Name: Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z podwójnie rezonansowym koherentnym rozpraszaniem Ramana antystokesa (CARS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Poznaj metodę obrazowania różnicowego CARS i DR-CARS w biologii komórki przy użyciu trzech zsynchronizowanych laserów impulsowych. Technika ta zwiększa czułość detekcji słabych sygnałów Ramana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Iwanowi Schie i Sebastianowi Wachsmann-Hogiu za ich wkład w opracowanie techniki DR-CARS. Tyler Weeks dziękuje za wsparcie w ramach Lawrence Scholar Program w Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser jest wdzięczny za wsparcie American Heart Association w ramach programu Grant-in-Aid. Praca ta była również częściowo finansowana przez National Science Foundation. Center for Biophotonics, będące Centrum Nauki i Technologii NSF, jest zarządzane przez University of California, Davis, na podstawie umowy o współpracy nr PHY 0120999. Podziękowania kierujemy również do UCD Clinical Translational Science Center za wsparcie w ramach grantu nr UL1 RR024146 z National Center for Research Resources (NCRR).

1. Generowanie sygnałów CARS i DR-CARS
W celu jednoczesnego generowania sygnałów CARS i DR-CARS wymagane są trzy strojne i zsynchronizowane źródła krótkich impulsów laserowych.
<ol>
 <li>Aby uzyskać trzy zsynchronizowane impulsy, rozpoczynamy od pojedynczego lasera 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.). Laser ten posiada stałą długość fali 1064 nm, stałą długość impulsu 7 ps oraz stałą częstotliwość repetycji 76 MHz.</li>
 <li>Za pomocą serii płytek półfalowych i kostek polaryzacyjnego dzielnika wiązki wiązka jest dzielona na trzy części. Płytka półfalowa w połączeniu z kostką polaryzacyjnego dzielnika wiązki pozwala na regulację mocy każdego komponentu wiązki bez zmiany jego kierunku. Zazwyczaj dwie wiązki są ustawiane na ~ 4,5 W każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały 1 W.</li>
 <li>Dwie wiązki o wysokiej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych (OPO, Avante, APE GmbH, Berlin, Niemcy). OPO wykorzystują generację różnicy częstotliwości do konwersji fotonu o wyższej energii na dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fali. Poprzez kontrolę temperatury kryształu użytego do uzyskania tego efektu, można kontrolować długości fal otrzymanych fotonów z dokładnością do 0,1 nm. Dzięki podwojeniu częstotliwości tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nm może zostać przekształcony w wiązkę laserową, którą można nastroić w zakresie od 780 nm do 910 nm. Pompowanie dwóch oddzielnych OPO tym samym źródłem 1064 nm pozwala uzyskać dwa niezależnie strojone źródła laserowe, które są automatycznie zsynchronizowane z oryginalnym laserem pompowym.</li>
 <li>Trzecia wiązka (o najniższej mocy) z lasera pompowego 1064 nm jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji luster dichroicznych, tak aby wszystkie trzy wiązki (dwie z OPO i jedna z lasera pompowego) mogły zostać później ponownie połączone. Aby efektywnie generować koherentne fotony sygnału Ramanowskiego, połączone impulsy muszą nakładać się zarówno czasowo, jak i przestrzennie. Ponieważ OPO zawierają wnęki pierścieniowe, co pozwala każdemu impulsowi laserowemu przejść przez kryształ wielokrotnie, wiązki przechodzące przez OPO pokonują dodatkową odległość, co skutkuje znacznym opóźnieniem w stosunku do oryginalnej wiązki pompowej. Odległość tę należy skompensować w trzeciej wiązce poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które wymuszą pokonanie przez tę wiązkę takiej samej drogi jak przez dwie pozostałe, przed ich połączeniem za pomocą luster dichroicznych.</li>
 <li>W celu precyzyjnej regulacji długości drogi każdej wiązki, w każdej ścieżce wiązki wprowadzone są regulowane stopnie opóźniające z wykorzystaniem retroreflektorów pryzmatycznych.</li>
 <li>Do każdej wiązki dodawany jest kolejny zestaw płytek półfalowych i kostek polaryzacyjnego dzielnika wiązki, co pozwala na niezależną regulację mocy każdej wiązki bez wpływu na wejście do OPO.</li>
 <li>Lustra dichroiczne są wykorzystywane do najpierw połączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie z wiązką 1064 nm. Należy zadbać o to, aby wiązki dokładnie się nakładały (tzn. były współosiowe i miały podobną rozbieżność). Można to sprawdzić, porównując nakładanie się wiązek w bliskiej odległości (kilka centymetrów) i w dużej odległości (~ 1 m) od lustra dichroicznego.</li>
 <li>Zaletą stosowania laserów impulsowych jest to, że każdy impuls może mieć wysoką energię szczytową w próbce, co umożliwia efektywne generowanie koherentnych sygnałów Ramanowskich, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej średniej intensywności. Wysoka średnia intensywność może uszkodzić próbkę. Dlatego, aby dalej kontrolować średnią intensywność bez poświęcania energii szczytowej, trzy połączone wiązki są kierowane przez modulator elektrooptyczny (komórka Pockelsa, ConOptics) działający jako selektor impulsów (pulse picker), co pozwala na regulację częstotliwości repetycji impulsów docierających do próbki, a tym samym średniej intensywności.</li>
