wiązki laserowe o dużej mocy średniej mocy może uszkodzić próbkę, trzy połączone wiązki są przesyłane przez elektryczny modulator optyczny działający jako impuls picker, który umożliwia regulację częstotliwości powtarzania impulsów docierających do próbki, a tym samym średniej mocy. Połączone wiązki laserowe są następnie sprzężone w odwrócony mikroskop z soczewką obiektywową o dużej aperturze numerycznej lub na. Ścisłe ogniskowanie generowane przez soczewkę obiektywową o wysokim NA pozwala na najbardziej efektywne generowanie spójnych sygnałów ramen na mikroskopijnych skalach długości.

Soczewka obiektywowa mikroskopu jest zamontowana na stoliku Pizo X, Y, Z, co umożliwia uzyskanie obrazów poprzez skanowanie rastrowe wiązek w poprzek próbki, podobnie jak w przypadku komercyjnego skanowania wiązką, mikroskopów konfokalnych. Zobaczmy teraz, jak generować sygnały samochodów i D-R-F-W-M, oddziaływanie trzech krótkoimpulsowych wiązek laserowych na próbce skutkuje generowaniem kilku czterofalowych sygnałów mieszających, takich jak samochody z różnych kombinacji dwóch laserów, a także trzy kolorowe samochody i sygnały samochodów DR z połączenia wszystkich trzech laserów. Gdy sygnały mają stosunkowo zbliżoną długość fali, rozdzielenie ich do analizy może być trudne.

Z tego powodu sygnały są przekazywane do spektrometru obrazowania, który służy również jako monochromator lub filtr pasmowo-przepustowy do przestrzennego oddzielania sygnałów o różnych długościach fal. Elektronicznie uruchamiane lustro odchylane w spektrometrze w opuszczonej pozycji wysyła sygnał do podświetlanego wstecznie urządzenia sprzężonego z ładunkiem głębokiego zubożenia lub kamery CCD, która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału i pozwala nam zidentyfikować i zoptymalizować różne spójne sygnały robin w celu wybrania sygnału do obrazu. Wystarczy obrócić gradację w spektrometrze za pomocą dostarczonego przez dostawcę oprogramowania sterującego i akwizycji danych, aby wyśrodkować szczyt zainteresowania w kamerze CCD.

Następnie zmień położenie lustra odchylanego, aby przekierować sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego dołączone jest zdjęcie lawinowe zliczające pojedyncze fotony DDE lub PD. Raster. Zeskanuj soczewkę obiektywu, a następnie wykorzystaj sygnały zarejestrowane na PD A do wygenerowania obrazu, wyświetlając szybkość zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Powtórz tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego spójnego sygnału ramen, aby sygnały można było porównać podczas przetwarzania końcowego.

Zobaczmy teraz, jak prawidłowo przygotować próbkę, aby uzyskać wyraźne, powtarzalne obrazy. Należy zachować pewną ostrożność podczas przygotowywania próbek. Próbki są zwykle przygotowywane na szkiełkach nakrywkowych o grubości około 150 mikronów.

Te szkiełka nakrywkowe są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą soczewek obiektywowych o wysokiej NA, zanurzonych w wodzie lub oleju, które są używane w tych eksperymentach. Aby zademonstrować przygotowanie typowej próbki, przygotowujemy odcinki tkanki mięśniowej myszy o grubości około 20 mikronów, które są przymocowane do szkiełka mikroskopowego. Do próbki dodaje się 20-mikrolitrową kroplę pięciomolowego deuterowanego roztworu glukozy.

Deuterowany roztwór glukozy zapewnia unikalną i mocną sygnaturę tła ramenu. Szklane szkiełko nakrywkowe umieszcza się na wierzchu próbki i mocuje za pomocą lakieru do paznokci do komórek i hodowli. Można stosować naczynia do hodowli ze szklanym dnem, które pozwalają na obrazowanie bez konieczności odłączania komórek od naczyń do hodowli komórkowych.

Zobaczmy teraz, jak określić odpowiedni rum i szczyty dla samochodów Dr. Aby właściwie wykorzystać efekt podwójnie rezonansowego wzmocnienia, muszą być znane widma ramenu obu substancji rezonansowych ramen. Zazwyczaj są to 2 845 odwróconych centymetrów związanych z lipidami i 2 121 odwrotnych centymetrów dla trybu rozciągania CD związanego z deuterowaną glukozą.