 <li>Połączone wiązki laserowe są następnie wprowadzane do mikroskopu odwróconego z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (NA). Obiektyw to zazwyczaj obiektyw wodny 60 X z aperturą numeryczną (NA) 1,2, który został skorygowany pod kątem aberracji chromatycznej w zakresie strojenia naszych OPO oraz dla wiązki 1064 nm. Silne ogniskowanie generowane przez obiektyw o wysokim NA umożliwia najbardziej efektywne generowanie koherentnych sygnałów Ramanowskich w skali mikronowej.</li>
 <li>Połączone wiązki są rozszerzane, aby wypełnić z nadmiarem tylną aperturę obiektywu mikroskopowego. Poprzez nadmiarowe wypełnienie tylnej części obiektywu mikroskopu możemy uzyskać najlepsze warunki ogniskowania, a tym samym najlepszą rozdzielczość przestrzenną w naszym systemie mikroskopowym.</li>
 <li>Obiektyw w naszym mikroskopie jest zamontowany na piezoelektrycznym stole XYZ, co pozwala na uzyskiwanie obrazów poprzez rastrowe skanowanie wiązkami próbki, podobnie jak w komercyjnych konfokalnych mikroskopach skanujących.</li>
</ol>
2. Zastosowanie trzech laserów impulsowych o krótkim czasie trwania impulsu
Zastosowanie trzech laserów impulsowych o krótkim czasie trwania prowadzi do generowania kilku sygnałów CARS, pochodzących z różnych kombinacji dwóch laserów, a także sygnałów 3-Color CARS oraz DR-FWM, wynikających z kombinacji wszystkich trzech laserów.
<ol>
 <li>Długości fal sygnałów mogą być bliskie sobie w widmie. Gdy sygnały znajdują się blisko siebie, ich rozdzielenie do analizy za pomocą filtrów pasmowych o stałej długości fali i luster dichroicznych może być trudne. Z tego powodu nasze sygnały są kierowane do spektrometru obrazującego (SpectraPro 2300i, Acton Research), który służy również jako wydajny monochromator do przestrzennego rozdzielania sygnałów o różnych długościach fal.</li>
 <li>Elektronicznie sterowane lustro odchylające wewnątrz spektrometru w pozycji opuszczonej kieruje sygnał do kamery z matrycą CCD (charge-coupled device) z głębokim ubytkiem (deep-depletion) i podświetleniem tylnym, która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału i pozwala nam zidentyfikować oraz zoptymalizować poszczególne spójne sygnały Ramana.</li>
 <li>Aby wybrać sygnał, który chcemy obrazować, po prostu obracamy siatkę wewnątrz spektrometru, korzystając z dostarczonego przez producenta oprogramowania sterującego i akwizycji danych (WinSpec, Princeton Instruments), aby wycentrować interesujący nas pik na kamerze CCD, a następnie zmieniamy pozycję lustra odchylającego, aby przekierować ten sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego podłączona jest lawinowa fotodioda (APD) do zliczania pojedynczych fotonów.</li>
 <li>Następnie obiektyw jest skanowany rastrowo, a sygnały rejestrowane przez APD są wykorzystywane do wygenerowania obrazu poprzez wyświetlenie szybkości zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Niemcy).</li>
 <li>Powtarzamy tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego spójnego sygnału Ramana, co pozwala nam porównać sygnały podczas przetwarzania danych.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek
Aby uzyskać wyraźne i powtarzalne obrazy, należy zachować należytą staranność podczas przygotowywania próbki.
<ol>
 <li>Próbki są zazwyczaj przygotowywane na szklanych szkiełkach nakrywkowych o grubości ok. 150 micron. Szkiełka te są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem obiektywów o aperturze numerycznej 1.2 NA, które są zazwyczaj stosowane.</li>
 <li>Optyczne pułapkowanie obiektów dielektrycznych może zachodzić, gdy światło laserowe ulega dyfrakcji na małych, przezroczystych obiektach. Zastosowanie ściśle ogniskowanych, krótkich impulsów laserowych o wysokiej mocy szczytowej może prowadzić do przemieszczania małych komórek lub bakterii, co skutkuje rozmazanymi obrazami. Aby tego uniknąć, może być konieczne unieruchomienie próbki na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego poprzez uprzednie naniesienie cienkiej warstwy poli-L-lizyny metodą spin-coatingu.</li>
 <li>W przypadku komórek w kulturze można zastosować szalki hodowlane z szklanym dnem, które umożliwiają obrazowanie bez konieczności odrywania komórek od naczyń hodowlanych.</li>
 <li>W celach demonstracyjnych w niniejszym opracowaniu najpierw osadzamy utrwalonego formaldehydem nicienia C. elegans na szklanym szkiełku nakrywkowym.</li>
 <li>Następnie do nicienia dodaje się kroplę 20 μL 5 M roztworu glukozy deuterowanej. Roztwór glukozy deuterowanej zapewnia unikalny i silny sygnał tła w widmie Raman.</li>
</ol>
4. Analiza próbek
Aby właściwie wykorzystać efekt wzmocnienia podwójnego rezonansu, należy znać widma Ramanowskie obu substancji rezonansowych.
<ol>
 <li>Po przygotowaniu próbki na szkiełku podstawowym zostaje ona poddana analizie za pomocą konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego w celu uzyskania odpowiedniego widma spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego i zidentyfikowania właściwych pików.</li>
 <li>Aby przeprowadzić DR-CARS, identyfikujemy położenia widmowe modu rozciągającego CH, zazwyczaj powiązanego z lipidami, oraz modu rozciągającego CD, powiązanego z deuterowaną glukozą, które wynoszą odpowiednio 2845 cm-1 oraz 2121 cm-1.</li>
 <li>Koherentne rozpraszanie Ramanowskie występuje, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgania molekularnego. Poprzez dostrojenie jednego OPO do 817 nm, w połączeniu z wiązką lasera 1064 nm, badany będzie mod CH o wartości 2845 cm-1, a poprzez dostrojenie drugiego OPO do 868 nm, w połączeniu z wiązką 1064 nm, badany będzie pik 2121 cm-1.</li>
 <li>Dzięki skanowaniu rastrowemu próbki za pomocą mikroskopu CARS możemy teraz zaobserwować trzy interesujące sygnały koherentnego rozpraszania Ramanowskiego: sygnał CARS badający drgania rozciągające CH, sygnał CARS badający mod rozciągający CD oraz sygnał DR-CARS badający oba te mody.</li>
 <li>Wybieramy każdy pik zgodnie z opisem w sekcji 2.3 i wykonujemy obraz zgodnie z powyższą procedurą.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów
Wyodrębnienie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech obrazów wymaga obecnie zastosowania dość prostego przetwarzania obrazu.
<ol>
 <li>W pierwszej kolejności należy przeprowadzić normalizację obrazów. Teoretycznie normalizację można osiągnąć poprzez uwzględnienie intensywności każdego lasera biorącego udział w procesie generowania sygnału. W praktyce jednak nie zawsze jest to skuteczne, głównie ze względu na niejednolitną odpowiedź spektralną luster dichroicznych, detektorów i siatek dyfrakcyjnych.</li>
 <li>Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że w obszarach, w których w sygnale dominują czyste lipidy, rezonans CD nie powinien wnosić żadnego wkładu do sygnału. Analogicznie, w obszarach czystego roztworu glukozy rezonans CH nie powinien wpływać na sygnał. Mając to na uwadze, normalizujemy obraz DR-CARS oraz obraz CARS uzyskany przy rezonansie CD roztworu glukozy deuterowanej względem obszaru znajdującego się daleko poza nicieniem C. elegans, w którym nie powinien występować rezonans CH.</li>
 <li>Następnie w obrazie CARS przy rezonansie CH identyfikujemy obszar w obrębie nicienia bogaty w lipidy i normalizujemy go względem odpowiadającego mu obszaru w znormalizowanym obrazie DR-CARS. Aby ta metoda działała prawidłowo, zakładamy, że głęboko w tym obszarze nie występuje glukoza deuterowana. Jest to bezpieczne założenie, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie zmieszają się z roztworem.</li>
 <li>Teraz, odejmując znormalizowany obraz CARS przy rezonansie CH od znormalizowanego obrazu DR-CARS, otrzymujemy wyłącznie wzmocniony sygnał rezonansowy CD.</li>
 <li>Podobnie, odejmując znormalizowany obraz CARS przy rezonansie CD od znormalizowanego obrazu DR-FWM, otrzymujemy wyłącznie wzmocniony sygnał rezonansowy CH.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="Schemat wzbudzenia optycznego; obejmuje OPO, laser pompujący, spektrograf do badań absorpcji przejściowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1: Schemat systemu mikroskopii DR-CARS opisanego powyżej. 
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy nicienia C. elegans, mikroskopia w polu jasnym, badanie biologiczne, analiza organizmu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2: Obraz w świetle białym nicienia C. elegans w roztworze glukozy deuterowanej, przygotowany na szklanej lamelce i gotowy do obrazowania.
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="Wykres spektroskopowy pokazujący piki emisji w analizie absorpcji przejściowej, ocena danych spektralnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3: Widmo Ramana zmodyfikowanego kwasu oleinowego (nienasyconego kwasu tłuszczowego), który zawiera modyfikację alkinową (grupę z potrójnym wiązaniem węgiel-węgiel). Silne rezonanse CH przy 2845 cm-1 oraz rezonans alkinowy przy 2100 cm-1 są dobrze odizolowane od obszaru fingerprint (obszaru gęsto rozmieszczonych pików), co czyni je idealnymi markerami do koherentnego obrazowania Ramana.
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="Schemat widm rezonansowych; piki S1-S3 rezonansowego CARS/DR-CARS dla CH/CD; analiza widmowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4: Typowe widmo koherentnych sygnałów Ramana generowanych podczas nakładania trzech laserów krótkopulsacyjnych w próbce. Strzałki wskazują proces(y) odpowiedzialne za każdy sygnał, przedstawione na schematach poziomów energetycznych. Na zaprezentowanych schematach strzałki przerywane oznaczają fotony z lasera i OPO, a strzałki ciągłe oznaczają wynikający z nich sygnał. Ciągłe linie poziome reprezentują energię drgań Ramana i obrazują wizualnie, że w DR-CARS mieszanie tych samych 3 fotonów wejściowych pozwala na jednoczesne badanie dwóch różnych drgań Ramana.