Koherentne rozpraszanie ramenu uzyskuje się, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgań molekularnych. Dostrajając jeden OPO do 817 nanometrów, będzie sondował tryb C o długości 2 845 centymetrów odwrotnych w połączeniu z wiązką laserową o długości 1064 nanometrów, a dostrajając drugi OPO do 868 nanometrów, będzie sondował 2,121 centymetra odwrotnego w połączeniu z wiązką 1064 nanometrów. W trybie spektroskopowym mikroskop samochodowy pozwala nam obserwować trzy interesujące nas spójne sygnały ramen, sygnał samochodowy sondujący drgania rozciągające CO, sygnał samochodowy sondujący tryb rozciągania CD oraz sygnał samochodowy DR sondujący oba na schemacie pokazanym tutaj, przerywane strzałki wskazują fotony z lasera w OPO, a ciągłe strzałki wskazują wynikowy sygnał.

Ciągłe poziome linie wskazują energię wibracji ramenu i dają wizualną reprezentację, że w samochodach DR mieszanie tych samych trzech fotonów wejściowych jednocześnie sonduje dwie różne wibracje ramen. Siła sygnału dla każdego szczytu będzie musiała zostać zoptymalizowana poprzez precyzyjne dostrojenie wokół tych lokalizacji szczytów. Tutaj wybieramy każdy pik i robimy zdjęcia robaków morskich elgana w roztworze obniżonej wartości glukozy, wydobycie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech indywidualnie uzyskanych obrazów wymaga dość prostego przetwarzania obrazu.

Po pierwsze, obrazy muszą zostać znormalizowane. Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że lipidy są hydrofobowe. Oznacza to, że w regionach o dużej gęstości lipidów rezonans CD od glukozy powinien w bardzo niewielkim stopniu przyczyniać się do sygnału podwójnie rezonansowego.

I odwrotnie, w regionach czystego roztworu glukozy, rezonanse CH od lipidów również powinny mieć bardzo niewielki wkład. Mając to na uwadze, znormalizuj obraz samochodu DR i obraz samochodu uzyskany na rezonansie CD deuterowanego roztworu glukozy do obszaru znacznie poza robakiem CL egana, który nie powinien wykazywać rezonansu CH. Następnie zidentyfikuj region w robaku na rezonansowym obrazie samochodu CH, który jest bogaty w lipidy i znormalizuj go do odpowiedniego regionu w znormalizowanym obrazie samochodu DR.

Aby ta metoda działała poprawnie, załóżmy, że głęboko w tym regionie nie ma deuterowanej glukozy. Jest to bezpieczne założenie, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie mieszają się z roztworem. Teraz, odejmując znormalizowany obraz samochodu rezonansowego CH od znormalizowanego obrazu samochodu DR, tylko wzmocniony sygnał rezonansowy CD pozostaje podobny, odejmując znormalizowany obraz rezonansowy samochodu CD od znormalizowanego obrazu Dr.FWM.

Pokazane tutaj tylko wzmocnione pozostałości rezonansowe ch to widmo ramenu dla zmodyfikowanego kwasu oleinowego, które obejmuje modyfikację alkinową, silne rezonanse CH na 2 845 odwróconych centymetrach i rezonans alpejski na 2 121 odwróconych centymetrach są dobrze odizolowane od obszaru odcisków palców, który jest obszarem gęsto upakowanych szczytów, co czyni je idealnymi markerami do spójnego obrazowania ramenu. Jest to typowe widmo koherentnych sygnałów ramen generowanych, gdy trzy lasery o krótkich impulsach nakładają się na siebie w próbce. Strzałki wskazują procesy odpowiedzialne za każdy sygnał przedstawione na wykresach energetycznych.

Są to typowe wyniki obrazowania robaków C Elgina przy użyciu samochodów DR i samochodów. Górny rząd wykorzystał trzy pokazane przed chwilą sygnały do zobrazowania robaka w roztworze obniżonej wartości glukozy. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie wyprodukowano obrazy różnicowe Odejmując każdy z obrazów samochodu od obrazu samochodu DR, właśnie pokazaliśmy, jak wykonać obrazowanie różnic Ramana w oparciu o podwójnie rezonansową spójną mikroskopię antyramanowskią.

Wykonując tę procedurę, pamiętaj, że ważne jest, aby upewnić się, że belki nakładają się na siebie i są prawidłowo zsynchronizowane. Ponadto, przełączając się między różnymi spójnymi sygnałami, należy pamiętać, aby nie uderzać ani nie przesuwać próbki, ponieważ wpłynie to na analizę. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.