<img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="Analiza obrazów spektroskopii CARS; obrazy surowe, znormalizowane i różnicowe; rezonanse CH, CD." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5: Typowe wyniki obrazowania nicieni C. elegans z wykorzystaniem DR-CARS i CARS. W górnym rzędzie wykorzystano trzy sygnały wskazane na Rysunku 4 do obrazowania nicienia w roztworze deuterowanej glukozy. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie uzyskano obrazy różnicowe poprzez odjęcie każdego z obrazów CARS od obrazu DR-CARS.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Spektroskopia Ramana oraz obrazowanie oparte na rozproszeniu Ramana to potężne, rozwijające się narzędzia w naukach biologicznych. Obecnie znajduje to szczególne zastosowanie w badaniach in vivo i in vitro metabolizmu komórkowego oraz zaburzeń metabolicznych w procesach przetwarzania i magazynowania lipidów. Większość biomakrocząsteczek zawiera dużą liczbę podobnych, głównie węglowych wiązań molekularnych, przez co widma Ramana otrzymywane z komórek i organizmów są zazwyczaj splotem sygnałów pochodzących z lipidów, białek, kwasów nukleinowych, cukrów itp. Lipidy są stosunkowo łatwe do wyodrębnienia z tych złożonych widm ze względu na ich tendencję do tworzenia gęstych kropel lub dwuwarstw oraz zawartość rozbudowanych łańcuchów z dużą liczbą alifatycznych wiązań CH. Możliwość wyizolowania konkretnych białek, aminokwasów, RNA lub DNA w złożonym środowisku komórkowym jest jednak bardzo ograniczona. Dotyczy to szczególnie sytuacji, gdy interesujące cząsteczki występują w stężeniach rzędu μM lub niższych. W tym kontekście możliwość badania słabych rezonansów Ramana z wykorzystaniem nowej techniki obrazowania różnicowego DR-CARS stanowi potencjalnie potężne podejście do ich mikroanalizy chemicznej i obrazowania. Należy przyznać, że najtrudniejszą częścią tego protokołu jest wyrównanie i synchronizacja systemu laserowego. Przy konfiguracji od podstaw synchronizacja impulsów, czyli zapewnienie ich nakładania się w czasie pomimo różnych dróg przejścia, może zostać ułatwiona dzięki zastosowaniu autokorelatora impulsów. Po osiągnięciu nakładania się przestrzennego i czasowego sygnały CARS i DR-CARS powinny być łatwo wykrywalne. Jednakże pierwsze wyrównanie jest często niedokładne, co skutkuje słabymi sygnałami. Najlepszą praktyką w celu precyzyjnego wyrównania tego systemu jest początkowe wygenerowanie słabych sygnałów, a następnie zwiększenie ich natężenia poprzez delikatne korygowanie luster na każdej z dróg i regulowanie nakładania się czasowego za pomocą stopni opóźnienia. Choć spektrometr/monochromator działa jako bardzo wydajna przesłona dla światła pokojowego, najczystsze wyniki można uzyskać, pracując przy wyłączonym świetle w pomieszczeniu i korzystając z zasłon lub tubusów na obiektywy, aby zminimalizować tło wprowadzane przez inne źródła światła (np. monitory komputerowe, lampki kontrolne, diody LED itp.). W naszej konfiguracji wykorzystujemy detektory lawinowe (APD) do zliczania pojedynczych fotonów oraz sprzęt do czasowo-skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) w celu detekcji 5. Pozwala nam to na wykrywanie niezwykle słabych sygnałów przy stosunkowo niskim poziomie szumów, jednak wiele grup uznało za korzystne zastosowanie fotopowielaczy (PMT) ze zmiennym wzmocnieniem podczas wykonywania podobnych pomiarów. Przewagą fotopowielaczy jest to, że oferują one zmienne wzmocnienie i posiadają znacznie większą powierzchnię detekcji, co może ułatwić ustawienie detektora. Dodatkowo w naszym układzie wykorzystujemy stoliki piezoelektryczne do przesuwania obiektywu w celu skanowania wiązki. Zaletą tego rozwiązania jest możliwość powrotu do dowolnego punktu w uprzednio zeskanowanym obrazie z wysoką dokładnością i wykonania dodatkowych pomiarów, w tym spontanicznych widm Ramana. Inne grupy z sukcesem stosowały zestawy luster skanujących, a nawet całe jednostki skanowania konfokalnego, takie jak system Olympus FluoView, który oferuje znacznie szybsze obrazowanie, ale ma ograniczone możliwości precyzyjnego powrotu do dowolnych lokalizacji w obrębie obrazu. Dostrojenie laserów tak, aby odpowiadały rezonansowi Ramana, jest również krytycznym krokiem, który może wymagać optymalizacji. Chociaż piki Ramana mogą być znane, maksymalna intensywność piku widmowego uzyskanego z DR-CARS i CARS niekoniecznie odpowiada maksimum piku spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego. Wynika to z wewnętrznej interferencji sygnałów generowanych przez mieszanie czterofalowe, co prowadzi do powstania nierozdzielonego sygnału tła i CARS, co zniekształca widma CARS w stosunku do widm spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego. Położenie widmowe maksimum sygnału CARS można obliczyć, jednak bardziej praktycznym podejściem jest dostrajanie OPO w kilku małych krokach widmowych w obrębie oczekiwanego położenia rezonansu Ramana. Proces ten powinien przynieść wyraźne maksimum. W rzeczywistości, dla uzyskania największej czułości DR-FWM oba rezonanse muszą być dostrojone do tego maksimum. Należy również omówić jeszcze jeden potencjalny problem podejścia DR-CARS, mianowicie fakt, że sygnał DR-CARS zależy od jednorodnego rozkładu aktywnej ramanowsko cząsteczki wzmacniającej. W przypadku większości obiektów biologicznych może to być szeroki rezonans grupy OH pochodzącej z wody, która występuje powszechnie i niemal wszędzie. Woda jest jednak wykluczona z regionów hydrofobowych w komórce, takich jak kropelki lipidowe, co prowadzi do zniekształcenia sygnałów otrzymywanych podczas wykorzystania rezonansu wody do wzmocnienia modów lipidowych. W naszym przykładzie zastosowaliśmy roztwór deuterowanej glukozy, aby wygenerować łatwo wykrywalny i obfity sygnał dla naszej próbki biologicznej. Podobnie można by zastosować deuterowaną wodę lub deuterowane bufory biologiczne, takie jak d-HEPES. W naszym przykładzie kropelki lipidowe wewnątrz nicieni C. elegans były na tyle małe, że w obszarze ogniskowania wiązki lasera naszego systemu zawsze znajdowały się zarówno roztwór deuterowanej glukozy, jak i lipidy. Nie jest to jednak prawdą w każdym przypadku. Szczególnym przykładem byłyby adipocyty, które tworzą w swojej cytoplazmie dość duże kropelki lipidowe. Oznacza to, że każdy eksperyment przeprowadzany techniką DR-CARS wymaga starannego przygotowania i przeprowadzenia doświadczeń kontrolnych w celu weryfikacji wyników.

<table><tbody><tr><td>obiektyw 60X z imersją wodną</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>Kryształ Pockelsa</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Picotrain Laser</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>Optyczny oscylator parametryczny</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1,5 szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Płytki półfalowe</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>Kostki polaryzacyjnego dzielnika wiązki</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 lub PBS053</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr/Monochromator</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda lawinowa</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>Stolik piezoelektryczny XYZ</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>Jest to połączenie stolika XY oraz uchwytu obiektywu Z.</td></tr><tr><td>Lustra dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>Wybór tych konkretnych filtrów dichroicznych nie jest krytyczny; wystarczy dowolny zestaw o odpowiednich charakterystykach transmisji i odbicia.</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>Aby połączyć różne wiązki laserowe w bliskiej podczerwieni</td></tr><tr><td>płyta TCSPC</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania Symphotime</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania ramanowskiego (cars)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Techniki obrazowania spójnego ramanowskiego odnotowały w ciągu ostatniej dekady gwałtowny wzrost aktywności ze względu na perspektywę umożliwienia bezznacznikowego obrazowania optycznego o wysokiej specyficzności molekularnej 1. Czułość tych technik jest jednak o wiele rzędów wielkości słabsza niż w przypadku fluorescencji, co wymaga mili-molarnych stężeń cząsteczek 1,2. W niniejszej pracy opisujemy technikę, która może umożliwić detekcję słabych lub niskich stężeń cząsteczek aktywnych ramanowsko poprzez wzmocnienie ich sygnału sygnałem uzyskanym z silnych lub obfitych rozpraszaczy ramanowskich. Oddziaływanie krótkich impulsów laserowych w próbce biologicznej generuje szereg sygnałów spójnego rozpraszania ramanowskiego, z których każdy niesie unikalne informacje chemiczne o próbce. Zazwyczaj tylko jeden z tych sygnałów, np. spójne rozpraszanie ramanowskie anty-Stokesa (CARS), jest wykorzystywany do generowania obrazu, podczas gdy pozostałe są odrzucane. Jednakże, gdy te inne sygnały, w tym 3-kolorowy CARS oraz mieszanie czterofalowe (FWM), są zbierane i porównywane z sygnałem CARS, można wyekstrahować informacje, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia 3. Na przykład dwukrotnie rezonansowy CARS (DR-CARS) jest wynikiem konstruktywnej interferencji dwóch sygnałów rezonansowych 4. Wykazujemy, w jaki sposób dostrojenie trzech laserów wymaganych do wytworzenia sygnałów DR-CARS do wibracji rozciągającej CH przy 2845 cm-1 w lipidach oraz wibracji rozciągającej CD przy 2120 cm-1 w cząsteczce deuterowanej (np. deuterowanych cukrach, kwasach tłuszczowych itp.) może zostać wykorzystane do jednoczesnego badania obu rezonansów ramanowskich. W tych warunkach, oprócz sygnałów CARS z każdego rezonansu, generowany jest również połączony sygnał DR-CARS badający oba rezonanse. Wykazujemy, że wykrywanie różnicy między sygnałem DR-CARS a sygnałem wzmacniającym z wibracji obfitej cząsteczki może służyć do zwiększenia czułości dla sygnału słabszego. Ponadto demonstrujemy, że podejście to rozciąga się nawet na zastosowania, w których oba sygnały są generowane przez różne cząsteczki, tak że np. wykorzystanie silnego sygnału ramanowskiego rozpuszczalnika może wzmocnić słaby sygnał ramanowski rozcieńczonej substancji rozpuszczonej.

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Techniki obrazowania spójnego rozpraszania Ramanowskiego zyskały w ciągu ostatniej dekady ogromną popularność ze względu na potencjał umożliwiający bezznacznikowe obrazowanie optyczne ...

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę obrazowania różnicowego dwóch rezonansów ramen związanych ze strukturami biologicznymi wykazującymi koherentne sygnały rozpraszania ramen. W pierwszej kolejności trzy zsynchronizowane lasery krótkopulsacyjne są nakładane w czasie i przestrzeni. Następnie nałożone impulsy są kierowane do standardowego mikroskopu odwróconego, co umożliwia generowanie koherentnych sygnałów ramen z obiektów mikroskopowych.Sygnały są konwertowane na obrazy przy użyciu komercyjnego oprogramowania w celu porównania różnych generowanych sygnałów ramanowskich. Wyniki wskazują, że różnica między obrazami uzyskanymi z podwójnie i pojedynczo rezonansowych sygnałów ramanowskich zapewnia zwiększoną czułość w przypadku słabych sygnałów ramanowskich. Cześć, jestem Tyler Weeks z Centrum Biofotoniki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.Nazywam się Thomas ER z Centrum Biofotoniki oraz Katedry Chorób Wewnętrznych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystania dwustronnie rezonansowego koherentnego rozpraszania Ramanowskiego anty-Stokesa (CARS) do tworzenia obrazów komórek o specyficzności chemicznej. Stosujemy tę procedurę w celu wykrywania sygnałów z cząsteczek, które są zbyt słabe, aby można je było wykryć bezpośrednio za pomocą samej koherentnej spektroskopii Ramanowskiej anty-Stokesa.Zacznijmy zatem. W celu jednoczesnego generowania sygnałów CARS i Dr CARS wymagane są trzy strojne i zsynchronizowane krótkopulsowe źródła laserowe. Aby uzyskać te zsynchronizowane impulsy, należy rozpocząć od pojedynczego lasera krótkopulsowego o mocy wyjściowej 10 W, stałej długości fali 1064 nm, stałym czasie trwania impulsu 7 ps oraz stałej częstotliwości repetycji 76 MHz.Za pomocą serii półfalowych płytek kwartowych oraz polaryzacyjnych kostek dzielących wiązkę, wiązka zostaje rozdzielona na trzy części. Płytka półfalowa w połączeniu z polaryzacyjną kostką dzielącą pozwala na regulację mocy każdej z komponentów wiązki bez zmiany jej kierunku. Zazwyczaj dwie wiązki są regulowane do mocy około 4.5 W każda, a trzecia wiązka zawiera pozostały 1 W.Dwie wiązki o wysokiej mocy są następnie kierowane do dwóch niezależnych optycznych oscylatorów parametrycznych (OPO). OPO wykorzystują proces generowania częstotliwości do przekształcenia fotonu o wysokiej energii w dwa fotony o niższej energii o różnych długościach fal. Poprzez kontrolę temperatury kryształu służącego do uzyskania tego efektu, długości fal otrzymanych fotonów mogą być kontrolowane z dokładnością do 0,1 nanometrów.Poprzez podwojenie częstotliwości tych sygnałów, laser o stałej długości fali 1064 nanometrów może zostać przekształcony w wiązkę laserową, której długość fali można dostrajać w zakresie od 780 nanometrów do 910 nanometrów, poprzez pompowanie dwóch oddzielnych OPO tym samym źródłem 1064 nanometrów. W ten sposób otrzymuje się dwa niezależnie strojone źródła laserowe, które są automatycznie zsynchronizowane z oryginalnym laserem pompowym. Trzecia wiązka z lasera pompowego 1064 nanometrów jest kierowana wokół OPO za pomocą kombinacji luster dielektrycznych, tak aby wszystkie trzy wiązki mogły zostać później ponownie połączone.Aby efektywnie generować koherentne fotony sygnału ramen, zrekonstruowane impulsy muszą nakładać się zarówno czasowo, jak i przestrzennie, ponieważ OPO zawierają wnęki pierścieniowe umożliwiające każdemu impulsowi laserowemu wielokrotne przejście przez kryształ; wiązka przesyłana przez OPO pokonuje dodatkową odległość, co skutkuje znacznym opóźnieniem w stosunku do pierwotnej wiązki pompy. Odległość tę należy skompensować za pomocą trzeciej wiązki poprzez wprowadzenie dodatkowych luster, które wymuszają przebycie przez nią takiej samej drogi jak przez dwie pozostałe przed ich połączeniem za pomocą luster dichroicznych, co pozwala na precyzyjną regulację długości ścieżki. Każda wiązka jest kierowana przez regulowane stopnie opóźniające, które umożliwiają dostrojenie czasowego nakładania się poszczególnych impulsów laserowych.Do każdej wiązki dodaje się kolejny zestaw płytek półfalowych i polaryzacyjnych kostek dzielących wiązkę, aby umożliwić niezależną regulację mocy lasera dla każdej z nich. Do wstępnego połączenia wiązek z dwóch OPO, a następnie z wiązką o długości 1064 nanometrów, wykorzystuje się lustra dichroiczne; należy przy tym zadbać o precyzyjne pokrycie się wiązek w przestrzeni. Można to zweryfikować, porównując stopień pokrycia wiązek w odległości kilku centymetrów od lustra dichroicznego z ich pokryciem w odległości około jednego metra od tego lustra.Ponieważ ekspozycja na wiązki laserowe o wysokiej mocy średniej może uszkodzić próbkę, trzy połączone wiązki są kierowane przez elektrooptyczny modulator działający jako selektor impulsów, który umożliwia regulację częstotliwości powtarzania impulsów docierających do próbki, a tym samym kontrolę mocy średniej. Połączone wiązki laserowe są następnie wprowadzane do mikroskopu odwróconego z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej lub na. Silna ogniskowość generowana przez obiektyw o wysokim NA umożliwia najefektywniejsze generowanie koherentnych sygnałów ramen w skalach mikroskopowych.Obiektyw mikroskopu jest zamontowany na piezoelektrycznym stole X, Y, Z, co umożliwia uzyskiwanie obrazów poprzez rastrowanie wiązek po próbce, podobnie jak w komercyjnych konfokalnych mikroskopach skanujących. Przejdźmy teraz do sposobu generowania sygnałów CARS i DRFWM. Oddziaływanie trzech krótkich impulsów wiązek laserowych w próbce prowadzi do powstania kilku sygnałów mieszania czterofalowego, takich jak CARS z różnych kombinacji dwóch laserów, a także sygnałów trójkolorowych CARS i DR CARS z kombinacji wszystkich trzech laserów. Gdy sygnały mają zbliżoną długość fali, ich oddzielenie w celu przeprowadzenia analizy może być utrudnione.Z tego powodu sygnały są przekazywane do spektrometru obrazującego, który służy również jako monochromator lub filtr pasmowy w celu przestrzennego rozdzielenia sygnałów o różnych długościach fal. Elektronicznie sterowane lustro odchylające wewnątrz spektrometru w pozycji opuszczonej kieruje sygnał do kamery CCD (charge coupled device) z głębokim ubytkiem nośników i podświetleniem tylnym, która dostarcza informacji spektroskopowych w całym zakresie sygnału oraz pozwala na identyfikację i optymalizację różnych spójnych sygnałów robin w celu wybrania sygnału do obrazowania. Wystarczy obrócić siatkę wewnątrz spektrometru, korzystając z dostarczonego przez producenta oprogramowania sterującego i akwizycji danych, aby wycentrować interesujący nas pik na kamerze CCD.Następnie zmień położenie lustra odchylającego, aby przekierować sygnał do drugiego portu wyjściowego, do którego podłączona jest lawinowa fotodioda zliczająca pojedyncze fotony (APD) lub fotodioda (PD). Wykonaj skanowanie rastrowe obiektywu, a następnie wykorzystaj sygnały zarejestrowane na APD do wygenerowania obrazu poprzez wyświetlenie szybkości zliczania fotonów dla każdego piksela za pomocą oprogramowania do akwizycji danych. Powtórz tę procedurę obrazowania dla każdego pożądanego spójnego sygnału ramen, aby umożliwić porównanie sygnałów podczas postprocesingu.Przejdźmy teraz do omówienia prawidłowego przygotowania próbki w celu uzyskania wyraźnych i powtarzalnych obrazów. Przygotowanie próbek wymaga zachowania pewnej staranności. Próbki przygotowuje się zazwyczaj na szklanych lamellkach o grubości około 150 micron.Szkiełka zakrywkowe te są wystarczająco cienkie, aby umożliwić obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z użyciem obiektywów imersyjnych wodnych lub olejowych o wysokiej aperturze numerycznej (NA), które są wykorzystywane w tych eksperymentach. Aby zademonstrować przygotowanie typowej próbki, przygotowujemy przekroje tkanki mięśniowej myszy o grubości około 20 μm, które są przymocowane do szkiełka przedmiotowego. Do próbki dodaje się 20 µL kropli 5 M roztworu glukozy deuterowanej.Roztwór glukozy deuterowanej zapewnia unikalny i silny sygnał tła ramanowskiego. Na wierzchu próbki umieszcza się szklaną lamellkę, którą następnie utrwala się lakierem do paznokci w przypadku komórek i hodowli. Można stosować naczynia hodowlane z szklanym dnem, które umożliwiają obrazowanie bez konieczności odrywania komórek od naczyń wzrostowych.Przejdźmy teraz do ustalenia odpowiednich linii Ramanowskich i pików dla tej konfiguracji. Aby w pełni wykorzystać efekt wzmocnienia podwójnego rezonansu, należy znać widma Ramanowskie obu substancji rezonansowych. Typowo są to 2845 cm⁻¹ przypisane lipidom oraz 2121 cm⁻¹ dla modu rozciągającego CD związanego z deuterowaną glukozą.Koherentne rozpraszanie Ramana uzyskuje się, gdy różnica częstotliwości między dwoma laserami odpowiada częstotliwości drgań cząsteczkowych. Poprzez nastrojenie jednego OPO do 817 nanometrów, w połączeniu z wiązką lasera o długości 1064 nanometrów, będzie on badać mod C o częstotliwości 2 845 cm⁻¹, a nastrojenie drugiego OPO do 868 nanometrów pozwoli na badanie częstotliwości 2 121 cm⁻¹ w połączeniu z wiązką 1064 nanometrów. W trybie spektroskopowym mikroskop CARS umożliwia obserwację trzech interesujących sygnałów CARS: sygnału CARS badającego drgania rozciągające CH, sygnału CARS badającego mod rozciągający CD oraz sygnału DR CARS badającego oba powyższe; na przedstawionym schemacie przerywane strzałki oznaczają fotony z lasera w OPO, a strzałki ciągłe oznaczają wynikający z nich sygnał.Pełne poziome linie wskazują energię wibracji ramanowskiej i stanowią wizualną reprezentację tego, że w przypadku DR carów mieszanie tych samych trzech fotonów wejściowych pozwala na jednoczesne badanie dwóch różnych wibracji ramanowskich. Natężenie sygnału dla każdego piku będzie wymagało optymalizacji poprzez dostrajanie w małych krokach wokół lokalizacji tych pików. Tutaj wybieramy każdy pik i wykonujemy obrazy nicieni morskich w roztworze glukozy o obniżonym stężeniu; wyodrębnienie dodatkowych informacji na podstawie tych trzech obrazów uzyskanych indywidualnie wymaga dość prostego przetwarzania obrazów.W pierwszej kolejności należy znormalizować obrazy. Praktyczna metoda normalizacji opiera się na fakcie, że lipidy są hydrofobowe. Oznacza to, że w obszarach o wysokiej gęstości lipidów rezonans CD glukozy powinien w niewielkim stopniu przyczyniać się do sygnału podwójnego rezonansu.Z drugiej strony, w obszarach czystego roztworu glukozy rezonanse CH z lipidów również powinny wnosić bardzo niewielki wkład. Mając to na uwadze, znormalizuj obraz DR car oraz obraz car uzyskany przy rezonansie CD roztworu glukozy deuterowanej do obszaru znajdującego się wyraźnie poza robakiem CL egan, który nie powinien wykazywać rezonansu CH. Następnie zidentyfikuj w obrazie car rezonansu CH obszar w obrębie robaka, który jest bogaty w lipidy, i znormalizuj go do odpowiadającego mu obszaru w znormalizowanym obrazie DR car.Aby ta metoda działała prawidłowo, należy przyjąć, że w głębi tego obszaru nie występuje glukoza deuterowana. Jest to założenie bezpieczne, ponieważ lipidy są hydrofobowe i nie zmieszają się z roztworem. Teraz, poprzez odjęcie znormalizowanego obrazu car dla rezonansu CH od znormalizowanego obrazu car dla rezonansu DR, pozostaje jedynie wzmocniony sygnał rezonansowy CD; analogicznie postępując, odejmuje się znormalizowany obraz car dla rezonansu CD od znormalizowanego obrazu Dr.FWM.Pozostaje jedynie wzmocniony sygnał rezonansowy CH. Przedstawione tutaj jest widmo ramen zmodyfikowanego kwasu oleinowego zawierającego modyfikację alkinową; silne rezonanse CH przy 2 845 cm⁻¹ oraz rezonans alkinowy przy 2 121 cm⁻¹ są dobrze odizolowane od regionu odcisków palców, czyli obszaru gęsto rozmieszczonych pików, co czyni je idealnymi markerami dla obrazowania koherentnego ramen. Jest to typowe widmo sygnałów koherentnego ramen generowanych, gdy trzy krótkie impulsy laserowe nakładają się w próbce. Strzałki wskazują procesy odpowiedzialne za każdy sygnał, przedstawione na schematach energetycznych.Są to typowe wyniki obrazowania nicieni C. Elgina z wykorzystaniem CAR i DR CAR. W górnym rzędzie wykorzystano trzy przedstawione właśnie sygnały do obrazowania nicienia w roztworze glukozy o obniżonym stężeniu. W drugim rzędzie obrazy zostały odpowiednio znormalizowane, a w trzecim rzędzie powstały obrazy różnicowe poprzez odjęcie każdego z obrazów CAR od obrazu DR CAR. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykonywania obrazowania różnicowego Ramana w oparciu o dwukrotnie rezonansową koherentną spektroskopię anty Stokesa.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że ważne jest upewnienie się, iż wiązki nakładają się na siebie i są odpowiednio zsynchronizowane. Ponadto podczas przełączania między różnymi sygnałami koherentnymi należy uważać, aby nie potrącić ani nie przesunąć próbki, ponieważ wpłynie to na analizę. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie różnicowe struktur biologicznych za pomocą podwójnie rezonansowego spójnego rozproszenia Ramana Anti-Stokes (CARS)

Źródło: McCullagh, E. A., et al. Koherentna spektroskopia Ramana Antystokesa (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne i koherentną spektroskopię Ramana antystokesa (CARS) w celu wizualizacji architektury neuronalnej w tkance mózgowej gryzoni. Barwienie Nissl znakuje ciała komórkowe poprzez wiązanie się z rybosomalnym RNA, podczas gdy obrazowanie CARS celuje w mielinę bogatą w lipidy za pomocą sygnałów indukowanych...

Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Mikroskopia CARS (Coherent anti-Stokes Raman scattering) jest połączona z wewnętrznym układem rozpuszczania przepływowego, aby umożliwić wizualizację in situ i w czasie rzeczywistym powierzchni tabletek farmaceutycznych ulegających rozkładowi. Korzystając z tej niestandardowej konfiguracji, możliwe jest skorelowanie filmów CARS z profilami rozpuszczania leków zarejestrowanymi za pomocą wbudowanej spektroskopii absorpcyjnej UV.

Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Poznaj metodę obrazowania różnicowego CARS i DR-CARS w biologii komórki przy użyciu trzech zsynchronizowanych laserów impulsowych. Technika ta zwiększa czułość detekcji słabych sygnałów Ramana.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Przeglądaj więcej filmów